专利名称：检测妇科病症的测定法的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及妇科病症的诊断和预后性症状测定方法领域。更尤其是，本发明 提供了一种测定方法，该测定方法可以诊断妇科癌症或其亚型、或癌症阶段或由其引起的 并发症、或其它妇科病症(包括炎症性病症)的存在或患有上述疾病的风险。本发明的测 定方法能够将病理结构整合，从而提供诊断和报告系统。背景
在说明书的最后，按字母顺序汇总了作者在本说明书中所引证的出版物的目录的详细 内容。本说明书中对任何现有技术的引证不是、也不应该理解为是对该现有技术在任何 国家构成普通常识的一部分的承认或任何形式的暗示。卵巢癌是最致命性的妇科恶性肿瘤中的一种，并且是使女性死亡的第五个最常见 病因。维持高致死率水平的一个最主要因素是缺乏在疾病初期能治疗阶段的早期检测方 法。在疾病的早期(阶段I和II)期间，癌瘤包含在卵巢之内(阶段I)或在骨盆的其 它器官之内(阶段II)。阶段I疾病的检测可以在5年时具有80%以上的存活率，而对于阶 段II，存活率下降到70%多。在其后面的阶段中，癌扩散到骨盆以外，到达腹部内层或淋巴 结。此时，检测后的5年存活率降低到50%以内。最后该疾病的最晚期是阶段IV，此时发生 癌转移至肝、肺或其它器官，存活率小于30%。通常，初期阶段的卵巢癌是无症状的，并且大部分诊断是在已经确定疾病部位或 向远端转移时做出的。尽管进行进攻性的减少细胞数的手术和基于钼的化疗，但对于临床 上晚期卵巢癌的患者而言，5年存活率只有15至20%，而阶段I疾病的治愈率通常是90%以 上(Holschneider and Berek, Semin Surg Oncol, 19(1)2000)。这些统计提供了 提高卵巢癌筛查和早期鉴别的主要基本原理。在某种程度上，与卵巢癌有关的高死亡率是因为缺乏有效的早期检测方法。如果 进行早期检测，可以显著地提高存活率。研究工作集中在在卵巢癌的第一信号方面评价女 性的改进方式的开发，尤其是对于那些处于高风险的女性。然而，迄今为止，还不能鉴定 恶变前的病变。尽管已经在卵巢癌的显著部分中鉴定了一些基因的变化，例如c-erb-B2、 c-myc和p53，但这些变化中任何一个也不能诊断恶性肿瘤或预测肿瘤随着时间的推移而 变化的特性(Veikkola 等人Career Res 60(2)2000; Berek 等人^？ J Obstet Gynecol, :1038-42, 1991; Coo释等kClin Cancer Res. S(10) :3193-7, 2002; 和 Di Blasio 等人/ Steroid Biochem Mol Biol. 53(卜6) \ 观-% 1995)。相反，高度危险的女性必须依赖遗传咨询和测试，以及血清CA125水平的测定和阴道超声波(Oehler and Caffier, Anticancer Res, ^^ 5109-12, 2000;等)κEur J Gynaecol Onco20(3) :177-81, 1999;和 Senger 等人983-5，1983)。然而，CA125
对于检测初期阶段的疾病既不敏感也没有特异性。因此，CA125不适合于通常的筛查。人 们只认为它在监控疾病的响应或发展是实用的，但不作为诊断或预测标志(Gadducci等人 Anticancer Res 19(2B) 1401—5，1999)。使用阴道超声波、多普勒和形态指数的筛查已经显示了一些令人鼓舞的结果，但 是，目前单独使用它们还缺少一般人群筛查试验所需要的特异性(Karayiarmakis等人 Surgery 131 (5) 548-55, 2002 和 Lee 等人 / ifcco/ 77々)149-52，2000)。使用肿 瘤标记物和超声波的组合多模式筛查获得了更高的敏感性和特异性。这种组合方法还是最 具成本效率的潜在筛查策略(Karayiannakis等人2002 supra和Lee等人2000 supra)。 然而，它在常规人群中的有效性也是有问题的。由此，还迫切需要开发用于疾病的早期检测 的其它标记物。人们认为，在与CA125的组合中，通过使用血清/血浆蛋白标记物，可以获得提高 的特异性和敏感性。Gorelik 等人(Cancer Epidemiol,Biomarkers Prev 14(4) :981-987,2005)使用 了带有末级分类树分析的多重测定设计，以便区分卵巢癌和对照组。他们的多重设计使用 了 CA125与(尤其是)EGF和VEGF的组合，并且报道了在80-90%特异性下获得90-100%的 改善的敏感性水平(与单独CA125标记物只获得70-80%相比较)。同样地，Visintin 等人(Clin Cancer Res 14 1065-1072，2008)报道了一项 研究，在该研究中，使用了多重方法和ELISA，基于标记物组(panel)来测试健康对照物和 卵巢癌患者。他们的选择标记物是CA125与瘦素、催乳素、骨桥蛋白、胰岛素样生长因子II 和巨噬细胞抑制因子的组合。虽然没有一个生物标记物能够独自鉴别疾病和对照物，但该 组合在95%的特异性下获得了 84-98%敏感性(与单独CA125在相同特异性水平下只获得 7 敏感性相比较)。还需要开发对于妇科病症例如卵巢癌和由其引起的并发症的高灵敏度的测定方 法，尤其是初期阶段的卵巢癌以及其它妇科病症，包括炎症病症。概述
在整个说明书中，除非上下文另外需要，“包括”或其变体例如“包含”或“包括”应该理 解为是表示包含所指出的要素或整数或要素或整数的组，但不排斥任何其它要素或整数或 要素或整数的组。本发明提供了检测和监控妇科病症例如妇科癌症的方法。术语“妇科病症”包括 由妇科癌症引起的并发症以及炎症病症，例如子宫内膜异位。本方法尤其能够检测妇科病 症的初期阶段、便于组织学检查和监控治疗方案。当应用于诊断有病症的女性时，本发明 特别有用，但也可以同样地用于诊断无症状的女性和/或处于形成妇科病症的高风险中的 女性。本发明方法的一个方面是蛋白质组学(proteomic)，在具体实施方案中，是多因子测 定法(其中测定了两种或多种生物标记物或分析物的组合水平，生物标记物或分析物选自 前梯度蛋白-2(AGR-2)，中期因子(midkine)，CA125，白细胞间介素-6 (IL-6)，白细胞间介 素-8(IL-8)，C-反应蛋白(CRP)，血清淀粉状蛋白A(SAA)和血清淀粉状蛋白P(SAP))。对这些生物标记物的提及，尤其是对AGR-2、中期因子(midkine)、CAl25、IL-6、IL-8、CRP、SAA 和SAP的提及，包括其任何衍生物或改良型，例如多晶型变体、截短形式、团聚体或复合形 式以及其同系物。本发明的测定法尤其适合于整合为病理平台或结构。在一个实施方案中，两种或多种生物标记物的浓度的相对变化(与对照物做比 较)显示了妇科疾病症状或对治疗的响应水平。在另一个实施方案中，对该水平进行多变 量分析，以便形成能够确定病症存在与否的概率指数的算法。在另一个方面，检测单独的 AGR-2或中期因子(midkine)或与其它标记物(包括CA125)的组合的浓度水平改变是妇科 病症的指症。提及的“改变”包括组织或液体例如血浆中的生物标记物的浓度的升高或减 少，这里是指相对于对照样品或阈值水平或标准正常值的数据库或按照算法分析。通常，该 变化是生物标记物的浓度增加。不只是蛋白质组学(proteomic)方法，但本发明扩展至遗传方法，以便测定编码 上述生物标记物的基因的表达。两种或多种生物标记物的生物标记物浓度(即水平)提供了生物标记物水平和患 者的疾病状态之间的可测量关系。除了生物标记物的“水平”之外，本发明扩展至两种或多 种标记物的比例作为输入数据，用于与对照物进行比较，或用于形成算法的多变量分析。通 过筛查单独的AGR-2或中期因子(midkine)或与CA125的组合的浓度水平的改变，本发明 扩展至妇科病症的检测。由此，单独的AGR-2或中期因子(midkine)或与CA125或其它生物 标记物的组合的浓度水平改变指示了某种病症。或者，单独的AGR-2或中期因子(midkine) 或与其它生物标记物的组合的水平可以用于多因子的运算方法。选择的生物标记物还可以在组织的组织学评价中共同或单独使用，或用于监控治 疗方案的效果。生物标记物还用于妇科癌症的亚型，或用于确定癌症的阶段，这可以影响所 使用的抗癌症治疗的类型。由此，本发明扩展至治疗妇科癌症的个性化药物方法。本发明 扩展至其它妇科病症，例如炎症性病症。相应地，本发明的一个方面包括用于确定患者的妇科病症存在的测定法，该测定 法包括测定得自于患者的生物样品中AGR-2、中期因子(midkine)和/或CA125或其修饰 形式或同系物形式中的两种或多种的浓度，其中AGR-2、中期因子(midkine)和/或CA125 或其修饰形式或同系物形式中的两种或多种的水平发生改变预示患者具有妇科病症。还可 以单独或与其它生物标记物组合来筛查AGR-2或中期因子(midkine)或CA125或它们的修 饰形式或同系物形式的水平。如上所指出，术语“改变”是指浓度的提高或升高或浓度的减 小或降低。试验可以在组织、组织液或血液(包括血浆或血清)中进行。更尤其是，本发明提供了用于确定患者的妇科病症存在的测定法，该测定法包 括测定得自于患者的生物样品中的生物标记物的水平，其中生物标记物是CA125和选自 AGR-2、中期因子(midkine)和CRP或其修饰形式或同系物形式中的至少一种，其中，相对于 对照物，生物标记物的水平的变化指示患者是否存在病症。在替代性实施方案中，本发明提供了确定患者的妇科病症存在的测定法，该测定 法包括测定得自于患者的生物样品中的生物标记物的浓度，生物标记物选自AGR-2、中期 因子(midkine)和CA125或其修饰形式或同系物形式中的两种或多种；CA125、IL_6、IL-8、 CRP、SAA和SAP或其修饰形式或同系物形式中的两种或多种；IL-6、IL-8、CRP、SAA和SAP 或其修饰形式或同系物形式中的两种或多种；或CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA和SAP或其修饰形式或同系物形式中的至少一种，和中期因子(midkine)或AGR-2或其修饰形式或同系 物形式中的至少一种；对浓度进行运算，其中这种运算得自于数据的第一知识库，其包括就 病症来说处于已知状态的患者的相同生物标记物的水平，其中该运算提供具有或不具有病 症的患者的概率指数。由此，在一个实施方案中，基于采用生物标记物的水平与对照样品的比较，本发明 提供了诊断规则。在另一个实施方案中，诊断规则基于统计和机械学习算法的应用。这种 算法使用生物标记物和疾病状态之间的关系(在培训用数据(具有已知的疾病状态)中观 察到的)，从而推断关联性，然后将其用于预示未知状态患者的状态。数据分析领域熟练的 医师可以判明，可以使用培训用数据中的推断关联性的许多不同形式，不会实质上改变本 发明。在一个实施方案中，病症是癌症，例如卵巢癌症或由其引起的并发症。在另一个实 施方案中，病症是妇科炎症性病症，例如但不局限于子宫内膜异位。确定病症的“存在”包括确定具有病症的危险。方便地将“危险”理解为如下的描 述相对于不具有病症的患者，测定具有病症的概率指数。由此，本发明包括使用培训用数据的知识库，其包括具有妇科病症的患者的生物 标记物水平，当输入数据的第二知识库(其包括具有未知妇科病症患者的相同生物标记物 的浓度)时，提供预示妇科病症的性质或不存在病症的概率指数。