专利名称：乙型肝炎病毒(hbv)荧光定量pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速定量检测不同基因分型乙肝病毒(Hepatitis B virus, HBV)血清 DNA的荧光定量PCR检测方法及其试剂盒，属于生物技术领域。
技术背景乙型肝炎是严重�：愦笕嗣袢褐诘囊恢殖＜。两袢允鞘澜缧缘囊窖烟�,它是嗜 肝HBV病毒引起的一种高发病率、高死亡率的传染病。据统计，2003年全世界有乙肝患者 350,000，000，到2004上升[2]到400，000,000"在美国，慢性乙肝感染导致每年大约5000人死 于肝硬化和肝癌。根据卫生部的调査1992年至1995年，我国人群乙肝感染率为57.6%;据 此推算，我国约有6.9亿人已感染或正在感染乙肝病毒，1.2亿人携带乙肝病毒。因此，乙型 肝炎己成为一个十分严重的公共卫生问题，应引起社会各界的高度重视，必须加强预防，减 少发�。刂屏餍�。乙肝病毒传统的检测方法一般为细胞培养法和酶联免疫法(ELISA)，但这两种方法工 作量大、耗时长，给乙肝病毒的检测带来诸多不便。随着分子生物学技术的飞速发展，人们 己经将实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescence polymerase chain reaction)广泛应用于临 床检验，包括病毒、细菌等多种病原微生物的检测以及多种病毒、细菌耐药性的检测等。实 时荧光定量PCR (real-time fluorescence polymerase chain reaction)是通过荧光染茅斗或荧光木示i己 的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，在一适当波长下实时在线监控反应过程，利用探 针在无特异性PCR发生时，荧光信号不变，当有特异性PCR发生时，探针会在PCR过程中 被切断而引起荧光信号的增长。荧光信号伴随着PCR的过程进行，伴随PCR产物增长而增 长，当荧光强度达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的依据，再结合相应 的软件可对结果进行分析，计算出待测样品的初始模板量。实时荧光定量PCR技术具有以下优 点.-(1)PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性；(2)仪器自动分析， 效率高、无后续处理；(3)独特的定量原理，即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于 定量，定量范围宽，无须稀释样品，结果重现性好；(4)采用dUTP-UNG酶的防污染系统, 所有试剂均是一次扩增，毋须开盖，不产生污染。本发明即利用荧光定量PCR技术对乙肝病毒进行检测，具有特异性好，灵敏度高，定量 精确，快速简便，可重复性高等特点，可进行快速定性定量检测。此外，该乙肝病毒实时荧 光定量PCR检测方法，采用碱裂解法提取乙型肝炎病毒DNA，在裂解过程结束后直接取裂 解液加入PCR反应液中进行扩增，在不影响灵敏度、准确度的情况下，不仅縮短了操作时间， 降低了劳动强度，而且也直接降低了临床样品PCR诊断的成本，延续了荧光定量PCR检测 方法的快速简便性能，从而实现对乙肝病毒的定性定量检测。发明内容本发明的曰的旨在提供一种精确简便的用于定量乙肝病毒血清DNA的方法；本发明的 另一目的在于提供一种用于该方法的的试剂盒。本发明的技术特征在于在对现有各个亚型HBVDNA序列分析的基础上，选取保守基因 序列设计出 一对特异性引物和一条特异性双荧光探针，采用实时荧光PCR方法扩增目的基因。 同时，该方法采用碱裂解法提取乙型肝炎病毒DNA，在裂解过程结束后直接取裂解液加入 PCR反应液中进行扩增，在不影响灵敏度、准确度的情况下，不仅縮短了操作时间，降低了 劳动强度，而且也直接降低了临床样品PCR诊断的成本，延续了荧光定量PCR检测方法的 快速简便性能，从而实现对乙肝病毒的定性定量检测。本发明的技术特征在于，在按下述方法设计的探针和相应引物存在下，在荧光PCR仪 中，对从血清样品提取的乙型肝炎病毒DNA进行PCR扩增，实现乙型肝炎病毒基因分型检1. 所述的探针和特异性引物设计方法如下1) 同源性比对从GeneBank数据库中调出乙肝病毒各亚型基因序列。2) 通过比对选取高度保守序列。3) 以保守序列为基准设计一对特异性引物及一条荧光探针。2. 引物和荧光探针设计原则1) 特异性引物和荧光探针的长度每条引物长度为18-25个碱基，荧光探针长度为20 30个碱基。2) 特异性引物和荧光探针中GCM要求在40 60。/。，理论Tm〉50。C。3) 特异性引物和荧光探针自身、引物和探针之间的3'端尽可能避免碱基配对。4) 引物和荧光探针自身、引物和探针之间尽可能避免6对以上的连续碱基配对。