专利名称：不含目标蛋白质人血清基体物质的制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种主要用于医学检验的不含目标蛋白质人血清基体物质的制备方法，属于医学检验的标准物质制备技术领域。
背景技术：
标准物质是指具有一种或多种足够均匀和很好确定了的特性值，用来校准设备、评价测量方法或给材料赋值的材料和物质。标准物质研制的发展趋势包括两个方向其一为传统领域到生物、临床等新兴领域；其二为高纯与复杂基体的两极发展。
蛋白质类标准物质是生物、临床等领域中重要的标准物质，我国的标准物质研究中心目前没有适用于医学检验用蛋白质类标准物质。国内临床检验中习惯使用纯分析物质配制于纯溶剂(如水)后形成的标准或参考液，以这样的标准液为标准，求得各标本的分析结果。这样的做法忽视了标本和标准处于完全不同的基体状态所产生的基体效应(matrixeffect)。
分析样品中除了目标分析物以外的所有其他物质和组分称为该分析物的基体，基体(matrix)亦称为基质。基体效应是检测系统检测标本中的目标分析物时，处于目标分析物周围的所有非分析物质(基体)对分析物参与反应的影响。临床实验室测定血液标本中各种蛋白质含量时，所用标准物质的基体应当是除目标蛋白以外的人血清物质，但目前并非如此。制备不含目标蛋白质的血清基体物质是研制目标蛋白质标准物质的基础。
据文献报道临床检验溯源用蛋白质类标准物质的制备方法如下得到高纯度的目标产物后，添加40％左右的牛血清白蛋白或人血清白蛋白以及其他血清类物质，总之使目标蛋白质的存在基质类似于人血清的成分。但是人血清是一种很复杂的混合物，其成份可能有几百种之多，目前对其准确的成份、含量及作用机制仍不清楚，尤其对于多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识。因此添加物不能代表真正的血清内含物。研制尽可能与人类血清成分一致的基体物质，降低临床用标准物质的基体效应是临床检测结果准确性的必要保证。
发明内容
本发明的目的在于研制用于制备标准物质的、与血清成分基本一致的不含目标蛋白质人血清基体物质的制备方法；使目标蛋白质标准物质的基体尽量与实际检测标本的基体一致，降低由标准物质与实际检测标本基体不一致产生的基体效应。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，它是依据免疫学反应原理和目标蛋白质在血清中的含量，使一定量结合于不同介质上的抗目标蛋白质的多或单克隆抗体与人血清中的目标蛋白质反应，形成抗原抗体复合物后，通过不同的方法去除含目标蛋白质及其抗体的免疫复合物，从而得到不含目标蛋白质人血清基体物质。
当所述目标蛋白质在血清中含量大于300mg/L时，将该目标蛋白质相应的抗体用双功能试剂交联，使之成为可以与目标蛋白质反应的特异性固体免疫介质，与人血清中的目标蛋白质反应后除去目标蛋白质；当所述的目标蛋白质在血清中含量小于300mg/1L的时候，选取该目标蛋白质相应的抗体与功能化的磁珠偶联形成免疫磁珠，再与人血清中的目标蛋白质反应后除去目标蛋白质。
当目标蛋白质含量大于300mg/L时，选用该蛋白质的特异性固体免疫介质以1∶60～1∶10比例加入至正常人混合血清中，置于磁力搅拌器上，4℃反应，过夜，以10000转/分钟的转速离心；检测离心上清，直至不含目标蛋白质，并保持白蛋白与球蛋白的正常比例；此离心上清为不含目标蛋白质的人血清基体物质。