本发明进一步包括用于检测患者卵巢癌症的测定法，该测定法包括使源于患者 的样品与两种或多种的AGR-2、中期因子(midkine)或CA125或其修饰形式或同系物形式 的固定配体接触一段时间，并且是在AGR-2或中期因子(midkine)或CA125或其修饰形式 或同系物形式与它的配体结合的条件下，这可以提供AGR-2、中期因子(midkine)和/或 CA125或其修饰形式或同系物形式的浓度指示，其中AGR-2、中期因子(midkine)和/或 CA125或其修饰形式或同系物形式中的两种或多种的浓度改变预示卵巢癌。在一个替代性实施方案中，本发明包括用于检测患者卵巢癌的测定法，该测定法 包括使患者与针对下列(物质)的固定配体接触一段时间AGR-2、中期因子(midkine)和/ 或CA125或其修饰形式或同系物形式中的两种或多种；CA125、IL_6、IL_8、CRP、SAA和/或 SAP或其修饰形式或同系物形式中的两种或多种；IL-6、IL-8、CRP、SAA和/或SAP或其修 饰形式或同系物形式中的两种或多种；或CA125、IL-6、IL-8、SAA和/或SAP或其修饰形式 或同系物形式中的至少一种，和单独的中期因子(midkine)和/或AGR-2或与CA125的组 合或其修饰形式或同系物形式中的至少一种，并且是在生物标记物与配体能够充分结合的 条件下，而后检测结合水平，这可以预示生物标记物的浓度，并对该浓度进行运算，这种运 算是使用具有卵巢癌的患者的生物标记物水平产生的，从而提供患者具有或不具有卵巢癌 的概率指数。本发明的另一个方面涉及用于检测妇科病症的生物标记物的配体组(panel)，该 组(panel)包括针对下列(物质)的配体AGR_2、中期因子(midkine)和/或CA125或其修 饰形式或同系物形式中的两种或多种；CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA或SAP或其修饰形式或 同系物形式中的两种或多种；IL-6、IL-8、CRP、SAA或SAP或其修饰形式或同系物形式中的 两种或多种；或04125、11^-6、11^-8、0^、544或54 或其修饰形式或同系物形式中的至少一 种，和单独的中期因子(midkine)或AGR-2或与CA125的组合或其修饰形式或同系物形式中的至少一种。尤其是，本发明提供了用于检测患者妇科病症的生物标记物的组(panel)，该 组(panel)包括与生物标记物特异性结合的试剂，生物标记物选自AGR_2、中期因子 (midkine)和/或CA125或其修饰形式或同系物形式中的两种或多种；CA125、IL_6、IL-8、 CRP、SAA和SAP或其修饰形式或同系物形式中的两种或多种；IL-6、IL-8、CRP、SAA和SAP 或其修饰形式或同系物形式中的两种或多种；和CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA和SAP或其修 饰形式或同系物形式中的至少一种，和单独的中期因子(midkine)或AGR-2或与CA125的 组合或其修饰形式或同系物形式中的至少一种，以便测定两种或多种生物标记物的水平， 而后对该水平进行分析，从而测定任何变化，例如生物标记物水平增加。在一个实施方案中，将浓度与对照物或“正常”或“异常”值的数据库进行比较。 在另一个实施方案中，对浓度进行运算(由包括与就该病症来说处于已知状态的患者的相 同生物标记物的水平的数据的第一知识库产生)，其中该运算提供具有或不具有病症的患 者的概率指数。本发明的另一个方面包括用于确诊妇科病症存在或不存在的试剂盒，该试剂盒包 括包含组成部分[χ]η、γ和[Zlffl的物质的组合物，其中
X是生物标记物的配体，生物标记物选自CA125或其修饰形式或同系物形式，η是 或
1 ；
Y是生物标记物的配体，当η是0时，生物标记物选自AGR-2和/或中期因子 (midkine)或其修饰形式或其同系物形式中的一种或多种；IL_6、IL_8、CRP、SAA和SAP或 其修饰形式或其同系物形式中的两种或多种，或当η是1时，生物标记物选自IL-6、IL-8、 CRP、SAA和SAP或其修饰形式或其同系物形式中的至少一种；和
Z是生物标记物的配体，生物标记物选自中期因子(midkine)和AGR-2或其修饰形式或 同系物形式，m是0或1 ；
试剂盒进一步包含便于测定与配体结合的生物标记物浓度的试剂。在使用中，试剂盒 便于测定生物标记物水平。可以将这些水平与对照物或值的数据库进行比较。在另一个实 施方案中，对浓度进行运算(由包括与就该病症来说处于已知状态的患者的相同生物标记 物的水平的数据的第一知识库产生)，其中该运算提供具有或不具有病症的患者的概率指 数。本发明进一步提供了标记物的组(panel)，其包括[X]n、[Y]X^P [Z]m列表，其中 X是CA125或其修饰形式或同系物形式，η是0或1 ；
Y是选自IL-6、IL-8、CRP、SAA和SAP或其修饰形式或同系物形式的标记物，条件是，当 η是0时，Y包括两种或多种标记物，其中χ是0或1 ；和
Z是AGR-2或中期因子(midkine)和/或CA125或其修饰形式或同系物形式中的两种 或多种，m是0或1。试剂盒和基于知识的计算机软件和硬件也构成本发明的一部分。尤其是，本发明的测定法可以用于现有基于知识的结构或与病理服务有关的平 台。例如，将测定结果通过通信网络(例如国际互连网)传输到处理系统，在处理系统中， 保存并使用运算，以便产生预示的事后概率值，将该值译为疾病概率的指数，然后将该指数 以诊断或预测报告形式发送到最终用户。
因此，该测定法可以是试剂盒的形式或基于计算机的系统形式，其包括检测生物 标记物浓度所必需的试剂和计算机硬件和/或软件，从而便于测定和将报告传送给临床医 师。本发明的测定法可以整合到现有或新近发展的病理结构或平台系统中。例如，本 发明包括使用户确定患者有关妇科癌或其亚型或癌阶段的状态的方法，该方法包括
(a)通过通信网络以CA125 和 AGR-2、中期因子(midkine)、CRP、IL-6、IL-8、SAA 和 SAP中的一种或多种的水平或浓度的形式从用户处接收数据；
(b)通过多变量分析处理患者数据，提供病情指数值；
(c)按照病情指数值与预定值比较的结果确定患者的状态；和
(d)经由通信网络将患者状态的指示传输给用户，当提及多变量分析时，其包括执行 多变量分析功能的运算。合适地，该方法通常进一步包括
(a)使用户利用远端工作站测定数据；和
(b)通过通信网络将数据从终端站传输至基站。基站可以包括第一和第二处理系统，在这种情况下，该方法可以包括
(a)将数据传输至第一处理系统；
(b)将数据传输至第二处理系统；和
(c)使第一处理系统执行多变量分析功能，以便产生病情指数值。该方法还可以包括
(a)将多变量分析功能的结果传输至第一处理系统；和
(b)使第一处理系统确定患者的状态。在这种情况下，该方法还包括下列中的至少一种
(a)在通信网络和第一处理系统之间通过第一防火墙传输数据；和
(b)在第一和第二处理系统之间通过第二防火墙传输数据。第二处理系统可以与适合保存预测定数据和/或多变量分析功能的数据库连接， 该方法包括
(a)查询数据库，获得最低限度选择的预测定数据，或由数据库进入多变量分析功 能；和
(b)将选择的预测定数据与患者数据进行比较，或产生预示的概率指数。第二处理系统可以与数据库连接，该方法包括在数据库中保存数据。该方法还可以包括使用户利用可靠排列来测定数据，组成部分的可靠排列能够 测定生物标记物的水平，并且具有许多特征，这些特征各自位于相应编码的相应位置。在这 种情况下，该方法典型地包括使基站
(a)由数据确定编码；
(b)确定表明各个特征在排列上的位置的布局；和 (C)按照确定的布局和数据确定参数值。该方法还可以包括使基站
(a)确定支付信息，该支付信息代表用户的支付条款；和
(b)在对支付信息测定的响应过程中执行比较操作。
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本发明还提供了用于确定患者有关妇科癌或其亚型或癌阶段的状态的基站，该基 站包括
(a)保存方法；
(b)处理系统，该处理系统适合于
(i) 通过通信网络从用户处接收患者数据，该数据包括患者的两种或多种生物标记 物的水平或浓度，生物标记物选自AGR-2、中期因子(midkine)、CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA 和 SAP ；
( )执行算法功能，包括将数据与预测定数据进行比较； (iii)按照算法功能的结果(包括比较)，确定患者的状态；和
(c)通过通信网络将患者状态的指示输出至用户。处理系统可适合于从适合测定数据的远端工作站接收数据。该处理系统可以包括
(a)适合于下列的第一处理系统 (i)接收数据；和
( )按照多变量分析功能(包括比较数据)的结果，确定患者的状态；和
(b)适合于下列的第二处理系统 (i)从处理系统接收数据；和
( )执行多变量分析功能，包括比较；和 (iii)将结果传输至第一处理系统。基站典型地包括
(a)连接第一处理系统与通信网络的第一防火墙；和
(b)连接第一和第二处理系统的第二防火墙。处理系统可以与数据库连接，处理系统适合于将数据保存在数据库中。本发明的又一个方面涉及用两种或多种生物标记物的水平来检测患者卵巢癌或 其它妇科病症的用途，该生物标记物选自AGR-2、中期因子(midkine)、CA125、IL_6、IL-8、 CRP、SAA和SAP或其修饰形式或同系物形式。本发明的另一个方面提供了 AGR-2或中期因子(midkine)或其修饰形式或同系物 形式的水平在形成检测患者卵巢癌或其它妇科病症的测定法中的用途。甚至本发明的另一个方面提供了 AGR-2、中期因子(midkine)和CA125或其修饰形 式或同系物形式的水平在形成检测患者卵巢癌或其它妇科病症的测定法中的用途。附图的简要说明
图1是提供算法模型的图示，该算法产生患者具有或不具有妇科病症的概率指数。图2是说明生物标记物数据的模型和验证的图示。图3a和b是与病理平台连接的本发明测定法的略图，提供具有或不具有妇科癌的 患者的疾病概率指数的报告。图4和5是与病理平台连接的测定法的略图，提供报告，1.终端站；2.基站；3.客 户服务(例如，简单对象存取协议(SOAP)) ；4.通信网络(例如国际互连网)；LIMS，实验室 信息管理系统；测定法报告的例子示于图6中。图6是通过图3所示测定法产生的报告的数据表示法。