5) 选用的引物和荧光探针要求设计在人乙型肝炎病毒(HBV)基因中的保守区，只对人 乙肝病毒特异，和其他物种无交叉反应。荧光探针位于一对引物之间的区域。扩增 目的基因长度最好介于80 150bp。3. 乙肝病毒特异性扩增基因序列为-1 GGCGTTTTAT CATATTCCTC TTCATCCTGC TGCTATGCCT 41 CATCTTCTTG TTGGTTCTTC TGGACTACCA AGGTATGTTG 81 CCCGTTTGTC CTCT针对乙型肝炎病毒特异性扩增序列设计的引物与探针序列为PHBV1上游引物5' GGCGTTTTAT CATATTCCTC TTCAT 3， 25bp PHBV2下游引物5' AGAGGACAAA CGGGCAACAT A 3' 21bp FPHBV荧光探针5' FAM-CCTCATCTTC TTGTTGGTTC TTCTGG -TAMARA3' 26bp4. 试剂盒组成一对特异性引物PHBV， 一条特异性荧光探针FPHBV， Taq酶，UNG酶，乙型肝炎病 毒强阳性对照、阴性对照、临界阳性指控品对照血血清，HBV阳性定量标准品、核酸裂解 液，PCR缓冲液(mix)。5. 乙肝病毒核酸裂解体系NaOH 100mmol/LTris-HCl (pH 8.0) 26 mmol/LEDTA 4 mmol/LTritonX-100 1.4 %NP-40 1.4 % 6.实时荧光PCR反应液Tris-HCl (pH8.0) 50 mmol/LMgCl2 3謹ol/LKC1 50 mmol/L甲酰胺 3%dATP 200 uMdGTP 200 uMdCTP 200 uMdUTP 200 uMdTTP 100 uM叠氮钠 0.25 °/00引物PHBV1 0.25 nmoI/L
PHBV2 0.25 nmol/L荧光探针FPHBV 0.15 nmol/L 配制成PCR反应液，于一20'C保存，每人份43.1ul。7. 实时荧光PCR反应体系PCR反应液 43.1ulTaq酶(2.5U/pl) 0.8 (alUNG酶(崎1) 0.1 plMM_6 ul总反应体积 50pl8. PCR程序1 37。C 5 min2 93 。C 2min3 93°C 45 s4 55°C 1 min5 Go to 2， 10 cycles6 93°C 30 s7 55°C 45 s8 Go to 530 cycles,在第七歩采集荧光。9 end9. 检测本发明使用ABI Prism 7300实时荧光PCR仪进行检测。10. 结果判断1) 阴性结果判定如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值二30，试验结果判断为阴性。2) 阳性结果判定如果增长曲线呈S型曲线且Ct值〈30，则实验结果判为阳性；样品 的病毒含量计算为若样品Qty<5X 102 IU /ml则判样品的HBV-DNA含量<5X 102 IU /ml,病毒含量仅 供参考。若样品5X 102 IU /ml《Qty《1 X 108IU /ml 则判样品的HBV-DNA病毒含量IU/ml。 若样品Qty〉 1 X 108 IU /ml则判样品的HBV-DNA病毒含量>1 X 108 IU /ml，也可将该血清样本按10倍梯度做相应稀释，使其落在5X 102 IU/ml到1 X 108 IU/ml范围内再重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正。
具体实施方式
-实施例1-—乙型肝炎病毒实时荧光PCR检测方法及其试剂盒1. 乙肝病毒实时荧光PCR诊断试剂盒组成试剂盒由乙肝病毒裂解液，PCR缓冲液(mix), —对特异性引物PHBV， 一条特异性探针FHBV， Taq酶，UNG酶组成，乙型肝炎病毒强阳性对照、阴性对照、临界阳性指控品对 照血血清，HBV定量标准品组成。2. 乙肝病毒特异性扩增基因序列为通过基因序列分析，我们选择其中的保守序列设计出一条特异性引物和一条特异性荧光探针。 一对引物设计的Tm值接近，相差不到2'C。1 GGCGTTTTAT CATATTCCTC TTCATCCTGC TGCTATGCCT41 CATCTTCTTG TTGGTTCTTC TGGACTACCA AGGTATGTTG 81 CCCGTTTGTC CTCT针对乙型肝炎病毒特异性扩增序列设计的引物与探针序列为PHBVl上游引物5' GGCGTTTTAT CATATTCCTC TTCAT 3' 25bp PHBV2下游弓I物5' AGAGGACAAA CGGGCAACAT A 3' 21bp FPHBV荧光探针5' FAM- CCTCATCTTC TTGTTGGTTC TTCTGG TAMARA3， 26bp乙肝病毒荧光检测试剂盒扩增序列为一段编码序列，全长94bp，在基因组中是单拷贝序列。3. 样品处理和模板DNA的提取a) 乙肝病毒核酸裂解液的配制NaOH 100 mmol/LTris-HC1 (pH 8.0) 26 mmol/LEDTA 4 mmol/LTritonX-100 1.4 %NP-40 1.4 %b) 在0.25ml的PCR离心管中，加入4ul DNA裂解提取液，取待测血清样本以及试剂盒中的质控品(阴性质控品、强阳性质控品及临界阳性质控品、4个阳性标准品)各4 yl加入，盖好管盖。c) 在99.9。C保温10分钟，4°C 5分钟，用8联离心管离心机，3000-5000rpm离心1-2
