抗福美双单克隆抗体和快速检测福美双的试纸及其应用的制作方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：：抗福美双单克隆抗体和快速检测福美双的试纸及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于农药检测领域，利用免疫化学技术快速检测残留的农药，具体地，本发明涉及一种杂交瘤细胞株，以及所述杂交瘤细胞株产生的抗福美双单克隆抗体。本发明还涉及一种检测福美双的组合物、一种检测福美双的试纸、所述试纸的制备方法、一种检测福美双的酶联免疫试剂、以及所述抗福美双单克隆抗体在检测福美双中的应用。
背景技术：
：福美双(Thiram)，CAS登记号为137_26_8化学名称为四甲基秋兰姆二硫化物，属硫代氨基甲酸酯类农药，是一种具有保护作用的杀菌剂，其抗菌谱广，可处理种子和土壤，防治禾谷类黑穗病和多种作物的苗期立枯病，喷洒后可防治一些果树，蔬菜病害。目前对食品中福美双残留常用的检测方法主要为色谱分析方法，如高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、以及色质谱联用法(HPLC-MS-MS和GC-MS)。色谱技术对福美双检测是非常有效、准确和灵敏的，但也存在如下缺点(1)样品预处理需要衍生化，程序繁琐费时；(2)需要专业的技术人员操作，操作人员要有丰富的相关经验，必须了解影响色谱分析的各种干扰因素，了解所使用的预处理方法的优缺点，才能获得可靠的分析结果；(3)需要昂贵的仪器设备辅助，难以在中小城市以及中小企业中普及；(4)仪器维护和保养的技术要求高。保养是否得当，会直接影响分析结果的准确性；(5)检测费用高。本发明制备了抗福美双单克隆抗体，并应用该抗体制备一种特异性强、灵敏度高、操作简便、能够快速准确地检测福美双的试纸，以克服现有技术存在的缺陷。
发明内容本发明的一个方面涉及一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCCNo.3580，保藏日期2010年1月13日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，该杂交瘤细胞株建议的分类命名为BALA/C小鼠抗-福美双单克隆抗体骨髓瘤杂交细胞。本发明的另一个方面涉及一种抗福美双单克隆抗体，其由保藏编号为CGMCCNo.3580的杂交瘤细胞株产生。该抗福美双单克隆抗体具有很好的特异性。本发明的还一个方面涉及一种检测福美双的组合物，其中含有上述的抗福美双单克隆抗体。本发明的还一方面涉及一种检测福美双的试纸，其含有有效量的上述的抗福美双单克隆抗体。所述抗体可以以多种方式标记，例如荧光标记。优选地，所述抗福美双单克隆抗体用胶体金标记。在本发明的一个实施方案中，所述试纸具有福美双-载体蛋白偶联物构成的检测线，优选地，所述试纸还具有抗鼠IgG抗体构成的质控线。在本发明中，所述检测线为福美双-载体蛋白偶联物形成的条带，所述质控线为抗鼠IgG包被形成的条带，这两个条带的宽度并不特别限定。检测线和质控线的距离并不特别限定，优选5-8mm。在本发明的一个实施方案中，所述试纸包括样品垫(1)、结合垫(2)、蛋白结合膜(3)、吸水垫(4)和背衬(7)，并且所述样品垫(1)、结合垫(2)、蛋白结合膜(3)、吸水垫(4)沿水平方向依次粘附在背衬(7)上(如图2所示)；其特征在于，所述结合垫(2)上包被有上述的抗福美双单克隆抗体，所述抗福美双单克隆抗体用胶体金标记；所述蛋白结合膜(3)上分别包被有福美双-载体蛋白偶联物构成的检测线(5)和抗鼠IgG抗体构成的质控线(6)。优选地，所述检测线(5)与质控线(6)的间距为5-8mm。在本发明中，所述蛋白结合膜的作用为结合包被的蛋白(例如，福美双-载体蛋白偶联物或者抗体)，然后包被的蛋白与待检测物质反应，因此可以选用具有该作用的任何材料，包括但不限于硝酸纤维素膜、PVDF膜等。优选地，蛋白结合膜为硝酸纤维素膜。在本发明中，所述载体蛋白为能够与福美双偶联的任何蛋白，包括但是不限于人血清白蛋白、牛血清白蛋白、或卵清蛋白。优选地，载体蛋白为牛血清白蛋白。在本发明中，所述背衬可以选用多种起支持作用的材料，例如，其可以是PVC背衬。