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专利名称：去除经反相分配色谱纯化的蛋白质样品中有机溶剂的方法
技术领域：
本发明涉及一种除去蛋白质样品中杂质的方法，特别是涉及一种除去经反相色谱纯化的蛋白质样品中有机溶剂的方法。
背景技术：
蛋白质分离纯化过程中，经常采用反相分配色谱去除杂质，反相纯化中常用到有机溶剂，后者一般通过真空干燥去除。由于有机溶剂的腐蚀，缩短了真空设备的寿命。
人甲状旁腺激素(human parathyroid hormone，hPTH)由甲状旁腺主细胞合成，成熟肽由84个氨基酸残基组成(Hendy等，Proc Natl Acad Sci USA，78，7365-7369，1981)。PTH是维持机体血钙平衡的重要激素之一。临床上PTH可用于多种骨相关疾病的治疗和诊断，如甲状旁腺功能低下、骨质疏松症的治疗。特别是近年来，大量动物实验研究和人体临床研究表明，间断性给予适量的PTH有促进成骨作用，可快速刺激骨形成，而不伴有骨吸收增加。因此，作为骨形成刺激剂，PTH及其类似物已引起人们的重视，临床上正在进行治疗骨质疏松症的研究。然而PTH天然来源非常有限，利用多肽合成技术进行全合成的成本太高。所以采用基因工程技术生产PTH是必需的。本发明人曾构建了高效表达人甲状旁腺激素的工程菌大肠杆菌BL21(DE3)/pET22-PTH(中国专利申请号01141449.9)，使甲状旁腺激素的工业化生产得以实现。
重组人甲状旁腺激素的纯化在文献中早有报道(Biochem Biophys ResCommun，114，493-499，1983；Biochemistry，27，2691-2697，1983；J Biol Chem，263，1307-1313，1988；J Biol Chem 266，2831-2835，1991)。在纯化过程中，利用反相分配色谱除去杂质是必需的一个步骤，但如何去除反相纯化中所用的有机溶剂，是一个亟待解决的问题。
发明创造内容本发明的目的是提供一种可有效除去经反相色谱纯化的蛋白质样品中有机溶剂的方法，利用该方法不会造成对真空设备的腐蚀。
本发明所提供的除去经反相色谱纯化的蛋白质样品中有机溶剂的方法，是将经反相色谱纯化的蛋白质样品进行离子交换色谱分离，所述离子交换色谱分离中采用的流动相是可保持蛋白质活性的缓冲液，调节所述缓冲液的pH值或盐浓度，得到去除有机溶剂的蛋白质。
所述经反相色谱纯化的蛋白质样品可按常规方法得到。
所述离子交换色谱分离中的固定相既可为阳离子交换树脂，也可为阴离子交换树脂。如阳离子交换树脂SP Sepharose系列和CM Sepharose系列(AmershamBiosciences公司产品)，阴离子交换树脂Q Sepharose系列和DEAE Sepharose系列(Amersham Biosciences公司产品)。
所述缓冲溶液可为各种生理相容性溶液，如磷酸盐溶液，乙酸盐溶液和柠檬酸盐溶液等等。
当所述经反相色谱纯化的蛋白质样品为重组人甲状旁腺激素(中国专利01141449.9)时，可采用阳离子交换树脂，如SP Sepharose H.P.填料(AmershamBiosciences公司产品)进行分离。其中，流动相为pH5-7的缓冲溶液，如50mM的乙酸铵(pH6.0)。在此条件下蛋白质与柱内填料结合，平衡除去有机乙氰等。然后在高浓度盐下洗脱，如400mM的乙酸铵(pH6.0)。
本发明巧妙地采用离子交换方法去除反相纯化后蛋白质样品中的有机溶剂，不仅可以有效除去有机溶剂，还可以节省设备投资，是一种经济的纯化工艺。


图1为重组人甲状旁腺激素纯品的SDS-PAGE分析图谱图2为重组人甲状旁腺激素纯品的RP-HPLC分析图谱图3为电喷雾质谱法测定重组人甲状旁腺激素的分子量图谱具体实施方式
实施例1、重组人甲状旁腺激素的表达和纯化(1)重组人甲状旁腺激素的表达挑取大肠杆菌BL21(DE3)/pET22-PTH(中国专利申请号01141449.9)单菌落接入150ml的两倍LB培养基中，37℃，250rpm振荡培养过夜，然后转接到3升发酵培养基中(德国Braun 5L发酵罐)，通气搅拌培养4小时后，加入3ml的1mol/LIPTG，继续培养4小时收菌。