当目标蛋白质含量为300mg/L以下时，选用目标蛋白质的抗体与功能化的磁珠偶联，制备含抗目标蛋白质抗体的免疫磁珠；将以上免疫磁珠以1∶40～1∶100比例投入正常人混合血清中，置于一定转速的摇床上，37℃反应1～2小时，4℃冰箱放置1～4小时，将反应混合物置于磁场中，使含目标蛋白质及其抗体的免疫磁珠与人血清分离，将血清再以10000转/分钟的转速离心，检测离心上清，直至不含目标蛋白，并保持白蛋白与球蛋白的正常比例；此离心上清为不含目标蛋白质的人血清基体物质。
本发明利用免疫学原理，根据目标蛋白质在正常人血清中的含量，选用不同的方法，得到不含目标蛋白质的人血清基体物质；它能使标准物质制备用基体物质尽量与实际检测标本的基体物质一致，降低由标准物质与实际检测标本在测试中由于基体物质不一致产生的基体效应，确保检测结果的准确。
具体实施例方式
下面将结合具体实施例对本发明作详细的介绍1.正常人混合血清分析取若干正常人混合血清，离心后分析血清的理化性质如血清黏度、pH值、蛋白含量等。其中蛋白含量分析包括血清总蛋白(双缩脲法)、白蛋白(溴甲酚绿法)、球蛋白(按照常规方法，总蛋白与白蛋白的差值)、常见的特种蛋白例如转铁蛋白、前白蛋白、免疫球蛋白A/G/M、补体C3/C4以及目标蛋白质等(免疫比浊法分析)。分析仪器为全自动生化分析仪(日立7080型)。
2.含目标蛋白质特异性抗体的固体免疫介质以及免疫磁珠的制备2.1固体免疫介质的制备将一定量的抗目标蛋白质的抗体与2.5％戊二醛溶液混合，放置于冰箱过夜，使血清成为胶冻状，打碎后用生理盐水洗涤，成为颗粒状的可以与目标蛋白质反应的固体免疫介质。
2.2免疫磁珠的制备主要包括以下步骤用缓冲液对纳米磁珠进行预处理；用碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化磁珠；随后将磁珠与目标蛋白质的特异性抗体偶联结合，成为含有目标蛋白质特异性抗体的免疫磁珠；用硼酸盐缓冲液纯化免疫磁珠。(详细的方法本课题组已申请专利，专利申请号为200610053305.4)。
3.不含目标蛋白质的血清基体物质研制以一定量附于不同免疫介质上的目标蛋白质抗体与人血清中目标蛋白质反应，形成免疫复合物后，通过去除含有目的蛋白质和其特异性抗体的免疫复合物，达到去除目标蛋白质的目的。
3.1目标蛋白质在血清中含量大于300mg/L时，血清基体物质研制选用含目标蛋白质抗体的固体免疫介质以1∶60～1∶1比例加至正常人混合血清中，置于磁力搅拌器上，4℃反应，过夜，以10000转/分钟的转速离心；检测离心上清中的目标蛋白质，如果仍然含有目标蛋白质，可以添加免疫介质进一步反应，直至不含目标蛋白质。
3.2目标蛋白质在血清中含量小于200mg/L以下时，血清基体物质研制选用含目标蛋白质抗体的免疫磁珠，将以上免疫磁珠以1∶40～1∶1000比例投入正常人混合血清中，置于一定转速的摇床上，37℃反应1～2小时，4℃冰箱放置1～4小时，将反应混合物置于磁场中，使含目标蛋白质及其抗体的免疫磁珠与人血清分离，将血清再以10000转/分钟的转速离心，检测离心上清中的目标蛋白质，如果仍然含有目标蛋白质，可以添加免疫介质进一步反应，直至不含目标蛋白质。
4.已处理血清成分分析分析以上物质的理化性质，具体内容和方法与正常人混合血清分析一致。
5.已处理血清成分补充根据以上测定的结果添加被减少的蛋白质，使之与原血清成分基本一致，并保持白蛋白与球蛋白的正常比例。此物质为不含目标蛋白质的人血清基体物质。
6.基体物质确证试验利用添加回收(recovery)实验对不含目标蛋白质的血清基体物质的研制结果进行确证。回收率达到95～105％，说明已经得到不含目标蛋白质的人血清基体物质。