本发明选用福美双-载体蛋白偶联物作为检测线，抗福美双特异性单克隆抗体作为胶体金标记的抗体，利用竞争法来检测待测样品中是否含有福美双，通过待测样品中的福美双与包被于蛋白结合膜上的福美双-载体蛋白偶联物共同竞争抗福美双单克隆抗体-胶体金标记物，由于胶体金颗粒的不同程度的堆积，在检测线处出现颜色深浅不同的红色条带或不出现条带，质控线处出现红色条带。若待测样品试纸检测不出现条带，同时质控线上出现红色条带则判断为阳性样品，即待测样品中福美双的浓度高于500ppb；若待测样品试纸检测出现了红色条带，同时质控线上出现红色条带则判断待测样品中福美双的浓度低于500ppb；如果质控线上没有出现红色条带，则该试纸无效(如图3所示)。本发明的总体技术路线图如图1所示。上述试纸的制备方法，包括如下步骤1)将福美双与载体蛋白偶联，形成福美双-载体蛋白偶联物；2)用福美双-载体蛋白偶联物作为抗原制备上述的抗福美双单克隆抗体；3)制备抗鼠IgG抗体；4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；5)将步骤2)中制备的抗福美双单克隆抗体加入步骤4)制备的胶体金中，得到抗福美双单克隆抗体_胶体金标记物；6)将抗福美双单克隆抗体_胶体金标记物包被在结合垫(2)上；7)将福美双-载体蛋白偶联物包被在蛋白结合膜(3)上构成检测线(5)；并将抗鼠IgG包被在蛋白结合膜(3)上构成质控线(6)；8)在所述的PVC背衬(7)上沿水平方向依次粘附样品垫⑴、结合垫(2)、蛋白结合膜(3)、吸水垫(4)。在本发明中，所述蛋白结合膜的作用为结合包被的蛋白(例如，福美双-载体蛋白偶联物或者抗体)，然后让包被的蛋白与待检测物质反应，因此可以选用具有该作用的任何材料，包括但不限于硝酸纤维素膜、PVDF膜等。优选地，蛋白结合膜为硝酸纤维素膜。在本发明中，所述载体蛋白为能够与福美双偶联的任何蛋白，包括但是不限于人血清白蛋白、牛血清白蛋白、或卵清蛋白。优选地，载体蛋白为牛血清白蛋白。在本发明中，所述背衬可以选用多种起支持作用的材料，例如，其可以是PVC背衬。在本发明的一个实施方案中，步骤3)中的所述抗鼠IgG抗体为兔抗鼠IgG抗体。本发明的还一方面涉及一种检测福美双的酶联免疫试剂，其本发明的抗福美双单克隆抗体作为第一抗体。本发明的还一方面涉及抗福美双单克隆抗体在检测福美双中的应用。本发明的还一方面涉及抗福美双单克隆抗体在检测蔬菜或水果中的福美双中的应用。发明的有益效果与现有技术相比，本发明具有以下突出优点1.本发明的抗福美双单克隆抗体具有很好的特异性和灵敏度。2.本发明的检测福美双的免疫胶体金试纸，特异性强，灵敏度高，特别是检测时间短，大约为20分钟，而现有色谱检测至少需要2个小时以上。3.本发明的检测试纸不需要任何特殊仪器、设备，检测成本低。4.本发明的检测试纸操作简便，不需由专业人员进行操作。5.本发明的检测试纸储存方便、稳定，对温度要求不高，在4_8°C下有效保存期可达一年；在室温下可保存六个月。图1本发明技术路线图。图2本发明的检测试纸的示意图。其中1为样品垫，2为结合垫，3为蛋白结合膜，4为吸收垫，5为检测线，6为质控线，7为背衬。图3本发明检测试纸结果判定的示意图。A为阴性结果，上方的线为质控线，下方的线为检测线，两条线均出现红色条带；B为阳性结果，只有质控线出现红色条带；C、D均为试纸失效，质控线均未出现红色条带。具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1检测福美双的免疫胶体金试纸的制备1、福美双_载体蛋白偶联物的制备1)称取40mg福美双溶于含有0.02%Tween-20的20mMPBS溶液中，配制成福美双溶液。2)冰水浴且磁力搅拌下，将福美双溶液逐滴加到2.4mlImol/lHCl中，进行重氮化(ItaruY,KohjiI.Enzymeimmunoassayforclenbuteol,an^2-adrnergicstimulant[J].Journalofimmunoassay,1982,3(2):155-171)反应，力口完后继续反应5min。3)磁力搅拌下，将重氮化产物分别逐滴加到人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(0VA)溶液中，用llmol/lNaOH调PH值到9.5，4°C缓慢搅拌过夜，得到三种连接产物，即福美双-HSA、福美双-BSA、福美双-0VA。