(2)目的产物的纯化①收集菌体，破菌释放菌体内蛋白。
②先用STREAMLINE SP扩张床捕获目的产物，重组人甲状旁腺激素洗脱峰经C18(5μm)柱精细纯化，所采用的流动相为20％-40％的乙氰，纯化后得到含有有机溶剂的蛋白质样品。
③除去样品中的有机溶剂将含有有机溶剂的蛋白质样品用水稀释1倍后直接上阳离子交换柱(SP Sepharose H.P.填料)。先用50mM的乙酸铵(pH6.0)平衡和冲洗层析柱。在此条件下蛋白质与柱内填料结合，平衡除去有机乙氰等。然后用400mM的乙酸铵(pH6.0)直接洗脱目的蛋白。
④将上一步中收集的蛋白溶液再经过Superdex 75凝胶过滤10mM柠檬酸钠(pH6.0)缓冲液为流动相，经过此步可除去高浓度盐，并达到交换缓冲液的目的。
最后获得的纯品在16％SDS-PAGE上进行电泳，每条带上样量为12.5微克。结果如图1所示，图1中，PMW表示肽分子量标准，LMW表示蛋白质分子量标准，04、05、06表示三批纯化样品，经过上述步骤可获得纯度大于99％的hPTH纯品。图2为所制备纯品的高效液相色谱RP-HPLC分析，图3为纯品的分子量测定，电喷雾质谱法测得的分子量为9425.13，与理论值9424.75基本一致，表明本发明的方法是切实可行的。
权利要求
1.一种除去经反相色谱纯化的蛋白质样品中有机溶剂的方法，是将经反相色谱纯化的蛋白质样品进行离子交换色谱分离，所述离子交换色谱分离中采用的流动相是可保持蛋白质活性的缓冲液，调节所述缓冲液的pH值或盐浓度，得到去除有机溶剂的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述离子交换色谱分离中的固定相为阳离子交换树脂或阴离子交换树脂。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述阳离子交换树脂为Na+型磺酸型阳离子交换树脂。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述缓冲溶液为柠檬酸溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述柠檬酸溶液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，柠檬酸-柠檬酸锂缓冲液。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述经反相色谱纯化的蛋白质样品为重组人甲状旁腺激素。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述阳离子交换树脂为SP Sepharose系列离子交换树脂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述流动相为柠檬酸盐或磷酸盐或乙酸盐缓冲溶液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述流动相的pH值为5-7。
全文摘要
本发明公开了一种除去经反相色谱纯化的蛋白质样品中有机溶剂的方法，其目的是提供一种可有效除去经反相色谱纯化的蛋白质样品中有机溶剂的方法。本发明所提供的除去经反相色谱纯化的蛋白质样品中有机溶剂的方法，是将经反相色谱纯化的蛋白质样品进行离子交换色谱分离，所述离子交换色谱分离中采用的流动相是可保持蛋白质活性的缓冲液，调节所述缓冲液的pH值或盐浓度，得到去除有机溶剂的蛋白质。本发明采用离子交换方法去除反相纯化后蛋白质样品中的有机溶剂，不仅可以有效除去有机溶剂，还可以节省设备投资，是一种经济的纯化工艺。
文档编号G01N30/02GK1621801SQ20031011528
公开日2005年6月1日 申请日期2003年11月27日 优先权日2003年11月27日
发明者方宏清, 陈惠鹏, 李彦英, 戴红梅, 李玉玲 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所