分钟。.4.荧光定量PCR扩增a)实时荧光PCR反应液的配制:Tris-HCl (pH8.0)50 mmol/LMgCl23 mmol/LKC150 mmol/L甲酰胺3 %dATP200 uMdGTP200 uMdCTP200 uMdUTP200 uMdTTP100uM叠氮钠0,25 %0引物PHBV10.25阿ol/LPHBV20.25 (imol/L荧光探针FPHBV0.15 (imol/L配制成PCR反应液，于一2(TC保存，每人份43.1ul。b)实时荧光PCR反应体系从0.25ml的PCR离心管中取6 u 1上清液加入8排PCR离心管中用于PCR扩增。PCR反应液 43.lulTaq酶(2.5U/pl) 0.8 plUNG酶(1卵) 0.1 nl模板_6^1总反应体积 50nlc) PCR程序137 。C5 min293 °C2 min393 °C45 s455 °C1 min5Go to 2, 10 cycles693 。C30 s755 。C45 s8Go to 5 30 cycles,在第七步采集荧光。9 endd) 检测本发明使用Am Prism 7300实时荧光PCR仪进行检测。e) 结果判断-1) 阴性结果判定如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值二30，试验结果判断为阴性。2) 阳性结果判定如果增长曲线呈S型曲线且Ct值〈30，则实验结果判为阳性；样品的病毒含量计算为若样品Qty<5X102 IU/ml则判样品的HBV-DNA含量<5X 102 IU/ml，病毒含量仅 供参考。若样品5 X 102 IU /ml《Qty《1 X 108IU /ml则判样品的HBV-DNA病毒含量IU/ml。 若样品Qty〉 IX 108 IU/ml则判样品的HBV-DNA病毒含量>1 X 108 IU/ml,也可将该血清样本按10倍梯度做相应稀释，使其落在5X 102 IU/ml到1 X 108 IU/ml范围内再重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正。 实施例2…-临床检测用上述方法对135例临床样品进行检测，其中乙肝患者63例，检出阳性率99%，准确率 98.4%,并且能够对乙肝病毒进行准确定量分析，远远优于酶联免疫和细胞培养法。本发明具 有特异性好，灵敏度高，定量精确，快速简便，可重复性高，可对乙肝病毒进行快速定性定 量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法和ELISA(酶联免疫吸附试验)诊断方法。此外， 乙肝病毒碱裂解法降低了临床样品PCR诊断的工作量和诊断的成本，具有潜在的应用价值。 序列表<110〉扬子江药业集团北京海燕药业有限公司〈120乙型肝炎病毒(HBV)实时荧光定量PCR检测试剂盒 <160>4<210>1<211>94<212>DNA<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus) <400>1ggcgttttat catattcctc ttcatcctgc tgctatgcct catcttcttg ttggttcttc 60 tggactacca aggtatgttg cccgtttgtc ctct 94<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>根据乙型肝炎病毒核苷酸序列比较设计，用于检测乙肝病毒的特异性引物序列； <400>2ggcgttttat catattcctc ttcat 25<210〉3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据乙型肝炎病毒核苷酸序列比较设计，用于检测乙肝病毒的特异性引物序列； <400>3agaggacaaa cgggcaacat a 21<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据乙型肝炎病毒核苷酸序列比较设计，用于检测乙肝病毒的特异性荧光探针序列 5'端连有荧光基团FAM， 3'端连有泯灭基团TAMARA<40O4cctcatcttc ttgttggttc ttctgg 2权利要求