图7是显示正常人卵巢部分中的免疫活性(ir)-AGR_2的免疫组织化学位置的照 相表示法。正常卵巢上皮细胞(箭头)对ir-AGR-2始终显阴性(A，B)。在正常卵巢内的少 量包涵囊肿表明具有不同胞质的细胞(箭头)偶尔对ir-AGR-2进行染色(D)。A、C的放大 倍数是χ 200，B、D的放大倍数是x400。图8是显示从卵巢肿瘤得到的上皮细胞中ir-AGR-2的免疫组织化学位置的照相 表示法。(A)子宫颈内的良性粘质肿瘤类型。几乎所有上皮细胞显示了强烈的颗粒状细胞 质染色。细胞膜的基底和沿着细胞膜的染色尤其强烈。(B)浆液性界线肿瘤，其上皮细胞显 示出具有不同强度的强烈的颗粒状染色。(C)发育良好的腺性模式的高度分化的1级子宫 内膜肿瘤。在全部上皮细胞中，肿瘤显示出细胞群的强烈的颗粒状细胞质染色。在许多细 胞中，沿着细胞/细胞膜和顶表面，染色明显更强烈。(D)高度分化的腺性模式的1级子宫 内膜肿瘤。在腺体之内，肿瘤显示出稠密的颗粒状胞质染色，强度可变。(E)2级浆液性肿 瘤。轮廊分明的免疫活性细胞的岛状物存在于大量负染色的、中等分化的肿瘤内。染色是 颗粒状的，占据大部分细胞质，并且在顶端附近更密集地聚集。(F)显著分化不良的3级浆 液性肿瘤，具有分散状的孤立细胞群，对ir-AGR-2显示出强烈的、稠密的颗粒状染色。(G)3 级浆液性肿瘤部分，显示出残余性的、高度分化的、强烈免疫染色的腺体，接近分化不良的3 级肿瘤。(H)浆液性3级癌瘤，具有乳头型，显示出乳头内层的肿瘤细胞的强烈细胞质免疫 染色。(I); 3级明细胞癌，显示出典型的明细胞型。在肿瘤巢和索之内，有大量的胞质免疫 染色的细胞。(C、E、G和I的放大倍数是x200, A、B、D、F和H的放大倍数是x400)。图9是收集的人血浆样品的Western印迹的照相(使用亲合性纯化兔子抗AGR-2) (1:500)。从对照患者和确诊患有各种等级的浆液性、粘质和明细胞卵巢癌瘤的患者中获得 孤立等离子体样品(每组3-6个)。收集每个组中的等量孤立等离子体样品，并使用多亲合 性除去系统(Agilent)，耗尽上端六个血浆蛋白，以便浓缩残余的血浆蛋白并增强检测。然 后使用抗AGR-2，使用化学发光检测，对每个组的12 μ g等量的贫化血浆蛋白进行Western 印迹。在粘质和明细胞卵巢癌瘤血浆中，大约18 kDa的弱免疫活性类型(成熟型AGR-2) 是明显的，但在对照血浆或源于浆液性卵巢癌患者的血浆中不明显，表明ir-AGR-2的不同 表达和分泌与不同的卵巢肿瘤类型有关。许多高分子量免疫活性类型还用抗AGR-2抗体来 标记。这些类型在来源于不同卵巢肿瘤类型的患者的血浆样品中类似地被不同地表达。图10是表10所描述的ROC曲线分析的图示(将示于表9中的CA125和生物标记 物组(panel)进行比较，用模型样品亚组获得)。图11是表12所描述的ROC曲线分析的图示(将示于表11中的CA125和生物标 记物组(panel)进行比较，用验证样品亚组获得)。图12是表14所描述的ROC曲线分析的图示(将示于表13中的CA125和生物标 记物组(panel)进行比较，用全部样品组获得)。图13是表17所描述的ROC曲线分析的图示(将示于表9中的CA125和生物标记 物组(panel)进行比较，用模型样品亚组获得)。图14是表18所描述的ROC曲线分析的图示(将示于表11中的CA125和生物标 记物组(panel)进行比较，用验证样品亚组获得)。图15是表19所描述的ROC曲线分析的图示(将示于表13中的CA125和生物标 记物组(panel)进行比较，用全部样品组获得)。
图16是相对于正规样品的初期阶段卵巢癌患者中AGR-2的平均浓度+/-SEM的图示。图17是相对于对照样品的初期阶段(阶段I/II)卵巢癌患者中AGR-2的平均血 浆浓度+/-SEM的图示。图18是初期阶段(阶段I/II)卵巢癌患者和健康对照中AGR-2和CA125的血浆 浓度之间的相关性的图示。图19是表21所描述的ROC曲线分析的图示(作为独立的CA125和AGR-2，并且作 为两个标记物组(panel))。图20是相对于对照者的卵巢癌患者中AGR-2的血浆浓度的图示。该条形图表示 61个对照物和46个卵巢癌血浆样品(所有病例)的平均士SEM，卵巢癌样品中的35个代 表初期阶段(阶段I/II)疾病。*相对于对照物，P<0. 05。图21是相对于对照物的卵巢癌患者中AGR-2血浆浓度的平均士SEM(0，对照物； 1，浆液性类型OVCA ；2，子宫内膜癌；3，粘质性癌；4，mullerian混合型；5，明细胞)。详细说明
在本说明书中使用的单数形式“一种(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括多个方面， 除非上下文另外清楚地规定范围。由此，例如，对“一种生物标记物”的引证包括单个生物 标记物以及两种或多种生物标记物；对“一种分析物”的引证包括单一分析物或两种或多种 分析物；对“本发明”的引证包括本发明的一个和多个方面；等等。在本申请中具体说明的各种范围中使用的数值，除非另外明确地表示，否则以近 似值的形式陈述，就好象在陈述范围之内的最小和最大两个值之前加上词“大约”一样。用 这样的方式，高于和低于陈述范围的微小变化可用于获得基本上相同的结果，如同在该范 围之内的值。此外，公开的这些范围是连续范围形式，包括最小和最大值之间的每个值。另 外，本发明扩展至两种或多种标记物的比例，该比例提供与卵巢癌发展或存在的危险水平 有关的数值。为了鉴定妇科病症，提供了快速有效的和灵敏的测定法。妇科病症包括癌，例如卵 巢癌，或癌引起的并发症，或炎症性病症，例如子宫内膜异位。在一个具体实施方案中，该测 定法能够进行卵巢癌的早期检测。不仅如此，由于该测定法可以在妇科疾病或其治疗或由 其引起的任何并发症的任何阶段使用，所以本发明不只局限于卵巢癌的早期检测。关于“妇科病症”的“癌”的引证包括卵巢癌以及卵巢癌的亚型，例如粘质性或子 宫内膜卵巢癌，或卵巢癌的阶段，例如阶段Ι、Π、ΙΙΙ或IV。术语例如“卵巢癌”、“上皮细胞 的卵巢癌”和“卵巢恶性肿瘤”在本文中可互换使用。当应用于诊断有症状的女性时，尤其 可使用本发明，但也可以同样地用于诊断无症状的女性和/或处于形成妇科病症的高风险 中的女性。下面鉴定的是细胞因子或分析用的生物标记物，它们用于检测妇科病症，尤其是 卵巢癌或由其引起的并发症，或妇科炎症性病症。这些统称为“生物标记物”或“妇科病症 标记物“或“妇科病症的标记物”。在一个实施方案中，生物标记物选自AGR-2、中期因子(midkine)和/或CA125中 的两种或多种。在另一个实施方案中，选自11^-6、11^-8、0^、544和/或54 中的两种或多 种。在另一个实施方案中，生物标记物选自CA125和IL-6、IL-8、CRP、SAA和/或SAP中的一种或多种。在又一个实施方案中，生物标记物包括任选的CA125，IL-6、IL-8、CRP、SAA 和/或SAP中的两种或多种，其中至少一种后面的生物标记物可以被中期因子(midkine) 或AGR-2中的一或多种代替。尽管如此，本发明扩展至用另一种分析物替代任何一或多种 生物标记物，这些分析物共同或独立地有助于妇科病症的检测。另外，对AGR-2、中期因子 (midkine)、CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA和SAP中的任何一种或多种的引证包括其修饰形 式或同系物形式。修饰形式包括衍生物、多态变体、截短形式(截短)和团聚或复合形式， 或具有扩增组成部分的形式(例如，氨基酸扩增组成部分)。为了简便起见，对任何或一些 或所有生物标记物的引证包括这种修饰和同系物形式。由此，(复数个)生物标记物表示标记物组(panel)，其包括列出[X]n、[Y]x和[Z]m， 其中
X 是 CA125，n 是 或 1 ；
Y是选自IL-6、IL-8、CRP、SAA和SAP的标记物，条件是，当η是0时，Y包括两种或多 种标记物，其中χ是0或1 ；和
Z是AGR-2、中期因子(midkine)和/或CA125中的两种或多种，m是0或1。相应地，本发明的一个方面提供了用于确定患者妇科病症存在的测定法，该测定 法包括测定得自于患者的生物样品中的生物标记物的浓度，生物标记物选自AGR-2、中期 因子(midkine)、CA125中的两种或多种；CA125、IL_6、IL_8、CRP、SAA和SAP中的两种或多 种；IL-6、IL-8、CRP、SAA 和 SAP 中的两种或多禾中；或 CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA 和 SAP 中 的至少一种，和中期因子(midkine)或AGR-2中的至少一种；其中生物标记物相对于对照物 的水平变化提供妇科病症的存在的指示。在替代性实施方案中，本发明包括确定患者的妇科病症存在的测定法，该测定法 包括测定得自于患者的生物样品中的生物标记物的浓度，生物标记物选自AGR-2、中期因 子(midkine)和 / 或 CA125 中的两种或多种；CA125、IL_6、IL_8、CRP、SAA 和 / 或 SAP 中的 两种或多种；11^-6、11^-8、0^、544和/或54 中的两种或多种；或CA125、IL_6、IL_8、CRP、 SAA和/或SAP中的至少一种，和中期因子(midkine)和/或AGR-2中的至少一种；对该 水平进行运算，其中这种运算是由数据的第一知识库产生的，其包括就病症来说处于已知 状态的患者的相同生物标记物的水平，其中该运算提供具有或不具有病症的患者的概率指 数。对“运算”的引证是执行多变量分析功能的运算。在一个替代性实施方案中，本发明包括用于确定患者妇科病症存在的测定法，该 测定法包括测定得自于患者的生物样品中的AGR-2的浓度，其中AGR-2的浓度改变指示患 者具有妇科病症。按照该实施方案，可以单独筛查AGR-2的水平，或与其它生物标记物组合 筛查。在一个替代性实施方案中，本发明包括用于确定患者妇科病症存在的测定法，该 测定法包括测定得自于患者的生物样品中的中期因子(midkine)的浓度，其中中期因子 (midkine)的浓度改变指示患者具有妇科病症。按照该实施方案，可以单独筛查中期因子 (midkine)的水平，或与其它生物标记物组合筛查。本发明的后面的三个方面可以进一步包括测定CA125的浓度。在一个具体实施方案中，妇科病症是卵巢癌或由其引起的并发症，或卵巢癌的阶 段，例如阶段I或II或III或IV。
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在另一个实施方案中，本发明提供了用于确定患者卵巢癌存在的测定法，该测定 法包括测定得自于患者的生物样品中的生物标记物的水平，生物标记物选自AGR-2、中期 因子(midkine)、CA125中的两种或多种；CA125、IL_6、IL_8、CRP、SAA和SAP中的两种或多 种；IL-6、IL-8、CRP、SAA 和 SAP 中的两种或多禾中；或 CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA 和 SAP 中 的至少一种，和中期因子(midkine)或AGR-2中的至少一种；其中生物标记物的浓度变化指 示卵巢癌的存在。本发明的另一个方面包括用于确定患者卵巢癌存在的测定法，该测定法包括 测定得自于患者的生物样品中的生物标记物的水平，生物标记物选自AGR-2、中期因子 (midkine)、CA125中的两种或多种；CA125、IL_6、IL_8、CRP, SAA和SAP中的两种或多种； IL-6、IL-8、CRP、SAA 和 SAP 中的两种或多禾中；或 CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA 和 SAP 中的 至少一种，和中期因子(midkine)或AGR-2中的至少一种；对该水平进行运算，该运算是由 数据的第一知识库产生的，其包括就病症来说处于已知状态的患者的相同生物标记物的水 平，其中该运算提供具有或不具有病症的患者的概率指数。数据的第一知识库还可以源于许多患者。在另一个实施方案中，本发明包括用于确定患者卵巢癌存在的测定法，该测定法 包括测定得自于患者的生物样品中的AGR-2或中期因子(midkine)的浓度，其中AGR-2 或中期因子(midkine)的浓度改变指示患者具有卵巢癌。