实施举例一不含载脂蛋白B(apoB)的人血清基体物质的制备(apoB在血清中含量为500～1100mg/L)1.正常人血清分析取1ml正常人混合血清，离心后分析血清的黏度、pH值、血清总蛋白、白蛋白、球蛋白、常见特种蛋白如转铁蛋白、前白蛋白、免疫球蛋白A/G/M、补体C3/C4以及目标蛋白质载脂蛋白B等。
2.不含载脂蛋白B(apoB)血清基体物质研制选用含有载脂蛋白B抗体的固体免疫介质1g，加入至30ml正常人混合血清中，置于磁力搅拌器上，4℃反应，过夜，以10000转/分钟的转速离心；检测离心上清中的载脂蛋白B，如果仍然含有载脂蛋白B，可以添加免疫介质进一步反应，直至不含载脂蛋白B。
3.已处理血清成分分析分析以上已处理血清物质的理化性质，具体内容和方法与正常人混合血清分析一致。
4.已处理血清成分补充通过测定分析发现血清的黏度、pH值以及所测特种蛋白如转铁蛋白、前白蛋白、免疫球蛋白A/G/M、补体C3/C4的含量基本保持不变，目标蛋白质载脂蛋白B含量为零，血清总蛋白、白蛋白含量稍有降低，血清成分和基体物质具体测试结果见下表。根据总蛋白含量，以及减少的白蛋白含量，补充加入0.9g白蛋白。保持总蛋白与原来血清中总蛋白含量一致，同时也保证了白蛋白/球蛋白的比例在正常范围内。此物质为不含目标蛋白质的人血清基体物质。完成不含目标蛋白质的人血清基体物质研制的基本程序。
5.基体物质确证试验利用回收(recovery)实验对不含目标蛋白质的血清基质物质的研制结果进行确证。将一定浓度纯化的载脂蛋白B(apoB)抗原、基体物质、以及纯化的载脂蛋白B(apoB)抗原与基体物质的混合物作为检测标本；以以载脂蛋白B(apoB)羊抗人多克隆抗体和4％聚乙二醇-磷酸缓冲液配制的单试剂，测定波长为340nm，测试参数为3ul标本/300ul剂。紫外分光光度计测定以上样品的吸光度，每个样品测定5次，并以其平均值计算回收率。
回收率计算公式
x1基体物质平均吸光度x2添加物与基体物质平均吸光度x添加物的平均吸光度本实验回收率＝98.7％实施举例二不含B因子(Factor B)的人血清基体物质的制备(Factor B在血清中含量为l40～280mg/L)1.正常人血清分析取1ml正常人混合血清，离心后分析血清的黏度、pH值、血清总蛋白、白蛋白、球蛋白、常见特种蛋白如转铁蛋白、前白蛋白、免疫球蛋白A/G/M、补体C3/C4以及目标蛋白质B因子等。
2.不含B因子(Factor B)血清基体物质研制选用含有B因子抗体的特异性免疫磁珠100ul，加入至20ml正常人混合血清中，置于一定转速的摇床上，37℃反应1～2小时，4℃冰箱放置1～4小时，将反应混合物置于磁场中，使含目标蛋白质B因子及其抗体的免疫磁珠与人血清分离，将血清再以10000转/分钟的转速离心，检测离心上清中的B因子，如果仍然含有B因子，可以添加免疫磁珠进一步反应，直至不含B因子。
3.已处理血清成分分析分析以上已处理血清物质的理化性质，具体内容和方法与正常人混合血清分析一致。
4.已处理血清成分补充通过测定分析发现血清的黏度、pH值以及所测特种蛋白如转铁蛋白、前白蛋白、免疫球蛋白A/G/M、补体C3/C4的含量基本保持不变，目标蛋白质B因子含量为零，血清总蛋白、白蛋白含量稍有降低，血清成分和基体物质具体测试结果见下表。根据总蛋白含量，以及减少的白蛋白含量，补充加入0.3g白蛋白。保持总蛋白与原来血清中总蛋白含量一致，同时也保证了白蛋白/球蛋白的比例在正常范围内。此物质为不含目标蛋白质B因子的人血清基体物质。完成不含目标蛋白质的人血清基体物质研制的基本程序。
