专利名称：生物分子的同种型的体内代谢的同时测量的制作方法
技术领域：
本发明包括生物分子的两种或多种同种型的体内代谢的同时测量的方法。
背景技术：
阿耳茨海默氏病(AD)是痴呆的最通常的原因，并且是日益增加的公共健康问题。 AD如同其他中枢神经系统(CNQ退行性疾病一样，特征在于生物分子产生、积聚和清除的紊乱。结果，需要测量生物分子在受试者中代谢的高效方法。特别地，需要同时测量在相同样品中的生物分子的不同异构体。这些方法将节省时间、金钱并需要来自给定受试者的更少的样品。发明概述本发明的一个方面包括同时测量在受试者的中枢神经系统中产生的生物分子的两种或多种同种型的体内代谢的方法。该方法包括将标记的部分施用至受试者。在所述受试者中产生所述生物分子时，所述标记的部分典型地引入所述生物分子中。然后样品得自受试者，其中样品包含用所述部分标记的第一生物分子级分和不用所述部分标记的第二生物分子级分。第一生物分子级分包含生物分子的两种或多种标记的同种型，并且第二生物分子级分包含生物分子的两种或多种未标记的同种型。各标记的同种型的量和各未标记的同种型的量被检测，其中对于特定同种型标记的同种型与未标记的同种型的比例直接成比例于所述受试者中所述特定同种型的代谢。本发明另一方面包括一种确定治疗剂是否影响在受试者的中枢神经系统中产生的生物分子的两种或多种同种型的体内代谢的方法。该方法包括将治疗剂施用至受试者并且将标记的部分施用至受试者。在所述受试者中产生所述生物分子时，所述标记的部分典型地引入所述生物分子中。样品得自受试者，并且通常包含用所述部分标记的第一生物分子级分和不用所述部分标记的第二生物分子级分。第一生物分子级分包含生物分子的两种或多种标记的同种型，并且第二生物分子级分包含生物分子的两种或多种未标记的同种型。生物样品中各标记的同种型的量和各未标记的同种型的量被检测，其中对于特定同种型标记的同种型与未标记的同种型的比例直接成比例于所述受试者中所述特定同种型的代谢。比较各同种型的代谢和合适的对照值，使得对于特定同种型从所述对照值的改变指示所述治疗剂影响在所述受试者的所述中枢神经系统中所述特定同种型的代谢下面将更全面地描述本发明的其他方面和重述部分。附图简述
图1示出通过纳升-LC串联MS检测在永生敲入鼠星形细胞表达人ApoE2或ApoE4 中的人ApoE同种型特定胰蛋白酶肽。将ApoE4培养基(0. 5ml)和ApoE2培养基(Iml)集合并在4°C下用0. Iml的PHM-Liposorb 孵育30min。使样品变性、还原和烷基化，并用胰蛋白酶消化以产生同种型特定肽，其通过纳升-LC串联MS来分析。(A)用于各同种型特定肽的双电荷离子的提取离子色谱法。(B)具有标记的b和y离子的各肽的对应MS2谱。图2示出通过纳升-LC串联MS检测CSF中的人ApoE同种型特定胰蛋白酶肽。将来自年轻正常对照参加者的CSF(0. Iml)在4°C下用0. Iml的PHM-Liposorb 孵育30min。 使样品变性、还原和烷基化，并用胰蛋白酶消化以产生同种型特定肽，其通过纳升-LC串联 MS来分析。(A)和(B)衍生自具有ApoE3/4基因型的个体。提取离子色谱法示于(A)中用于各同种型特定肽的双电荷离子，并且对应的MS2谱显示于(B)。(C)和(D)衍生自具有 ApoE3/2基因型的个体。提取离子色谱法示于(C)中用于各同种型特定肽的双电荷离子，并且对应的MS2谱显示于(D)。图3示出ApoE3特定肽的检测。ApoE蛋白用WUE4抗体免疫沉淀，变性、还原和烷基化，并用胰蛋白酶消化以产生同种型特定肽，其通过纳升-LC串联MS来分析。(A)用于 ApoE3特定肽的提取离子色谱法。(B)各肽的对应MS2谱。图4展示从13C-标记的ApoE4和ApoE2星形细胞培养基中分离的各ApoE同种型特定胰蛋白酶肽的标准曲线。