按照该实施方案，可以单独筛查 AGR-2、中期因子(midkine)的水平，或与其它生物标记物组合筛查。水平“改变”是指AGR-2 或中期因子(midkine)的浓度的提高或升高或浓度的减小或降低。该方面还可以包括测定CA125的浓度。相对于对照物，测定生物标记物的浓度或水平能够建立基于浓度的诊断规则。或 者，诊断规则基于统计和机械学习算法的应用。这种算法使用生物标记物和疾病状态之间 的关系(在培训数据(具有已知的疾病状态)中观察到的)，从而推断关联性，该关联性用 于预示未知状态患者的状态。使用算法可以提供患者具有妇科病症的概率指数。该算法执 行多变量分析功能。由此，在一个实施方案中，本发明提供了基于应用统计和机器学习算法的诊断规 则。这种算法使用生物标记物和疾病状态之间的关系(在培训数据(具有已知的疾病状 态)中观察到的)，从而推断关联性，用于预示未知状态患者的状态。数据分析领域熟练的 从业者可以判明，可以使用培训数据中的推断关联性的许多不同形式，而并不实质上改变 本发明。由此，本发明包括使用培训数据的知识库(其包括得自于患有妇科病症的患者 的生物标记物水平)，产生算法，当将其输入数据的第二知识库(其包括与具有未知妇科病 症患者相同生物标记物的水平)时，提供预示妇科病症的性质的概率指数。或者，AGR-2的水平改变预示妇科病症。或者，中期因子(midkine)的水平改变预示妇科病症。后两个方面还可以与CA125的改变水平组合。“患者”通常是女人。然而，本发明可以扩展至兽用。由此，患者可以是非人雌性哺 乳动物，例如牛、马、绵羊或非人灵长类动物。不仅如此，本发明尤其适用于检测女人的妇科癌症。
术语“培训数据”包括相对于对照物的生物标记物水平的知识。“对照”包括与没 有妇科病症或病症治愈的患者的生物标记物水平进行比较，或可以是基于实验的统计上测 定的水平。术语“水平”还包括生物标记物水平的比例。“培训数据”还包括AGR-2和/或中期因子(midkine)中的一种或多种的浓度。数 据可以包括关于AGR-2和/或中期因子(midkine)浓度增或减的信息。本发明进一步包括用于检测患者妇科病症的生物标记物的组(panel)，该 组(panel)包括与生物标记物特异性结合的试剂，生物标记物选自AGR_2、中期因子 (midkine)和CA125中的两种或多种；CA125、IL_6、IL_8、CRP、SAA和SAP中的两种或多种； IL-6、IL-8、CRP、SAA 和 SAP 中的两种或多种；和 CA125、IL_6、IL_8、CRP、SAA 和 SAP 中的至 少一种，和中期因子(midkine)或AGR-2中的至少一种，以便测定两种或多种生物标记物的 水平，而后对该水平进行运算，该运算是由数据的第一知识库产生的，其包括自就病症来说 处于已知状态的患者的相同生物标记物的水平，其中该运算提供具有或不具有病症的患者 的概率指数。尤其是，本发明提供了用于检测妇科病症的生物标记物的配体组(panel)，该组 (panel)包括对于下列的配体AGR_2、中期因子(midkine)或CA125中的两种或多种； CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA 或 SAP 中的两种或多种；IL-6、IL-8、CRP、SAA 或 SAP 中的两 种或多种；或CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA或SAP中的至少一种和中期因子(midkine)或 AGR-2中的至少一种。在一个替代性实施方案中，本发明包括用于检测患者妇科病症的生物标记物组 (pane 1)，该组(pane 1)包括与生物标记物特异性结合的试剂，生物标记物选自AGR-2、中期 因子(midkine)和CA125中的两种或多种；CA125、IL_6、IL_8、CRP、SAA和SAP中的两种或 多种；IL-6、IL-8、CRP、SAA 和 SAP 中的两种或多禾中；CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA 和 SAP 中 的至少一种和中期因子(midkine)或AGR-2中的至少一种，从而测定两种或多种生物标记 物的水平，其中生物标记物的水平变化预示妇科病症。本文所涉及的生物标记物的组合包括两个生物标记物至九个生物标记物，例如2、 3、4、5、6、7、8或9个生物标记物。生物标记物的水平或浓度提供输入的试验数据(本文指 的是“数据的第二知识库”)。数据的第二知识库被认为与对照物相关联，或将其输入到运 算中，该运算是由“数据的第一知识库”产生的，其包括具有已知妇科病症的患者的生物标 记物水平的信息。数据的第二知识库得自于就妇科病症来说处于未知状态的患者。运算的 计算结果是具有具体妇科病症或不具有病症的患者的概率或危险因数，本文指的是概率指 数。两种或多种生物标记物包括和包含CA125，AGR-2 ；CA125,中期因子(midkine)； CA125, IL-6 ；CA125, IL-8 ；CA125, CRP ；CA125, SAA ；CA125, SAP ；CA125 ；IL-6，IL-8 ；IL-6， CRP ；IL-6, SAA ；IL-6，SAP ；IL-6 ；IL-6,中期因子(midkine) ；IL-6，AGR-2 ；IL-8，CRP ； IL-8, SAA ；IL-8 SAP ；IL-8 ；IL-8,中期因子(midkine) ；IL-8，AGR-2 ；CRP, SAA ；CRP, SAP ； CRP ；CRP，中期因子(midkine) ；CRP, AGR-2 ；SAA, SAP ；SAA ；SAA，中期因子(midkine) ；SAA, AGR-2 ；SAP ；SAP，中期因子(midkine) ；SAP, AGR-2 ；和中期因子(midkine), AGR-2。此夕卜， 本发明扩展至数据的第二知识库，其包括两种或多种标记物的比例，例如，下列标记物的 比例CA125，IL-6 ；CA125, IL-8 ；CA125, CRP ；CA125, SAA ；CA125, SAP ；CA125 ；CA125,中期因子(midkine) ；CA125, AGR-2 ；IL-6，IL-8 ；IL-6，CRP ；IL-6，SAA ；IL-6，SAP ；IL-6 ；IL-6， 中期因子(midkine) ；IL-6，AGR-2 ；IL-8，CRP ；IL-8，SAA ；IL-8 SAP ；IL-8 ；IL-8，中期因子 (midkine) ；IL-8，AGR-2 ；CRP, SAA ；CRP, SAP ；CRP ；CRP,中期因子(midkine) ；CRP, AGR-2 ； SAA, SAP ；SAA ；SAA，中期因子(midkine) ；SAA, AGR-2 ；SAP ；SAP，中期因子(midkine) ；SAP, AGR-2 ；和中期因子(midkine)，AGR-2。在替代性实施方案中，以AGR-2或中期因子(midkine)的形式监控单个生物标记 物。此外，可以与一或多种其它标记物组合筛查AGR-2或中期因子(midkine)。CA125也可 以按照本发明的该方面来测定。与生物标记物“特异性结合”的试剂通常包括免疫交互作用的分子，例如，抗体或 杂交衍生物，包括其重组体或修饰形式或其抗原结合片段。该试剂也可以是受体或其它配 体。这些试剂帮助测定生物标记物的水平。有关水平的信息是运算的输入数据。由此，本发明进一步提供了对下列的固定配体的组(panel) :AGR_2、中期因子 (midkine)和/或CA125中的两种或多种；CA125、IL_6、IL_8、CRP、SAA和/或SAP中的两种 或多种；IL-6、IL-8、CRP、SAA 和 / 或 SAP 中的两种或多种；或 CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA 和/或SAP中的至少一种和中期因子(midkine)和/或AGR-2中的至少一种。本发明的另一个方面包括用于确诊妇科病症存在或不存在的试剂盒，该试剂盒包 括包含组成部分[χ]η、γ和[Zlffl的物质的组合物，其中
X是生物标记物的配体，生物标记物选自CA125，η是0或1 ；
Y是生物标记物的配体，生物标记物选自下表，包括当η是0时，生物标记物选自 IL-6、IL-8、CRP、SAA和SAP中的两种或多种，或当η是1时，生物标记物选自IL_6、IL-8、 CRP、SAA和SAP中的至少一种；和
Z是生物标记物的配体，生物标记物选自中期因子(midkine)和AGRUP m是0或1 ； 该试剂盒进一步包括便于测定与配体结合的生物标记物的浓度的试剂。在使用中，试 剂盒便于测定生物标记物。然后将该水平与对照物进行比较，或对其进行运算(由包括自 就病症来说处于已知状态的患者的相同生物标记物的水平的数据的第一知识库产生)，其 中该运算提供具有或不具有病症的患者的概率指数。试剂盒或者可以包括检测单独的AGR-2或中期因子(midkine)的浓度或与CA125 的组合的浓度的试剂。本发明进一步提供了标记物的组(panel)，其包括列表数据[Χ]η、[Z]m，其 中
X 是 CA125，n 是 或 1 ；
Y是选自IL-6、IL-8、CRP、SAA和SAP的标记物，条件是，当η是0时，Y包括两种或多 种标记物，其中χ是0或1 ；和
Z是AGR-2、中期因子(midkine)和/或CA125中的两种或多种，m是0或1。配体(例如，对每个生物标记物具有特异性的抗体)能够定量或定性检测或测定 至少两种或多种生物标记物的水平。对“水平”的引证包括下列形式的浓度重量/体积， 活性/体积或单位/体积，或其它方便的表示式，以及水平的比例。本发明进一步涉及用于检测患者卵巢癌症的测定法，该测定法包括使来源于 患者的样品和与下列结合的固定配体接触一段时间AGR-2、中期因子(midkine)和/或