5.基体物质确证试验利用回收(recovery)实验对不含目标蛋白质B因子的血清基质物质的研制结果进行确证。将一定浓度的纯化的B因子(Factor B)抗原、基体物质、以及纯化的B因子(Factor B)抗原与基体物质的混合物作为检测标本；以B因子(FactorB)羊抗人多克隆抗体和4％聚乙二醇-磷酸缓冲液配制的单试剂，测定波长为340nm，测试参数为6ul标本/300ul试剂。紫外分光光度计测定以上样品的吸光度，每个样品测定5次，并以其平均值计算回收率。
回收率计算公式 x1基体物质平均吸光度x2添加物与基体物质平均吸光度x添加物的平均吸光度本实验回收率＝97.9％。
权利要求
1.一种不含目标蛋白质人血清基体物质的制备方法，它是依据免疫学反应原理和目标蛋白质在血清中的含量，使一定量结合于不同介质上的抗目标蛋白质的多或单克隆抗体与人血清中的目标蛋白质反应，形成抗原抗体复合物后，通过不同的方法去除含目标蛋白质及其抗体的免疫复合物，从而得到不含目标蛋白质人血清基体物质。
2.根据权利要求1所述的不含目标蛋白质人血清基体物质的制备方法，其特征在于当所述目标蛋白质在血清中含量大于300mg/L时，将该目标蛋白质相应的抗体用双功能试剂交联，使之成为可以与目标蛋白质反应的特异性固体免疫介质，与人血清中的目标蛋白质反应后除去目标蛋白质；当所述的目标蛋白质在血清中含量小于300mg/L的时候，选取该目标蛋白质相应的抗体与功能化的磁珠偶联形成免疫磁珠，再与人血清中的目标蛋白质反应后除去目标蛋白质。
3.根据权利要求2所述的不含目标蛋白质人血清基体物质的制备方法，其特征在于当目标蛋白质含量大于300mg/L时，选用该蛋白质的特异性固体免疫介质以1∶60～1∶10比例加入至正常人混合血清中，置于磁力搅拌器上，4℃反应，过夜，以10000转/分钟的转速离心；检测离心上清，直至不含目标蛋白质，并保持白蛋白与球蛋白的正常比例；此离心上清为不含目标蛋白质的人血清基体物质。
4.根据权利要求2所述的不含目标蛋白质人血清基体物质的制备方法，其特征在于当目标蛋白质含量为300mg/L以下时，选用目标蛋白质的抗体与功能化的磁珠偶联，制备含抗目标蛋白质抗体的免疫磁珠；将以上免疫磁珠以1∶40～1∶100比例投入正常人混合血清中，置于一定转速的摇床上，37℃反应1～2小时，4℃冰箱放置1～4小时，将反应混合物置于磁场中，使含目标蛋白质及其抗体的免疫磁珠与人血清分离，将血清再以10000转/分钟的转速离心，检测离心上清，直至不含目标蛋白，并保持白蛋白与球蛋白的正常比例；此离心上清为不含目标蛋白质的人血清基体物质。
全文摘要
一种不含目标蛋白质人血清基体物质的制备方法，它是依据免疫学反应原理和目标蛋白质在血清中的含量，使一定量结合于不同介质上的抗目标蛋白质的多或单克隆抗体与人血清中的目标蛋白质反应，形成抗原抗体复合物后，通过不同的方法去除含目标蛋白质及其抗体的免疫复合物，从而得到不含目标蛋白质人血清基体物质，它能使标准物质制备用基体物质尽量与实际检测标本的基体物质一致，降低由标准物质与实际检测标本在测试中由于基体物质不一致产生的基体效应，确保检测结果的准确。
文档编号G01N33/68GK101046479SQ200710067299
公开日2007年10月3日 申请日期2007年2月25日 优先权日2007年2月25日
发明者胡卫江, 周海梦, 孟凡国, 李海龙 申请人:清华大学, 浙江清华长三角研究院
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