标记的和未标记的ApoE同种型特定肽通过串联MS检测，并且从标记与未标记的离子的比例来计算标记百分率。(A)ApoE3/2肽。(B)ApoE3/4肽。(C) ApoE2 肽。(D)ApoE4 肽。图5展示在永生敲入鼠星形细胞中产生人ApoE4。ApoE4表达星形细胞生长至融汇。在时间t = O将13C6-亮氨酸加入培养基，从而使13C6-亮氨酸总百分率至50%。在48 小时内收集培养基。ApoE用Iiposorb捕获，还原和烷基化。ApoE4特定肽通过纳升-LC MS/MS。SILT法用于测定13C6-亮氨酸引入ApoE(n = 3，误差线SEM)。ApoE4的级分合成率 (FSR)使用初始斜率与每小时8. 5%的坪示踪剂与被示踪物的比(TTR)来计算。图6展示ApoE同种型在人CNS中的代谢。ApoE2、ApoE3和ApoE4分离自从O至Mi 灌注13C6-亮氨酸Qmg/kg/h)的年轻正常对照参加者的CSF。(A)ApoE4 = LGADMEDVR(SEQ ID NO 3)，ApoE3 = LGADMEDVcGR(SEQ ID NO 1). (B)ApoE3 = LAVYQAGAR(SEQ ID NO 2)， ApoE2 = cLAVYQAGAR(SEQ ID NO :4)。TTR =示踪剂与被示踪物的比。图7示出可溶性APP-β在CHO培养基中的检测。(A).通过纳升-LC示出未标记和标记的可溶性APP-β的分离。两种肽在相同时间23. 洗脱。(B)示出未标记和标记的可溶性APP-β肽的成对图谱。图谱看起来类似，不同之处在于用箭头指示的离子质量的较小位移。指示的离子在标记的sAPP-β肽中更重3m/z，因为这些离子都是带双电荷的。 标记离子与未标记离子的信号强度的比较表示为离子的％标记与％未标记的比。多种离子的比被加合以提供整个sAPP-β肽的％标记未标记的精确比。图8示出可溶性APP-α在CHO培养基中的检测。(A).通过纳升-LC示出未标记和标记的可溶性APP-α的洗脱。两种肽在相同时间25. ISmin洗脱。(B)示出未标记和标记的可溶性ΑΡΡ-α肽的成对图谱。指示标记的离子在标记离子中更重2m/z，因为这些离子都是带三电荷的。标记离子与未标记离子的信号强度的比较表示为离子的％标记与％未标记的比。多种离子的比被加合以提供整个sAPP-β肽的％标记未标记的精确比。图9展示各sAPP- α和SAPP_ β肽的标准曲线。检测和定量的实际标记与未标记的比针对标记与未标记的理论百分率(基于CHO培养基的已知标记与未标记的亮氨酸)来绘制。(A)sAPP-a 肽。(Β)8ΑΡΡ_β 肽。图10示出表示在CSF中测量时在人受试者中在48小时内标记可溶性APP离子百分率与未标记可溶性APP离子百分率的比的变化的两个图。(A)表示可溶性ΑΡΡβ肽离子。 (B)表示可溶性APP α肽离子。可溶性APP α和可溶性APP β的产生和清除率可通过下列方式来确定计算加合的APP α或APP β肽离子的产生和清除率。图11示出从淀粉样四_4(|、淀粉样-β 29_42、淀粉样-β 29_38等的混合物中检测淀粉样_β29,肽。淀粉样用抗-淀粉样抗体免疫沉淀，并用胰蛋白酶消化。肽通过纳升-LC串联MS分析。㈧用于淀粉样-β 29-40肽的提取离子色谱法。⑶各肽的对应MS2谱。图12示出通过纳升-LC串联MS检测CSF中Αβ同种型特异性Lys-N肽的图。将来自年轻正常对照参加者的CSF(Iml)在室温下用HJ5. 1抗体孵育2小时。纯化的Aβ用 Lys-N消化以产生同种型特定肽，其通过纳升-LC串联MS分析。提取离子色谱法示于组中用于各同种型特定肽的带双电荷的离子(A)消化物的总洗脱曲线，(Β)Αβ1-38，(C)Aβ 1-40 和(D) A β 1-42。