18CA125中的两种或多种；CA125、IL_6、IL_8、CRP、SAA和/或SAP中的两种或多种；IL-6、 IL-8、CRP、SAA和/或SAP中的两种或多种；或CA125、IL_6、IL_8、SAA和/或SAP中的至 少一种和中期因子(midkine)和/或AGR-2中的至少一种，并且接触是在足以使生物标记 物与配体结合的条件下进行，而后检测结合水平，其表示生物标记物的浓度，其中生物标记 物的水平变化预示卵巢癌。在一个替代性实施方案中，本发明涉及用于检测患者卵巢癌的测定法，该测定 法包括使来源于患者的样品和与下列结合的固定配体接触一段时间AGR-2、中期因子 (midkine)和 / 或 CA125 中的两种或多种；CA125、IL_6、IL_8、CRP、SAA 和 / 或 SAP 中的两 种或多种；IL-6、IL-8、CRP、SAA和/或SAP中的两种或多种；或CA125、IL_6、IL_8、SAA和 /或SAP中的至少一种和中期因子(midkine)和/或AGR-2中的至少一种，并且接触是在生 物标记物与配体能够充分结合的条件下进行，而后检测结合水平，这可以预示生物标记物 的浓度，并对该浓度进行运算，这种运算是使用具有卵巢癌的患者的生物标记物水平产生 的，从而提供具有或不具有卵巢癌的患者的概率指数。在另一个替代性实施方案中，本发明提供了用于检测患者卵巢癌症的测定法，该 测定法包括使来源于患者的样品与AGR-2或中期因子(midkine)的固定配体接触一段时 间，并且接触是在能够使AGR-2或中期因子(midkine)与它的配体结合的条件下进行，其提 供AGR-2或中期因子(midkine)的浓度的指示，或其中AGR-2或中期因子(midkine)的浓 度改变预示卵巢癌症。该方面还可以与测定CA125的浓度进行组合。“样品”通常是血液，血浆或血清，腹水，淋巴液，组织渗出液，粘液，尿或呼吸液体。 或者，样品是正在进行组织学检验的组织样品。通过鉴定存在于卵巢癌症患者中的标记物的水平，和用于鉴定哪些标记物和标 记物组可有效用于鉴定卵巢癌症患者中所使用的统计方法，本领域普通技术人员基于 本文公开的内容，可以鉴定能够提供优良选择性和灵敏性的组(panel)。提供鉴别性能 的组(panel)的例子包括但不限于生物标记物，包括CA125，AGR-2 ；CA125,中期因子 (midkine) ；CA125, IL-6 ；CA125, IL-8 ；CA125, CRP ；CA125, SAA ；CA125, SAP ；CA125 ；CA125, 中期因子；CA125, AGR-2 ；IL-6，IL-8 ；IL-6，CRP ；IL-6，SAA ；IL-6，SAP ；IL-6 ；IL-6,中 期因子(midkine) ；IL-6，AGR-2 ；IL-8，CRP ；IL-8，SAA ；IL-8 SAP ；IL-8 ；IL-8,中期因子 (midkine) ；IL-8，AGR-2 ；CRP, SAA ；CRP, SAP ；CRP ；CRP,中期因子(midkine) ；CRP, AGR-2 ； SAA, SAP ；SAA ；SAA,中期因子(midkine) ；SAA, AGR-2 ；SAP,中期因子(midkine) ；SAP, AGR-2;和中期因子(midkine)，AGR-2。组(panel)也可以包括上述生物标记物的配体。组(panel)也可以包括单独的AGR-2，或其与一种或多种其它标记物的组合。组(panel)也可以包括单独的中期因子(midkine)，或其与一种或多种其它标记 物的组合。如上所指出，“配体”或“结合剂”和类似术语是指能够特异性或基本上特异性地 (有限的交叉反应性)与生物标记物上的表位结合的任何化合物、组合物或分子。“结合剂” 通常具有单一特异性。不仅如此，本文也包括对于两种或多种生物标记物具有多重特异性 的结合剂。结合剂(或配体)典型地是抗体，例如单克隆抗体，或其衍生物或类似物，还包 括但不限于Fv片段；单链Fv(ScFv)片段；Fab'片段；F (ab’)2片段；人源化抗体和抗体 片段；骆驼化(camelized)抗体和抗体片段；和上述的多价形式。视情况而定，还可以使用多价结合剂，包括但不限于单特异性或双特异性抗体；例如二硫化物稳定化的Fv片段， scFv串列[(ScFv)2片段]，二价二聚体，三聚体或四聚体，其典型地是共价连接的或者稳定 化的(即亮氨酸拉链或螺旋稳定化)scFv片段。“结合剂”还包括本领域所描述的适体。制备抗原-特异结合试剂(包括抗体和它们的衍生物和类似物和适体)的方法在 本领域是众所周知的。多克隆抗体可以通过动物的免疫而产生。单克隆抗体可以按照标准 (杂交瘤)方法制备。抗体衍生物和类似物(包括人源化抗体)可以如下制备通过从编 码单克隆抗体的DNA中分离DNA片段来进行重组，并且按照标准方法将合适的V区域亚克 隆到合适的表达载体上。在文献中描述了噬菌体展示和适体技术，并且可以进行抗原-特 异性结合试剂(具有亲合性非常低的交叉反应性)的体外纯系扩增。噬菌体展示试剂和 系统可以商业上获得，并且包括重组噬菌体抗体系统(RPAQ (可从Amersham Pharmacia Biotech, Inc. of Piscataway, New Jersey 商购)和 pSKAN 噬粒显示系统(可从 MoBiiTec, LLC of Marco Island，Florida商购)。适体技术例如(但不限于)描述在美国专利 5，270，163,5, 475，096,5, 840，867 和 6，544，776 中。ECLIA、ELISA和Luminex LabMAP免疫测定是检测生物标记物水平的合适测定法 的例子。在一个实施例中，第一个结合试剂/抗体与表面相连接，第二个结合试剂/抗体 (包括可检测组)与第一个抗体结合。可检测组的例子包括，例如但不限于荧光色素，酶， 结合第二个结合试剂的表位(例如，当第二个结合试剂/抗体是小鼠抗体时，其是通过荧光 标记的抗小鼠抗体检测的)，例如，抗原或结合对的成员，例如生物素。表面可以是二维表 面，例如，在典型的栅型排列(例如但不限于96孔平皿和二维微阵列)或非二维平面(如 同包衣珠粒排列技术)的情况下，其中每个“类型”的珠粒用例如荧光色素(例如，描述在 美国专利6，599，331，6，592，822和6，268，222中的Luminex技术)或量子点技术(例如， 如美国专利6，306，610所述的技术)进行标记。还可以认为这种测定法是实验室信息管理 系统(LIMS)。在珠粒型免疫测定中，可以使用Luminex LabMAP系统。LabMAP系统结合聚苯乙 烯微球体，其被两种光谱不同的荧光色素内部染色。使用精确比例的这些荧光色素，形成 由100个不同的微球体组(具有特异性光谱归属)组成的排列。每个微球体组可以在它 的表面上具有不同的反应物。因为微球体组可以通过它们的光谱归属来加以区别，所以， 可以将它们合并，使得可以在单一反应容器中同时测定高达100个不同的分析物。与报 道分子连接的第三个荧光色素测定微球体表面出现的生物分子的相互作用。当微球体通 过Luminex分析器中的两个独立的激光时，微球体在快速流动的液体流中独立地被探测 (interrogated)。高速数字信号处理基于微球体的光谱归属将微球体分类，并且在几秒钟 内定量每个样品表面上的反应。本文使用的“免疫测定”是指免疫测定法，典型地(但不是专有地)是能够检测和 测定目标生物标记物的夹心测定法，生物标记物是CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA、SAP、中期 因子(midkine)和/或AGR-2中的一种。由测定两个、三个或四个或五个或六个或七个或八个或九个标记物(CA125， AGR-2，中期因子(midkine)，IL_6，IL_8，CRP, SAA和/或SAP)的液体或组织水平的测定法 所产生的数据可用于确定患者的妇科病症的可能性或进展。将包括两种或多种生物标记物 水平的数据输入与对照物相比，或将其输入算法中，提供患者具有例如卵巢癌症的可能性的危险值。还可以监控治疗方式以及复发的可能性。在本公开的上下文中，“液体”包括任何血液部分，例如血清或血浆，可以按照本文 描述的方法对它们进行分析。对于测定具体生物标记物的血液水平，其是指可以测定血液 水平的任何合适的血液部分，并且以存在于该部分中的值的形式报告数据。本文涉及的其 它液体包括腹水，组织渗出液，尿，淋巴液，粘液和呼吸液体。如上所述，提供了通过测定特异性鉴定的生物标记物的水平，并且在用第一知识 库数据或与已知疾病患者的相同的生物标记物水平所产生的算法中使用这些水平作为第 二知识库数据，来确诊妇科病症的方法。还提供的是检测临床前卵巢癌症的方法，包括测定 患者样品中特异性鉴定的生物标记物的存在和/或速率。“速率”是指患者样品中的生物标 记物的浓度随着时间推移的变化。如上所指出，妇科病症包括癌症或其并发症。本文使用的术语“癌症”包括“妇科 癌症”通常所包含的所有癌症。在一个实施方案中，妇科癌症包括但不限于输卵管组织变 形，卵巢浆液性界线肿瘤，浆液性恶性腺瘤，轻度粘质肿瘤和子宫内膜肿瘤。在一个具体实 施方案中，妇科癌症是进行异常Mullerian上皮细胞分化的卵巢肿瘤。本文涉及的其它妇 科病症包括炎症性病症，例如子宫内膜异位。本文使用的术语“样品”是指包含希望检测的癌细胞的任何样品，包括但不限于 生物流体(包括血液，血浆，血清，腹水)，组织提取物，刚采收的细胞和在细胞培养物中培 养的细胞的溶胞产物。在一个具体实施方案中，样品是妇科组织，血液，血清，血浆或腹水。如上所指出，“患者”可以是怀疑具有妇科病症的任何哺乳动物，通常是人。患者可 以称为病员，并且是怀疑具有妇科病症或处于形成妇科病症危险之中的雌性哺乳动物。术 语“病症”还包括由其引起的并发症。 术语“对照样品，，包括可用于建立第一知识库数据(得自于具有已知疾病状态的 患者)的任何样品。本发明方法可以用于妇科病症的诊断和分期，例如妇科癌症，包括卵巢癌症。本发 明还可以用于监控病症的进展、监控具体治疗是否有效。尤其是，该方法可用于确认例如手 术、化疗和/或放射治疗之后病症的病症的不存在或改善。该方法可以进一步用于监控化 疗和异常组织再现。在一个实施方案中，本发明涉及监控患者的妇科病症的进展的方法，包括
(a)提供患者的样品；
(b)测定下列的水平AGR-2、中期因子(midkine)和/或CA125中的两种或多种； CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA、SAP、中期因子(midkine)和/或AGR-2生物标记物中的两种 或多种；或单独的AGR-2或中期因子(midkine)，并且对该水平进行运算，以便提供具有妇 科病症的患者概率指数；和
(c)在后面的时间点重复步骤(a)和(b)，并且将步骤(b)的结果与步骤(c)的结果 进行比较，其中概率指数的差别预示患者病症的进展。在一个替代性实施方案中，本发明涉及监控患者的妇科病症的进展的方法，包 括
(a)提供患者的样品；
(b)测定下列的水平AGR-2、中期因子(midkine)和/或CA125中的两种或多种；
21CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA、SAP、中期因子(midkine)和/或AGR-2生物标记物中的两种 或多种；或单独的AGR-2或中期因子(midkine)，并且将该水平与对照物进行比较，其中该 水平的变化提供具有妇科病症的患者概率指数；和
(c) 在后面的时间点重复步骤(a)和(b)，并且将步骤(b)的结果与步骤(c)的结果 进行比较，其中概率指数的差别预示患者病症的进展。尤其是，在后面的时点中，疾病症状的概率指数升高可以表示病症正在发展，并且 该治疗(如果合适的话)不是有效的。与此相反，在后面的时点中，概率指数的减小可以表 示病症正在复原，并且该治疗(如果合适的话)是有效的。在另一个实施方案中，提供了确定患者的妇科癌症是否为良性的方法，包括
(a)提供患者的样品；
(b)测定下列的水平AGR-2、中期因子(midkine)和/或CA125中的两种或多种； CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA、SAP、中期因子(midkine)和/或AGR-2生物标记物中的两种 或多种，或单独的AGR-2或中期因子(midkine)，并且对该水平进行运算，以便提供患者具 有妇科癌症的概率指数；和
(c)监控随时间变化的概率指数，如果指数随着时间的推移而降低，表示癌症是良 性的。在进一步实施方案中，提供了确定患者妇科癌症是否为良性的方法，包括
(a)提供患者的样品；