4)将步骤3)得到的连接产物福美双-HSA、福美双-BSA、福美双-0VA分贝装入透析袋，用0.01MPH7.4的磷酸盐缓冲液(配方:NaCl8g，KC10.2g，Na2HP0412H202.9g，KH2P040.2g，用蒸馏水定溶至1000ml)透析3天，去除游离的福美双小分子后，_20°C保存备用。2、抗福美双单克隆抗体的制备利用本发明人所制备的福美双-人血清白蛋白(HSA)偶联物免疫Balb/C小鼠，免疫程序是取含福美双-人血清白蛋白(HSA)偶联物100yg的溶液与等体积的弗氏完全佐剂(购自Sigma公司)乳化，注射小鼠腹腔，以后每间隔十天加强一次，换用弗氏不完全佐剂乳化(购自Sigma公司)。最后于融合前三天，(最好与上次免疫相隔4周以上)，腹腔强化免疫，抗原量加倍(200i!g)，不加佐剂。融合时，取经最后强化免疫的Balb/C小鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75%酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞。将分离的脾细胞与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞按1-2X107个SP2/0与108个免疫细胞(110-115)的比例于50ml离心管中混勻，1500rpm，离心lOmin。倒净上清(可用灭菌的滤纸吸干)，轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动。将装有细胞混合物的离心管放于37°C水浴中。然后在lmin内慢慢滴入预温至37°C的50%聚乙二醇(PEG)0.8ml(购自Sigma公司)，边加边轻轻用吸管尖搅拌，继续搅拌lmin。然后慢慢加入37°C预温的1640(购自Sigma公司商品)基础液(配方164010.4g，NaHC032g，用蒸馏水定容至1000ml，调PH至7.2)10ml。具体方法为第一分钟逐滴滴入lml。第二分钟加lml，第3-4分钟加3ml，第5分钟加其余的5ml，每次加时需缓慢加入，并不但轻轻的搅拌。最后加入30ml1640液，也需慢慢加入。800rpm离心5min，去上清，于37°C放置5-8min。用HAT(购自Sigma公司商品，其成分为100%含量)培养基悬�。币灿肏AT培养基悬浮制备好的饲养脾细胞并与融合后的细胞混合，根据需要补加适量的HAT培养基(培养基的成份80ml1640基础液，20ml灭菌小牛血清，lml100%的HAT，lml双抗)，分种于96孔培养版中，约250u1/孔。一次融合可接种4-8块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含104左右个SP2/0细胞。于37°C，5%C02培养箱中培养。融合后第二天开始观察有无污染，于第4天补加1滴HAT培养基，第8_10天吸去100iil培养基换HT(购自Sigma公司)培养基100yl。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测。采用福美双-卵清蛋白(0VA)作为筛选抗原，利用ELISA方法筛选出分泌抗福美7双的阳性孔。对筛选出来的阳性孔立刻用有限稀释法(参照薛庆善《体外培养的原理与技术》科学出版社2001年版)进行克隆、筛选。经过3-4次克隆，最终筛选出分泌抗福美双的单克隆杂交瘤细胞株，该细胞株于2010年01月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCCNo.3580。此外，对该细胞株进行了染色体计数，结果显示，SP2/0的染色体的平均数为70，脾细胞染色体为40条，而杂交瘤细胞的染色体数目在80-94之间。均高于两亲本细胞的染色体数目，说明融合细胞的确是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物，杂交瘤细胞的染色体数目明显多于骨髓瘤细胞SP2/0的染色体。将该细胞株注射Balb/C小鼠腹腔，生产单克隆抗体。