对应 MS2 谱展示在下组中=(E)A β 1-38, (F) A β 1-40 和(G) A β 1-42 图13示出分离自13C-标记的Αβ细胞培养基的各Αβ同种型特异性Lys-N肽的标准曲线的图。标记的和未标记的Αβ同种型特定肽通过串联MS检测，并且从标记与未标记的例子的比来计算标记百分率。(Α)Αβ 1-38. (B)Aβ 1-40. (C)Aβ 1_42。图14示出在人受试者中Αβ的产生和清除的时间过程的图。Αβ-1-40和 Aβ-1-42的单独曲线衍生自从来自人CSF的单一免疫沉淀法获得的数据。发明详述本发明提供中枢神经系统(CNS)中的生物分子或蛋白的两种或多种同种型的体内代谢的同时测量的方法。特别地，本发明提供确定目标生物分子或蛋白的数种同种型在一种生物样品中的体内产生和清除率的方法。本发明的方法可用于比较CNS-衍生的生物分子或蛋白的数种不同同种型的代谢，以确定在多种同种型中代谢是否不同，或者一种或多种同种型的代谢是否随时间而改变。典型地，目标生物分子或蛋白意指在神经病学或神经变性疾病或紊乱中，使得所述方法可用于诊断或监控神经病学或神经变性疾病或紊乱的进展或治疗。而且，所述方法被提供以确定是否治疗剂影响CNS-衍生的生物分子或蛋白的数种不同同种型的体内代谢。(I)同时测量数种同种型的代谢的方法本发明提供在单一生物样品中同时测量CNS衍生的生物分子或蛋白的两种或多种同种型的体内代谢的方法。CNS衍生的生物分子或蛋白可意指在神经病学或神经变性疾病或紊乱中。特别地，所述方法包括当目标生物分子或蛋白在CNS中产生时将其标记，收集包含生物分子或蛋白的标记的和未标记的同种型的生物样品，并且将各标记的和未标记的同种型的量进行定量，使得可以测定各同种型的代谢。该方法可用于计算目标生物分子或蛋白的两种或多种同种型中的每种的代谢参数，例如CNS内的产生和清除率。(a)神经退行性疾病本领域技术人员将意识到本发明的方法可用于测定意指在数种神经病学和/或神经退行性疾病、紊乱或过程中的CNS衍生的生物分子或蛋白的数种不同同种型的代谢， 合适的疾病或紊乱的非限制性例子包括阿耳茨海默氏病、帕金森氏症、中风、额颞叶痴呆(FTD)、亨廷顿氏病、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、衰老有关的疾病给我痴呆、多发性硬化症、朊病毒病(例如克雅氏病、�：Ｃ嘧茨圆』蚍枧２『脱鞑�)、路易体病、精神分裂症和肌萎缩性侧索硬化(ALS或卢格里格病)。还预想本发明的方法可用于研究CNS的正常生理学、代谢和功能。CNS衍生的生物分子或蛋白的同种型的体内代谢可在哺乳动物受试者中测量。在一个实施方案中，受试者可以是宠物例如犬或猫。在另一实施方案中，受试者可以是家畜动物例如奶牛、猪、绵羊或山羊。在又一实施方案中，受试者可以是动物园动物。在另一实施方案中，受试者可以是研究动物例如非-人灵长动物或啮齿动物。在又一实施方案中，受试者可以是人。受试者可以或不可以患有或易患有上述神经病学或神经变性疾病或紊乱。(b)CNS衍生的生物分子或蛋白的同种型本发明提供在CNS中产生的生物分子或蛋白的两种或多种同种型的代谢的测量方法。生物分子可以是蛋白、脂质、核酸或碳水化合物。可能的生物分子仅受到下列因素的限制在体内产生或加工过程将它们标记以及收集一种或多种其代谢可被测量的样品的能力。在示例性实施方案中，生物分子是蛋白。合适的蛋白的非限制性例子包括淀粉样-β (Αβ)及其C-末端和N-末端变异体、淀粉样前体蛋白(APP)、载脂蛋白Ε(同种型2、 3或4)、载脂蛋白J(也称为聚集Tau (另一种关联AD的蛋白)、磷酸化Tau、神经胶原纤维酸性蛋白、α-2巨球蛋白、突触核蛋白、S100B、髓鞘碱性蛋白(意指在多发性硬化症中)、朊病毒、自细胞介、TDP-43、超氧化物歧化酶-1、亨廷顿蛋白、肿瘤坏死因子(TNF)、热休克蛋白90(HSP90)及其组合。