(b)测定下列的两种或多种的水平AGR-2、中期因子(midkine)和/或CA125 ； CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA、SAP、中期因子(midkine)和/或AGR-2生物标记物，或单独的 AGR - 2或中期因子(midkine)，并且将该水平与对照物进行比较，其中该水平的变化提供 具有妇科癌症患者的概率指数；和
(c)监控随时间变化的概率指数，如果指数随着时间的推移而降低，表示癌症是良 性的。在本发明的一个实施方案中，提供了区分非侵入性和侵入性妇科癌症的方法，包 括
(a)提供患者的样品；
(b)测定下列的两种或多种的水平AGR-2、中期因子(midkine)和/或CA125；CA125、 IL-6、IL-8、CRP、SAA、SAP、中期因子(midkine)和/或AGR-2生物标记物，或单独的AGR -2或中期因子(midkine)；和
(c)比较随时间变化的概率指数，并且对该水平进行运算，以便提供具有妇科病症患 者的概率指数，其中指数升高表示癌症是侵入性的。在本发明的进一步实施方案中，提供了区分非侵入性和侵入性妇科癌症的方法， 包括
(a)提供患者的样品；
(b)测定下列的两种或多种的水平AGR-2、中期因子(midkine)和/或CA125；CA125、 IL-6、IL-8、CRP、SAA、SAP、中期因子(midkine)和/或AGR-2生物标记物，或单独的AGR -2或中期因子(midkine)；和
(c)比较随时间变化的概率指数，并且将该水平与对照物进行比较，其中水平的变化 22提供具有妇科癌症患者的概率指数。在另一个实施方案中，本发明涉及确定患者形成妇科肿瘤的潜在危险的方法，包 括
(a)提供患者的样品；
(b)测定下列的两种或多种的水平AGR-2、中期因子(midkine)和/或CA125；CA125、 IL-6、IL-8、CRP、SAA、SAP、中期因子(midkine)和/或AGR-2生物标记物，或单独的AGR - 2 或中期因子(midkine)，并且对该水平进行运算，以便提供具有妇科病症患者的概率指数； 和
(c)比较随时间变化的概率指数，其中指数减小表示患者形成妇科肿瘤的危险低。在进一步实施方案中，本发明涉及确定患者形成妇科肿瘤的潜在危险的方法，包 括
(a)提供患者的样品；
(b)测定下列的两种或多种的水平AGR-2、中期因子(midkine)和/或CA125；CA125、 IL-6、IL-8、CRP、SAA、SAP、中期因子(midkine)和/或AGR-2生物标记物，或单独的AGR -2或中期因子(midkine)，并且将该水平与对照物进行比较，其中该水平的变化提供具有妇 科癌症患者的概率指数；和
(c)比较随时间变化的概率指数，其中指数减小表示患者形成妇科肿瘤的危险低。就测定单独的AGR-2或中期因子(midkine)的浓度而论，认为AGR-2或中期因子 (midkine)中的一种或多种的浓度改变(即增或减)是提高疾病症状存在的概率指数。该 方面还可以与测定CA125的浓度进行组合。如上所指出，抗体可以用于许多免疫测定中的任一项，这种免疫测定依赖于生物 标记物的抗原定子和抗体之间的结合相互作用。这种测定法的例子是放射免疫测定，酶免 疫分析(例如ECLIA，ELISA)，免疫荧光，免测沉淀，乳液凝集，血凝反应和组织化学试验。抗 体可以用于检测和测定样品中的生物标记物的水平，以便确定其在癌症中的作用和确诊癌症。尤其是，本发明的抗体还可以用于免疫组织化学的分析，例如，在细胞和亚细胞水 平条件下，检测生物标记物，将其定位至具体细胞和组织，和具体亚细胞位置，并且测定表 达的水平。使用光和电子显微术来定位抗原的本领域已知的细胞化学技术可以用于检测生 物标记物。通常，本发明的抗体可以用可检测的物质标记，并且可以基于可检测物质的存 在，将生物标记物蛋白定位在组织和细胞中。可检测物质的例子包括但不局限于下列放 射性同位素(例如3H, 14C，35S，125I，131I)，荧光标记物(例如FITC，若丹明，镧系磷光体)，荧光 标记物，例如鲁米诺；酶催标记物(例如辣根过氧化酶，β-半乳糖苷酶，荧光素酶，碱性磷 酸酶，乙酰胆碱酯酶)，生物素基(可以通过明显的抗生物素蛋白(例如包含可通过光学或 量热法检测的荧光标记物或酶活性的抗生蛋白链菌素)检测)，通过二级指示器辨别的预 先确定的多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列，二抗的结合位点，金属结合区域；附加表位)。 在一些实施方案中，标记物通过各种长度的间隔臂相连接，以便降低潜在的空间位阻。抗体 还可以与容易用电子显微术显像的电子稠密物质连接，例如铁蛋白或胶体金。抗体或样品可以固定在能够固定细胞、抗体等等的载体或固体支撑物上。例如，载
23体或支撑物可以是硝化纤维，或玻璃，聚丙烯酰胺，辉长岩和磁铁。支撑物材料可以具有任 何合适的构型，包括球形(例如珠粒)，柱形(例如试管或孔的内表面，或棒的外表面)，或 平面(例如薄片，试验片条)。还可以使用间接法，在这种方法中，通过弓I入第二个抗体来扩 增原来的抗原抗体反应，其中第二个抗体对于针对生物标记物蛋白具有反应性的抗体具有 特异性。例如，如果针对生物标记物蛋白具有特异性的抗体是兔IgG抗体，那么第二个抗体 可以是用本文所描述的可检测物质标记的山羊抗兔Y-球蛋白。如果放射性标记物用作可检测的物质，则生物标记物可以通过自射线照相术来定 位。利用各种光学法或通过统计颗粒来测定放射自显影照片中的颗粒密度，可以测定自动 射线照相术的结果。针对生物标记物蛋白的标记抗体可以用于定位进行手术患者的肿瘤组织，即成 像。典型地，对于体内应用，用放射性标记物(例如碘-123，碘-125，碘-131，镓-67，锝-99 和铟-111)标记抗体。可以用合适的载体将标记的抗体制剂在几小时至四天的时间静脉内 给予患者，而后进行组织成像。在这期间，未结合的部分从患者中清除，只有残留的抗体是 与肿瘤组织缔合的那些抗体。使用合适的Y照相机来检测同位素的存在。标记的组织可 以与患者身体上的已知的标记物相关联，以便外科医生精确定位肿瘤的位置。相应地，在另一个实施方案中，本发明提供了检测患者癌症的方法，包括
(a)提供患者的样品；
(b)使样品与抗体接触，其中抗体与AGR-2、中期因子(midkine)、CA125、IL-6、 IL-8、CRP、SAA和/或SAP生物标记物结合，以便测定两种或多种生物标记物的水平或单独 的AGR-2或中期因子(midkine)的水平或其与CA125的组合的水平，并对该水平进行运算， 以便提供具有妇科病症患者的概率指数；和
(c)基于该概率指数，判断患者具有癌症的危险。或者，本发明提供了检测患者癌症的方法，包括
(a)提供患者的样品；
(b)使样品与抗体接触，其中抗体与AGR-2、中期因子(midkine)、CA125、IL-6、 IL-8、CRP、SAA和/或SAP生物标记物结合，以便测定两种或多种生物标记物的水平或单独 的AGR-2或中期因子(midkine)的水平或其与CA125的组合的水平，并将该水平与对照物 进行比较，其中水平变化可以提供具有妇科病症患者的概率指数；和
(c)基于该概率指数，判断患者具有癌症的危险。本文所描述的本发明方法还可以使用微阵列来进行，例如寡核苷酸阵列，cDNA阵 列，基因组DNA阵列，或组织阵列。优�。罅惺亲橹⒄罅�。在一个实施方案中，本发明方法包括检测编码生物标记物的核苷酸分子的表达， 并基于表达水平来测定生物标记物的水平。本领域技术人员可以构建核苷酸探针，用于检 测样品中编码生物标记物的mRNA序列。合适的探针包括核苷酸分子，其基于编码生物标 记物区域的至少五个连续氨基酸的核苷酸序列，优选它们包含15至30个核苷酸。核苷酸探 针可以用可检测的物质标记，例如可以提供合适信号并具有足够半衰期的放射性标记物， 例如32P、3H、MC等等。可以使用的其它可检测的物质包括抗原，其是通过具体标记的抗体、 荧光化合物、酶、对标记抗原特异性的抗体和荧光化合物来加以辨别的。考虑杂交速率、探 针与所检测核苷酸的结合、和可用于杂交的核苷酸的数量，可以选择合适的标记物。标记的
24探针在通常描述在下列这种的固体载体例如硝化纤维素过滤器或尼龙膜上杂交为核苷酸 Sambrook %KMolecular Cloning, A Laboratory Manual. (2nd ed. ), 1989。核^f酸探 针可以用于检测编码生物标记物的基因，优选在人细胞中。核苷酸探针还可有效用于诊断 涉及生物标记物的病症、监控这种病症的发展或监控治疗方法。在一个实施方案中，探针用 于诊断妇科癌症例如卵巢癌症和监控其发展。探针可以用于杂交技术，检测编码生物标记物蛋白的基因的表达。该技术通常包 括在有利于探针特异性退火为核苷酸中的互补序列的条件下，使从患者或其它细胞源得 到的样品所获得的核苷酸Gf^nmRNA)与探针接触，并进行培养。培养之后，除去没有退火 的核苷酸，并检测已经与探针杂交的核苷酸(如果有的话)的存在。mRNA的检测可以包括将mRNA转化为cDNA，和/或，使用扩增方法，例如聚合酶链 式反应(PCR)，将特异基因序列扩增，而后使用本领域技术人员已知的技术来分析扩增的分 子。本领域技术人员可以常规地设计合适的引物。本文描述的杂交和扩增技术可以用于测定编码生物标记物的基因表达的定性和 定量方面。例如，可以从已知表达编码生物标记物的基因的细胞类型或组织中分离RNA，并 且使用本文引证的杂交(例如标准Northern分析)或PCR技术对其进行试验。该技术可以 用于检测转录物大小的差别，这种差别可能是由于正常或异常改变剪接造成的。该技术可 以用于检测全长和/或改变剪接转录物(在正常个体(相对于显示癌症症状的那些个体) 中检测到的，包括生物标记物蛋白或基因)的水平之间的量的差别。在上述方法中，可以原位使用引物和探针，S卩，直接在由活检或切除术所获得的患 者组织的组织切片(固定和/或冷冻)上使用。相应地，本发明提供了检测患者癌症的方法，包括
(a)提供患者的样品；
(b)从样品的生物标记物基因或其部分中提取包含mRNA的核苷酸分子；
(c)使用聚合酶链式反应将提取的mRNA扩增；
(d)测定编码生物标记物的mRNA的水平；和
(e)对两种或多种生物标记物的水平进行运算，提供具有癌症患者的概率指数。生物标记物mRNA 选自编码 AGR-2、中期因子(midkine)、CA125、IL-6、IL-8、CRP、 SAA和/或SAP中的两种或多种的mRNA。通过使用预先包装的诊断试剂盒(其包含进行本发明任何方法的必要的试剂)， 可以进行本文所描述方法。例如，试剂盒可以包含至少一种本文所描述的特异性核苷酸或 抗体，可以合适地使用它们，例如，在临床环境中，筛查和诊断患者，筛查和鉴定那些显示出 形成癌症倾向的个体。该试剂盒还可以包含在聚合酶链式反应中用于扩增编码生物标记物 的核苷酸的核苷酸引物。该试剂盒还可以包含用于本发明方法的核苷酸、酶和缓冲液以及 电泳标记物，例如200 bp梯状链。试剂盒还包含进行本发明方法的详细说明书。本发明进一步提供了基于运算的筛查测定法，以便筛查患者的样品。通常，基于两 种或多种生物标记物的水平(或编码两种或多种生物标记物的基因的表达水平)来收集输 入数据，并且对其进行运算，以便评价水平的任何升高或降低的统计显著性，然后将该信息 作为输出数据。用于评价输入数据的计算机软件和硬件包括在本发明范围内。本发明的另一个方面涉及治疗患有妇科病症例如卵巢癌症的患者的方法，该方法