3、抗福美双单克隆抗体的纯化参照朱立平等，《免疫学常用实验方法》，人民军医出版社2000版教导的方法取所得的小鼠腹水5ml与适量的二氧化硅混合，加入等体积的巴比缓冲液(配方氯化钠85.00g,巴比妥钠3.75g，叠氮钠2.00g，用蒸馏水定容至2000ml)，室温振荡1H后，室温静置30min，取上清与洁净离心管中，4°C，3000rpm离心lOmin；取上清液8ml，加入16ml0.06mol醋酸钠缓冲液，用HCL调PH至4.5，充分搅拌下缓缓加入辛酸132yl后，室温搅拌30min，然后转入4°C冰箱充分沉淀2h，4°C，15000rpm离心30min，得上清液22ml，加入2.2mlPH7.2,0.lm的磷酸缓冲液(PB)，用NaOH调PH值至7.6，搅拌下缓缓加入硫酸铵至终浓度为0.277g/ml，4°C，12000rpm离心30min，弃上清，沉淀用5mlMpH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，装入透析袋，对5000ml0.01MpH7.2磷酸盐缓冲液充分透析后，再对2000ml蒸馏水透析，最后对3000ml三蒸去离子水透析，将充分透析好的蛋白溶液用聚乙二醇-20000(PEG-20000)浓缩至3ml，然后4°C，12000rpm离心30min，弃沉淀，收集上清液，测得蛋白浓度为1.6mg/ml。经SDS聚丙烯酰胺凝胶变性电泳(SDS-PAGE)鉴定为纯化的单克隆抗体，纯度大于95%。该单克隆抗体可用于制备免疫胶体金。4、兔抗鼠IgG抗体的制备利用本发明人所在微生物与免疫实验室提取的Balb/C小鼠IgG免疫健康家兔，制备高特异性，高效价的兔抗鼠IgG高免血清，对高免血清采用饱和硫酸铵沉淀法进行粗提，经DEAE过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG抗体。利用该抗体作为质控线。5、抗福美双单克隆抗体_胶体金标记物的制备(1)胶体金的制备用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%，置磁力加热搅拌器上搅拌煮沸，按每100ml0.01%氯金酸加入2ml1%柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈橙红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期一周。(2)抗福美双单克隆抗体_胶体金标记物的制备磁力搅拌下，用0.1M碳酸钾调胶体金的PH值至8.2，按1-2iig抗体/ml胶体金加入抗福美双单克隆抗体，继续搅拌混勻30min，加入10%BSA至终浓度为1%，静置30min。12000rp、4°C离心30min，弃上清，沉淀用0.02mPH9.0的硼酸盐缓冲液(配方硼酸0.1237g,PEG-20000lg，用三馏水定容至1000ml，调PH至9.0)洗涤两次，用二十分之一初始胶体金体积的0.02MPH9.0的硼酸盐缓冲液(配方硼酸0.1237g，PEG-20000lg，用三馏水定容至1000ml，调PH至9.0)将沉淀重悬，置4°C备用，有效期60天。6、结合垫的包被将重悬的抗福美双单克隆抗体-胶体金重悬液采用0.01MPH7.4磷酸缓冲液(配方及制备:BSA20g，蔗糖25g,pvpk-303g,NaN30.2gNaCl8g,KC10.2g,Na2HP0412H202.9g，KH2P040.2g，用蒸馏水定容至1000ml)进行稀释获得抗福美双单克隆抗体-胶体金标记物，均勻滴加于结合垫上，每100平方厘米结合垫滴加20ml抗福美双单克隆抗体-胶体金标记物稀释液，真空干燥，真空封装，置4°C备用。7、样品垫的处理将样品垫浸泡于0.01MPH7.4磷酸盐缓冲液(配方及制备BSA20g，蔗糖25g，pvpk-303g,NaN30.2g,NaCl8g,KC10.2g,Na2HP0412H202.9g,KH2P040.2g，用蒸馏水定容至1000ml)中30min后，于37°C烘干，真空封装，置4°C备用。8、蛋白结合膜的包被用0.01MPH7.4PBS缓冲液(含3%的甲醇)将福美双-牛血清白蛋白(BSA)偶联物稀释到65yg/ml，用Biodot点膜仪将其包被于蛋白结合膜作为检测线，包被量为0.6u1/cm,质控线靠近吸水垫，距吸收垫约8mm，两线距离5_8mm。37°C烘干，封装备用。9、试纸的组装将样品垫⑴、结合垫⑵、蛋白结合膜(3)、吸水垫⑷按图2所示的顺序依次粘附在PVC背衬(7)上，切成3mm宽的小条，真空封装。4_8°C保存，有效期一年；常温保存，有效期6个月。