1、一种乙肝病毒实时荧光定量PCR检测方法以及试剂盒组成。本法考察了人体乙肝病毒基因组全序列，并对检索所得HBV各个亚型序列进行同源性比较，针对其保守基因序列设计出一对特异性引物和一条特异性双荧光探针，采用实时荧光PCR方法扩增目的基因，实时采集荧光，并通过软件计算出样品的病毒含量。
2、 采用碱裂解法提取乙型肝炎病毒DNA。在裂解过程结束后直接取部分裂解液若干加入 PCR反应液进行扩增，以对乙肝病毒的定性定量检测。
3、 按照权利要求1所述的乙肝病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述实时荧 光定量PCR扩增基因序列的反应体系为实时荧光定量PCR反应体系PCR反应液 43.1nlTaq酶(2.5U尔1) 0.8 plUNG酶(崎1) 0.1 nl模板_6 )nl总反应体积 50nl 。
4、 按照权力要求3所述的PCR反应液的配制Tris-HCl (pH8.0)65 mmol/LMgCl23 mmol/LKC150 mmol/L甲酰胺3%dATP200dGTP200 (iMdCTP200 pM200 ,dTTP100叠氮钠0.25 %>引物PHBV10.25 jamol/LPHBV20.25 pmol/L荧光探针FPHBV0.15 inmol/L配制成PCR反应液，于一2(TC保存，每人份43.1^1。
5、按照权力要求3所述模板DNA的制备方法 a)乙肝病毒核酸裂解液的配制NaOH 100 mmol/LTris-HCl (pH 8.0) 26 mmol/LEDTA 4 mmol/LTritonX-lOO 1.4 %NP-40 1.4 %b) 在0.25ml的PCR离心管中，加入4ul DNA裂解提取液，取待测血清样本以及试剂 盒中的质控品(阴性质控品、强阳性质控品及临界阳性质控品、4个阳性标准品)各4 yl加入，盖好管盖。c) 在99.9。C保温10分钟，4°C 5分钟，用8联离心管离心机，3000-5000rpm离心1-2 分钟。.d) 从0.25ml的PCR离心管中取6u 1上清液加入8排PCR离心管中用于PCR扩增。
6 按照权利要求1所述的乙型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于试剂盒包 括以下成分 一对特异性引物PHBV、 一条特异性荧光探针FPHBV、 Taq酶、UNG酶、 乙型肝炎病毒强阳性和临界阳性质控品、阴性质控品、HBV定量标准品、HBV核酸裂解 液和PCR反应液。
7 、按照权利要求1所述的乙肝病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于乙肝病毒特异性扩增基因序列为GGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTG GTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCT
8 、按照权利要求1所述的乙型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于:针对乙型 肝炎病毒特异性扩增序列设计的引物与探针序列为上游弓I物PHBV1: 5，一GGC GTT TTA TCA TAT TCC TCT TCA T—3， 25bp 下游引物PHBV2: 5，一AGAGGACAAACGGGCAACATA—3 21bp 荧光探针FPHBV:5' FAM-CCT CAT CTT CTT GTT GGT TCT TCT GG-TAMARA—3' 26bp乙肝病毒荧光检测试剂盒扩增序列为一段编码序列，全长94bp，在基因组中是单拷贝序
全文摘要
本发明涉及乙型肝炎病毒(HBV)实时荧光定量PCR检测方法以及试剂盒组成。本方法采用碱裂解法提取乙型肝炎病毒DNA，在裂解过程结束后取部分微量裂解液直接加入PCR反应液中进行扩增；反应液中含有一对特异性引物和一条用荧光染料标记的探针，采用PCR法扩增目的基因，实时检测反应体系的荧光强度，并根据分析软件计算Ct值并计算出样品病毒含量。本发明的试剂盒在保证灵敏度、准确度的情况下，操作简单、快速，降低了临床检测的劳动强度，同时降低了临床PCR诊断的成本，延续了荧光定量PCR检测方法的快速简便性能。此方法适用于HBV定量检测，可用作临床实验室对HBV感染的辅助诊断方法和临床治疗效果的监测手段，对实验操作者要求相对较低，具有实际的临床应用价值。
文档编号G01N21/00GK101158634SQ20071012131
公开日2008年4月9日 申请日期2007年9月4日 优先权日2007年9月4日
发明者吕倩倩, 唐先兵, 李晓雯, 段清芬, 石和鹏, 静 肖, 郑宜婷 申请人:扬子江药业集团北京海燕药业有限公司
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