25包括对患者进行诊断测定，以便测定患者具有病症的概率指数，生物标记物选自AGR_2、 中期因子(midkine)和/或CA125中的两种或多种；CA125、IL-6、IL_8、CRP、SAA和/或SAP 中的两种或多种；IL-6、IL-8、CRP、SAA和/或SAP中的两种或多种；或CA125、IL_6、IL-8、 CRP、SAA和/或SAP中的至少一种，和中期因子(midkine)和/或AGR-2中的至少一种；如 果患者具有病症的危险，那么对患者进行手术切除术、化疗和/或放射治疗；而后监控概率 指数随着时间推移的变化。第二个检测的生物标记物可以与第一个检测的生物标记物相同或不同。本发明进一步提供了两种或多种生物标记物的水平在形成用于诊断测定的概率 指数中的用途，该诊断测定法用于检测患者卵巢癌症，生物标记物选自CA125、IL-6、IL-8、 CRP、SAA 禾口 SAP。本发明的另一个方面提供了两种或多种生物标记物在形成用于诊断测定法的运 算中的用途，该诊断测定法用于检测患者卵巢癌症，生物标记物选自CA125、IL-6、IL-8、 CRP、SAA 禾口 SAP。本发明的另一个方面提供了 AGR-2的水平在形成检测患者卵巢癌或其它妇科症 状的测定法中的用途。本发明的测定法可以整合到现有或新近发展的病理结构或平台系统中。例如，本 发明涉及使用户确定患者有关妇科癌症或其亚型或癌症阶段的状态的方法，该方法包括
(a)通过通信网络接收用户的CA125和AGR-2、中期因子(midkine)、CRP、IL-6、IL-8、 SAA和SAP中的一种或多种的水平或浓度形式的数据；
(b)通过运算处理患者数据，提供病情指数值；
(c)按照病情指数值与预定值比较的结果确定患者的状态；和
(d)通过通信网络将患者状态的指示传输至用户。合适地，该方法通常进一步包括
(a)使用户利用远终端工作站测定数据；和
(b)通过通信网络将数据从终端站传输至基站。基站可以包括第一和第二处理系统，在这种情况下，该方法可以包括
(a)将数据传输至第一处理系统；
(b)将数据传输至第二处理系统；和
(c)使第一处理系统执行算法的功能，以便产生病情指数值。该方法还可以包括
(a)将算法功能的结果传输至第一处理系统；和
(b)使第一处理系统确定患者的状态。在这种情况下，该方法还包括下列中的至少一种
(a)在通信网络和第一处理系统之间通过第一防火墙传输数据；和
(b)在第一和第二处理系统之间通过第二防火墙传输数据。第二处理系统可以与适合保存预测定数据和/或运算的数据库连接，该方法包 括
(a)查询数据库，获得最低限度选择的预测定数据，或使从数据库进入算法；和
(b)将选择的预测定数据与患者数据进行比较，或产生预示的概率指数。
第二处理系统可以与数据库连接，该方法包括在数据库中保存数据。该方法还可以包括使用户利用可靠排列来测定数据，组成部分的可靠排列能够 测定生物标记物的水平，并且具有许多特征，这些特征各自位于相应编码的相应位置。在这 种情况下，该方法典型地包括使基站
(a)由数据确定编码；
(b)确定表示各个特征在排列上的位置的布局(layout)；和
(c)按照确定的布局和数据确定参数值。该方法还可以包括使基站
(a)确定支付信息，支付信息代表用户的支付条款；和
(b)在对支付信息测定的响应过程中进行比较。本发明还提供了用于确定患者有关妇科癌或其亚型或癌阶段的状态的基站，该基 站包括
(a)保存方法；
(b)处理系统，处理系统适合于
(i) 通过通信网络从用户处接收患者数据，该数据包括患者的两种或多种生物标记 物的水平或浓度，生物标记物选自AGR-2、中期因子(midkine)、CA125、IL_6、IL_8、CRP、SAA 和 SAP ；
( )执行算法功能，包括将该数据与预测定数据进行比较； (iii)按照算法功能的结果(包括比较)，确定患者的状态；和
(c)通过通信网络将患者状态的指示输出至用户。处理系统可适合于从适合测定数据的远终端工作站接收数据。该处理系统可以包括
(a)适合于下列的第一处理系统 (i)接收数据；和
( )按照算法功能的结果(包括比较数据)，确定患者的状态；和
(b)适合于下列的第二处理系统 (i)从处理系统接收数据；和
( )执行算法的功能，包括比较；和 (iii)将结果传输至第一处理系统。基站典型地包括
(a)连接第一处理系统与通信网络的第一防火墙；和
(b)连接第一和第二处理系统的第二防火墙。该处理系统可以与数据库连接，该处理系统适合于在数据库中保存数据。上面列出的对“算法”或“算法功能”的引证包括多变量分析功能的运行。除了上 述那些之外，可以实施大量不同结构和平台。应理解，可以使用适合于实施本发明的任何结 构形式。然而，一种有利的技术是使用分布式体系结构。尤其是，可以在相应的地理位置提 供许多终端站1 (图幻。通过降低数据带宽成本和需求，以及在一个基站拥挤或出现错误的 情况下，保证其它终端站1可以接替，这样就可以提高系统的效率。这还可以使负载分摊， 等等，以便保证任何时间都可以进入系统。
在这种情况下，需要保证基站2包含相同信息和信号，从而可以使用不同的终端站1。还应该理解，在一个实施例中，终端站1可以是手持式装置，例如PDAs、移动式电 话，等等，其能够通过通信网络4例如国际互连网将患者数据传输至基站，并接收报告。在上述方面，术语“数据”是指生物标记物的水平或浓度。“通信网络”包括国际互 连网。当使用服务器时，它通常是客户服务器，或更尤其是简单对象应用协议(SOAP)。发布患者描绘妇科癌症的可能性的报告。这种报告的例子提供于图6中。通过下列非限制性实施例，进一步描述本发明。下面提供了与这些实施例有关的 原料和方法。用于IL-6和IL-8测定法的多重ELISA测定法是从Biorad得到的。测定血清 淀粉状蛋白A、血清淀粉状蛋白P和C反应蛋白的心血管组(panel)2测定法(CVD2)是 从Lincoplex得到的。另外，在所有样品上进行CA125测定法，使用Roche测定试剂盒，在 Roche分析器平台上进行。Roche测定法是电化学发光免疫测定“ECLIA”，其中生物标记物 /两种标记的抗体夹心与微粒连接。用磁力将微粒收集到电极的表面上。将电压施加到电 极上，引起化学发光发射，将其用光电倍增器测定。在常规96孔平皿中，用标准夹心ELISA技术测定中期因子(midkine)和AGR2。使用亲合性纯化的兔子抗AGR-2抗体，进行免疫活性的(ir) -AGR-2的免疫组织化 学定位(Liu等人Ca/^er Res 65(9) :3796-3805, 2005)。将抗体在包含0. 5% v/v Tween-20 和3% w/v脱脂奶粉的Tris-缓冲的盐水中稀释(1:500)，并在室温下用再水合的石蜡烃 部分培养两个小时。然后将该部分用生物素-连接的抗兔IgG培养，而后用抗生蛋白链菌 素-HRP试剂培养，并使用二氨基联苯胺作为色原使ir-AGR-2显像。用苏木精将该部分对 比染色，而后目视检验。从代表渠道I至IV的各个医院或医务所、从诊断患有卵巢癌症的女性中获得血浆 样品。从相同渠道、从健康个体获得对照血浆样品。将所有的样品(当得到时)在-80°C下 冷冻保存，直到处理为止。还需要从诊断患有子宫内膜异位的女性中获得其它对照血浆样
P
BFI ο实施例1
生物标记物的选择
选择下列生物标记物用于组(panel)中的内含物(有或者没有CA125) :IL_6，IL-8, CRP，SAA和SAP。其它的生物标记物包括中期因子(midkine)和AGR-2。实施例2
概率指数的测定
图1提供了形成诊断测定法中所使用的算法的模型的图示。对生物标记物浓度(得自 于已知疾病状态的患者)形式的培训数据进行多变量分析，产生算法。实质上，测定法是基 于应用统计和机器学习算法的诊断规则。这种算法使用生物标记物和疾病状态之间的关系 (在培训数据(具有已知的疾病状态)中观察到的)，从而推断关联性，将其用于预示未知 状态患者的状态。数据分析领域熟练的从业者可以判明，可以使用培训数据中的许多不同 形式的推断关联性，而不实质上改变本发明。培训数据中的两种或多种生物标记物的生物标记物浓度(即水平)能够形成算
28法，其提供生物标记物水平和患者的疾病状态之间的可测量关系。除了生物标记物的“水 平”之外，本发明扩展至两种或多种标记物的比例作为输入数据，用于形成算法的多变量分 析。然后将生物标记物浓度(得自于未知状态的患者)形式的试验数据插入到算法 中，提供患者是否具有妇科病症的概率指数。实施例3
测定法的开展
使用Roche CA125 II试剂盒并使用Roche E170�？榉治銎鳎葱蠧A125测定法。使 用35U/ml的截止值。基于产物插入数据，CA125测定法所希望的性能指标示于表1中。表 1
截止值(U/mL)灵敏性特异性6579%82%150*69%93%19063%95%
*最佳临床值的水平(如Roche CA125 II试剂盒所定义)。使用多重珠粒测定法，在Biorad Bioplex 100仪器上，进行生物标记物组 (panel)测定。样品包括浆液性(64%)、粘质性(7%)、子宫内膜(10%) ^P mullerian(4%)类 型。基于病理，癌症样品库包括阶段I至IV的卵巢癌症。进行统计分析，比较常规CA125测定法和生物标记物测定法的灵敏性和特异性。该分析使用随机选择的样品组，产生算法模型。通过预测第二个独立样本组，验证 所产生模型的性能。这可以提供模型和验证样品组两者的灵敏性和特异性。进行ROC曲线 分析旨在比较生物标记物和CA125结果之间的统计显著性。模型构造和验证策略示于图2中。结果示于表2中。表2
所有阶段CA125生物标记物诊断效率90. 70%94. 00%AUC0. 9600. 982*引导指令限制0. 924-0. 9880. 966-0. 994灵敏性92. 6%91. 2%特异性89. 6%95. 7%
* 5%水平的统计显著性(尾部面积概率=0. 012) 然后比较阶段I和II卵巢癌症，结果示于表3中。
表 3
只有阶段I和IICA125生物标记物诊断效率89. 50%92. 8%AUC0. 9330. 984灵敏性89. 20%89. 2%特异性89. 60%93. 9%
所有癌症的比较示于表4中。
表 权利要求
1.使用户确定患者有关妇科癌或其亚型或癌阶段的状态的方法，该方法包括(a)通过通信网络从用户处接收CA125和AGR-2、中期因子(midkine)、CRP、IL-6、 IL-8、SAA和SAP中的一种或多种的水平或浓度形式的数据；(b)通过多变量分析处理患者数据，提供病情指数值；(c)按照病情指数值与预定值比较的结果确定患者的状态；和(d)通过通信网络将患者状态的指示传输至用户。
2.权利要求1的方法，其中该方法进一步包括(a)使用户利用远端工作站测定数据；和(b)通过通信网络将数据从终端站传输至基站。
3.权利要求1或2的方法，其中基站包括第一和第二处理系统，其中该方法包括(a)将数据传输至第一处理系统；(b)将数据传输至第二处理系统；和(c)使第一处理系统执行多变量分析功能，以便产生病情指数值。
4.权利要求1或2或3的方法，其中该方法进一步包括(a)将多变量分析的结果传输至第一处理系统；和(b)使第一处理系统测定患者的状态。
5.权利要求4的方法，其中该方法包括下列中的至少一个(a)在通信网络和第一处理系统之间通过第一防火墙传输数据；和(b)在第一和第二处理系统之间通过第二防火墙传输数据。
6.权利要求5的方法，其中第二处理系统与适合于保存预定数据和/或多变量分析功 能的数据库连接，该方法包括(a)查询数据库，获得最低限度选择的预测定数据，或由数据库进入算法；和(b)将选择的预定数据与患者数据进行比较，或产生预示的概率指数。