所述样品垫、结合垫、蛋白结合膜、吸水垫、PVC背衬均购自Millipore公司。实施例2抗福美双单克隆抗体的灵敏度和特异性的检测在微孔板上包被福美双-牛血清白蛋白偶联物，包被量为10ng/孔；用所述抗福美双单克隆抗体与HRP酶进行标记获得抗福美双单克隆抗体酶标试剂，11000使用；采用PBST(0.5%Tween-20,0.02MpH7.4的磷酸盐缓冲液)作为洗液；显色采用TMB显色系统；显色终止采用0.2M浓硫酸。以此作为福美双检测系统进行检测，结果采用酶标仪进行读取。选择缓冲液(0.01MpH7.4的磷酸盐缓冲液，配方NaCl8g，KC10.2g，Na2HP0412H202.9g，KH2P040.2g，用蒸馏水定容至1000ml)，在其中加入不同含量的福美双以及浓度为3000ppb福美锌、福美铁、福美甲胂、丙森锌、代森铵、代森锰锌、二硫氰基甲烷、百菌清、扑海因、乙蒜素，制备不同类型样本。采用应用本发明的抗福美双单克隆抗体的酶联免疫试剂进行检测，结果见表1。检测结果显示本发明的抗福美双单克隆抗体具有优秀的灵敏度以及极佳的特异性。表1应用本发明的单克隆抗体进行的检测(波长450nm)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例3免疫胶体金试纸的特异性和灵敏度检测1、特异性检测将福美锌、福美铁、福美甲胂、丙森锌、代森铵、代森锰锌、二硫氰基甲烷、百菌清、扑海因、乙蒜素配制成浓度为3000ppb的样品。直接吸取80yl加入本发明的检测福美双的免疫胶体金试纸。试验结果(见表2)表明，检测福美锌、福美铁、福美甲胂、丙森锌、代森铵、代森锰锌、二硫氰基甲烷、百菌清、扑海因、乙蒜素样品时，试纸检测线出现红色条带，同时质控线上出现红色条带，这表明福美锌、福美铁、福美甲胂、丙森锌、代森铵、代森锰锌、二硫氰基甲烷、百菌清、扑海因、乙蒜素与本发明试纸无交叉反应，显示本发明试纸具有好的特异性。表2本发明试纸特异性检测的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注“+”表示阳性，“_”表示阴性。2、灵敏度试验用本发明检测试纸分别检测浓度为0、5、50、500、1000、3000ppb福美双标准品，重复8次，检测具有可重复性，结果见表3。可见本发明的检测试纸灵敏度可以达到500ppb，完全能够满足需要。表3本发明试纸灵敏度(敏感性)试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注‘‘+，，表示阳性，‘‘_，，表示阴性。实施例4使用免疫胶体金试纸检测蔬菜中的福美双1、样品的预处理取5.Og捣碎的试样于50mL离心试管中，加入IOmL丙酮0.01MpH7.4的磷酸盐缓冲液(14)和0.50g石墨化炭黑(GCB)，振荡提取5-10min,以3000r/min的离心15min，取上清液，作为测试样液。2、检测0.01ΜρΗ7·4的磷酸盐缓冲液(配方=NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H202.9g，KH2PO40.2g，用蒸馏水定容至1000ml)及待检样品各取80μ1加入胶体金试纸上，20分钟后观察结果。3、结果判定如图3所示，若待测样品试纸检测线不出现条带，同时质控线上出现红色条带则判断为阳性结果，即待测样品中福美双的浓度高于500ppb(图3Β)；若待测样品试纸检测线出现了红色条带，同时质控线上出现红色条带则判断为阴性结果(图3A)，即待测样品中福美双的浓度低于500ppb；如果质控线上没有出现红色条带，则该试纸无效(图3C、图3D)。实施例5番茄样品中添加福美双的模拟检测试验分别向番茄样品中添加福美双标准溶液，使番茄样品中福美双浓度分别为Oppb，IOOOppb0按实施例4所述方法，用本发明检测试纸分别对Oppb和IOOOppb福美双番茄样品进行检测，重复3次，结果显示，Oppb样品检测线出现红色条带，判读为阴性样品；而IOOOppb样品检测线未出现红色条带，判为阳性样品。说明本发明检测试纸可以用来检测蔬菜(例如番茄)中的福美双残留。尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。