7.用于确定患者的妇科病症存在的测定法，所述测定法包括测定得自于所述患者的 生物样品中的生物标记物的水平，其中所述生物标记物是CA125和选自AGR-2、中期因子 (midkine)和CRP或其修饰形式或同系物形式中的至少一种，其中生物标记物相对于对照 物的水平变化是具有或不具有病症的患者存在的指示。
8.权利要求7的测定法，进一步包括测定生物标记物的水平，该生物标记物选自 CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA 和 SAP 中的两种或多种；IL_6、IL_8、CRP、SAA 和 SAP 中的两种 或多种和04125、11^-6、11^-8、0^、544和SAP中的至少一种，和中期因子(midkine)或AGR-2 或其修饰形式或同系物形式中的至少一种；其中生物标记物相对于对照物的水平变化提供 具有或不具有病症的患者的概率指数。
9.权利要求7或8的测定法，其中对生物标记物水平执行多变量分析算法，该算法是由 数据的第一知识库产生的，其包括自就病症来说处于已知状态的患者的相同生物标记物的 水平，其中该算法提供具有或不具有病症的患者的概率指数。
10.权利要求7至9的任一项的测定法，其中患者是人。
11.权利要求10的测定法，其中妇科病症是卵巢癌症或其阶段或由其引起的并发症或 炎症病症。
12.权利要求11的测定法，其中生物标记物水平是通过监控生物标记物与固定配体的结合来确定的。
13.权利要求12的测定法，其中配体是抗体或其衍生物、杂交物或抗原结合片段。
14.权利要求13的测定法，其中生物标记物与抗体的结合是通过ELISA、ECLIA或其它 免疫测定检测系统来检测的。
15.权利要求7至14的任一项的测定法，其在治疗干预之前、期间或之后进行。
16.用于检测患者妇科病症的生物标记物的配体组(panel)，所述组(panel)包括与 CA125和生物标记物AGR-2、中期因子(midkine)和/或CRP或其修饰形式或同系物形式中 的一种或多种特异性结合的试剂；其中生物标记物水平的变化预示患者具有或不具有妇科 病症。
17.权利要求16的组(panel)，进一步包括与生物标记物特异性结合的试剂，生物标记 物选自 CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA 和 SAP 中的两种或多种；IL-6、IL-8、CRP、SAA 和 SAP 中 的两种或多种；和CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA和SAP中的至少一种和中期因子(midkine) 和AGR-2或其修饰形式或同系物形式中的至少一种；其中生物标记物相对于对照物的水平 变化提供具有或不具有病症的患者的概率指数。
18.权利要求16或17的组(panel)，其中对生物标记物水平进行多变量分析，该多变 量分析是由数据的第一知识库产生的，其包括自就病症来说处于已知状态的患者的相同生 物标记物的水平，其中该算法提供具有或不具有病症的患者的概率指数。
19.权利要求16至18的任一项的组(panel)，其中将试剂固定到固体载体上。
20.权利要求16至19的任一项的组(panel)，其中试剂是抗体或其衍生物、杂交物或 抗原结合片段。
21.试剂盒，其包含物质的组合物，物质包括组成部分[X]n、Y和[Z]m，其中X是生物标记物的配体，生物标记物选自CA125或其修饰形式或同系物形式，和η是0 或1 ；Y是生物标记物的配体，生物标记物选自包含下述项目的表当η是0时，为IL-6、 IL-8、CRP、SAA和SAP或其修饰形式或同系物形式中的两种或多种，或当η是1时，为IL-6、 IL-8、CRP、SAA和SAP或其修饰形式或同系物形式中的至少一种；和Z是生物标记物的配体，生物标记物选自中期因子(midkine)和AGR-2或其修饰形式或 同系物形式，和m是0或1，该试剂盒进一步包含便于测定与配体结合的生物标记物浓度的试剂，其中在使用过程 中，对该水平执行算法，该算法是由数据的第一知识库产生的，其包括自就病症来说处于已 知状态的患者的相同生物标记物的水平，其中该算法提供具有或不具有病症的患者的概率 指数。
22.标记物的组(panel)，其包括目录[X]n、[Y]X^P[Z]m，其中X是CA125或其修饰形式或同系物形式，和η是0或1 ；Y是选自IL-6、IL-8、CRP、SAA和SAP或其修饰形式或同系物形式的标记物，条件是，当 η是0时，Y包括标记物的两种或多种，其中χ是0或1 ；和Z是AGR-2和中期因子(midkine)和/或CA125或其修饰形式或同系物形式中的两种 或多种，和m是0或1。
23.权利要求21或22的试剂盒或组(panel)，其中配体固定到固体载体上。
24.权利要求23的试剂盒或组(panel)，其中配体是抗体或其衍生物、杂交物或抗原结 合片段。
25.权利要求23的试剂盒或组(panel)，其中便于检测的试剂包括生物标记物的标记 的抗体。
26.权利要求23的试剂盒或组(panel)，其中配体是抗体或其衍生物、杂交物或抗原结 合片段。
27.两种或多种生物标记物的水平在形成用于检测患者卵巢癌症的诊断测定法的算法 中的用途，生物标记物选自CA125、AGR-2、中期因子(midkine)、IL-6、IL-8、CRP、SAA和SAP 或其修饰形式或同系物形式。
28.AGR-2、中期因子(midkine)和CA125或其修饰形式或同系物形式的两种或多种的 水平在形成检测患者卵巢癌症或其它妇科病症的测定法中的用途。
29.培训数据的知识库产生算法的用途，当将其输入数据的第二知识库时，提供预示妇 科病症的性质的概率指数，其中培训数据的知识库包括得自于患有妇科病症的患者的生物 标记物水平，数据的第二知识库包括与具有未知妇科病症患者相同生物标记物的水平。
30.权利要求27或观或四的用途，其中患者是妇女。
31.监控患者的妇科病症的发展的方法，包括(a)提供患者的样品；(b)测定下列的水平AGR-2、中期因子(midkine)和/或CA125中的两种或多种； CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA、SAP、中期因子(midkine)和/或AGR-2生物标记物中的两种 或多种；并且将该水平与对照物或对照物数据库进行比较，以便提供具有妇科病症患者的 概率指数；和(c)在后面的时间点重复步骤(a)和(b)，并且将步骤(b)的结果与步骤(c)的结果 进行比较，其中概率指数的差别预示患者病症的发展。
32.确定患者妇科癌症是否为良性的方法，包括(a)提供患者的样品；(b)测定下列的水平AGR-2、中期因子(midkine)和/或CA125中的两种或多种； CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA、SAP、中期因子(midkine)和/或AGR-2生物标记物或其修饰 形式或同系物形式中的两种或多种，并且将该水平与对照物或对照物数据库进行比较，以 便提供具有妇科癌症患者的概率指数；和(c)监控随时间变化的概率指数，其中指数随着时间的推移而降低时，表示癌症是 良性的。
33.区分非侵入性和侵入性妇科癌症的方法，包括(a)提供患者的样品；(b)测定下列的水平两种或多种的AGR-2、中期因子(midkine)和/或CA125 ； CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA、SAP、中期因子(midkine)和/或AGR-2生物标记物或其修饰 形式或同系物形式，并且将该水平与对照物或对照物数据库进行比较，以便提供具有侵入 性或非侵入性妇科癌症患者的概率指数；和(c)比较随时间变化的概率指数，其中指数升高时，表示癌症是侵入性的。
34.确定患者形成妇科肿瘤的潜在危险的方法，包括(a)提供患者的样品；(b)测定下列的水平两种或多种的AGR-2、中期因子(midkine)和/或CA125 ； CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA、SAP、中期因子(midkine)和/或AGR-2生物标记物或其修饰 形式或同系物形式，并且将该水平与对照物或对照物数据库进行比较，以便提供具有妇科 癌症患者的概率指数；和(c)比较随时间变化的概率指数，其中指数减小时，表示患者形成妇科肿瘤的危险低。
35.检测患者癌症的方法，包括(a)提供患者的样品；(b)使样品与抗体接触，其中抗体与AGR-2、中期因子(midkine)、CA125、IL-6、 IL-8、CRP、SAA和/或SAP生物标记物或其修饰形式或同系物形式结合，以便测定两种或多 种生物标记物的水平，并将该水平与对照物或对照物数据库进行比较，提供具有妇科病症 患者的概率指数；和(c)基于概率指数，判断患者具有癌症的危险。
36.权利要求31至35的任一项的方法，其中对生物标记物水平执行算法，提供概率指数。
37.权利要求31至36的任一项的方法，其中患者是人。
38.权利要求37的方法，其中病症是卵巢癌症或由其引起的并发症或炎症性癌症。
39.治疗患有妇科病症的患者的方法，该方法包括对患者执行诊断测定法，以便测定 具有病症患者的概率指数，生物标记物选自AGR-2、中期因子(midkine)和/或CA125中 的两种或多种；CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA和/或SAP中的两种或多种；IL-6、IL-8、CRP、 SAA和/或SAP中的两种或多种；和CA125、IL_6、IL_8、CRP、SAA和/或SAP中的至少一种 和中期因子(midkine)和/或AGR-2或其修饰形式或同系物形式中的至少一种；并且如果 患者具有病症的危险，那么对患者进行手术切除术、化疗和/或放射治疗；而后监控概率指 数随着时间推移所产生的变化。
40.治疗患有卵巢癌症的患者的方法，该方法包括对患者执行诊断测定法，以便测定 具有癌症患者的概率指数，生物标记物选自AGR-2、中期因子(midkine)和/或CA125中 的两种或多种；CA125、IL-6、IL-8、CRP、SAA和/或SAP中的两种或多种；IL_6、IL_8、CRP、 SAA和/或SAP中的两种或多种；或CA125、IL_6、IL_8、CRP、SAA和/或SAP中的至少一种 和中期因子(midkine)和/或AGR-2或其修饰形式或同系物中的至少一种；如果患者具有 病症的危险，那么对患者进行手术切除术、化疗和/或放射治疗；而后监控随时间变化的概 率指数。
全文摘要
本发明通常涉及妇科病症的诊断和预测测定方法领域。更尤其是，本发明提供了一种测定法，该测定法可以确诊妇科癌症或其亚型、或癌症阶段或由其引起的并发症、或其它妇科病症(包括炎症性病症)的存在或患病危险。
文档编号G01N33/574GK102066939SQ200980123621
公开日2011年5月18日 申请日期2009年4月21日 优先权日2008年4月23日
发明者J. 奥特利塔诺 D., L. 伊拉格 L., 加特西奥斯 N., A. 埃德格尔 T. 申请人:健康诊断有限公司
专业数控铣床产品供应商
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