权利要求一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCCNo.3580，保藏日期2010年01月13日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。2.一种抗福美双单克隆抗体，其由权利要求1的杂交瘤细胞株产生。3.—种检测福美双的组合物，其含有权利要求2所述的抗福美双单克隆抗体。4.一种检测福美双的试纸，其含有有效量的权利要求2所述的抗福美双单克隆抗体，优选地，所述抗福美双单克隆抗体用胶体金标记。5.根据权利要求4所述的试纸，其具有福美双_载体蛋白偶联物构成的检测线，优选地，其还具有抗鼠IgG抗体构成的质控线。6.根据权利要求5所述的试纸，包括样品垫(1)、结合垫(2)、蛋白结合膜(3)、吸水垫⑷和背衬(7)，并且所述样品垫(1)、结合垫(2)、蛋白结合膜(3)、吸水垫(4)沿水平方向依次粘附在背衬(7)上；其特征在于，所述结合垫(2)上包被有权利要求2所述的抗福美双单克隆抗体，所述抗福美双单克隆抗体用胶体金标记；所述蛋白结合膜(3)上分别包被有福美双-载体蛋白偶联物构成的检测线(5)和抗鼠IgG抗体构成的质控线(6)，所述检测线(5)与质控线(6)的间距为5-8mm。7.根据权利要求6所述的试纸，其中，所述蛋白结合膜选自硝酸纤维素膜或PVDF膜，并且优选硝酸纤维素膜；优选地，所述背衬为PVC背衬。8.根据权利要求6所述的试纸，所述载体蛋白选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、或卵清蛋白，并且优选牛血清白蛋白。9.权利要求6所述的试纸的制备方法，包括如下步骤1)将福美双与载体蛋白偶联，形成福美双-载体蛋白偶联物；2)用福美双_载体蛋白偶联物作为抗原制备权利要求2所述的抗福美双单克隆抗体；3)制备抗鼠IgG抗体；4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；5)将步骤2)中制备的抗福美双单克隆抗体加入步骤4)制备的胶体金中，得到抗福美双单克隆抗体_胶体金标记物；6)将抗福美双单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合垫(2)上；7)将福美双-载体蛋白偶联物包被在蛋白结合膜(3)上构成检测线(5)；并将抗鼠IgG包被在蛋白结合膜(3)上构成质控线(6)；8)在所述的背衬(7)上沿水平方向依次粘附样品垫(1)、结合垫(2)、蛋白结合膜(3)、吸水垫(4)。10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述载体蛋白选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、或卵清蛋白，并且优选牛血清白蛋白。11.根据权利要求9所述的方法，其中，步骤3)中的所述抗鼠IgG抗体为兔抗鼠IgG抗体；所述蛋白结合膜(3)选自硝酸纤维素膜或PVDF膜，并且优选硝酸纤维素膜；优选地，所述背衬⑵为PVC背衬。12.—种检测福美双的酶联免疫试剂，其用权利要求2所述的抗体作为第一抗体。13.权利要求2所述的抗体在检测福美双中的应用。14.权利要求2所述的抗体在检测蔬菜或水果中的福美双中的应用。全文摘要本发明属于农药检测领域，利用免疫化学技术快速检测残留的农药。具体地，本发明涉及一种保藏编号为CGMCCNo.3580的杂交瘤细胞株，以及所述杂交瘤细胞株产生的抗福美双单克隆抗体。本发明还涉及一种检测福美双的组合物、一种检测福美双的试纸、所述试纸的制备方法、一种检测福美双的酶联免疫试剂、以及所述抗福美双单克隆抗体在检测福美双中的应用。本发明的单克隆抗体灵敏度高、特异性强。本发明的试纸具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测快速准确等显著优点。文档编号G01N33/558GK101825632SQ20101013969公开日2010年9月8日申请日期2010年4月6日优先权日2010年4月6日发明者王金花,罗海峰申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局;北京万泰生物药业股份有限公司

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抗福美双单克隆抗体和快速检测福美双的试纸及其应用的制作方法