可被靶向的另外生物分子包括和GABA能神经元、去甲肾上腺素能神经元、组胺能神经元、5-羟色胺能神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元和谷氨酰胺能神经元相互作用的产物、或蛋白、或肽、术语"同种型"是指生物分子或蛋白的不同形式。生物分子或蛋白的不同形式可通过多种过程或机理而产生。在生物分子是蛋白的实施方案中，同种型可以是序列相差一个或多个氨基酸的蛋白。例如，蛋白同种型可以是遗传等位基因。可选择地，蛋白同种型可以是交替切割、RNA编辑、翻译后加工等的产物。如下所述，这些同种型可原封未动地被分析，或者可通过蛋白的多种形式的离体裂解以产生"同种型特异性片段"来检测。在生物分子是蛋白的其他实施方案中，同种型可以是通过蛋白酶活性体内产生的裂解产物。合适的体内蛋白酶的非限制性例子包括α-分泌酶、β-分泌酶和可变Y-分泌酶。可选择地，裂解产物也可以通过非蛋白酶体内产生。合适的非蛋白酶裂解体系包括但不限于溶酶体酶类、超氧化物歧化酶、自由基等。在一个优选实施方案中，蛋白可以是淀粉样前体蛋白(APP)并且APP的同种型可以是可溶性APP- α和可溶性APP- β，其分别是α -分泌酶和β -分泌酶的裂解产物。在另一优选的实施方案中，蛋白可以是淀粉样-β并且淀粉样的C-末端同种型可以是淀粉样-β M7、淀粉样-β ^8、淀粉样-β ^9、淀粉样-β ^、淀粉样-β i-41、淀粉样-β H2和/ 或淀粉样-h,。在甚至另外的实施方案中，蛋白可以是载脂蛋白E(ApoE)并且ApoE的同种型可以使ApoE的基因同种型的同种型特异性片段(例如，ApoE2、ApoE3和ApoE4)。(c)标记的部分标记的部分可包含放射活性同位素或非放射活性(稳定)同位素。在优选实施方案中，非-放射活性同位素可被使用并通过质谱来测量。优选稳定同位素包括氘(2H)、13C、15N、170、180、33S、34S或^5S,但认识到多种其他稳定同位素也将是有效的，相对于流行天然形式中观察到的情况，该同位素通过增加或减少中子而改变原子的质量。在研究中相对于改变同种型的片段的质量，合适的标记通常通过增加或减少中子而改变原子的质量，使得其可在质谱仪中被检测。在一个实施方案中，待测量的生物分子可以是核酸，并且标记的部分可以是包含非-放射活性同位素(例如15N)的核苷三磷酸。在另一实施方案中，待测量的生物分子可以是蛋白，并且标记的部分可以是包含非-放射活性同位素(例如，13C)的氨基酸。可选择地，蛋白可以用标记的部分例如包含合适的同位素的乙酸酯或ATP翻译后标记在优选实施方案中，当所述方法被用于测量蛋白同种型的代谢时，标记的部分典型地将是氨基酸。本领域技术人员将意识到数种氨基酸可用在本发明的方法中。通常，氨基酸的选择基于多种因素，例如(1)氨基酸的至少一个残基存在于目标蛋白的两种或多种同种型中的每种中。( 氨基酸通常能够穿过血脑屏障快速平衡并且快速达到蛋白产生位点。亮氨酸是标记CNS中产生的蛋白的优选氨基酸，如实施例中所证实。( 氨基酸理想地可以是必需氨基酸(不由机体产生)，使得可以实现更高的标记百分率。也可以使用非必需氨基酸；然而测量可能会较不精确。(4)氨基酸标记通常不影响目标蛋白的代谢(例如，非常大剂量的亮氨酸可影响肌肉代谢)。以及( 期望氨基酸的适用性(即，相对于其他氨基酸，一些氨基酸更加昂贵或难以生产。在一个优选实施方案中，标记的氨基酸可以是13C6-苯丙氨酸，其含有6个1Y原子。在另一优选的实施方案中，标记的氨基酸可以是13C6-亮氨酸。 还预想在不偏离本发明的范围的情况下，包含不同稳定的同位素的一种或多种标记的氨基酸可同时或依次使用。有大量商业来源的标记的氨基酸，非-放射活性同位素和放射活性同位素的。通常，标记的氨基酸可生物或合成制备。生物制备的氨基酸可得自有机体(例如，巨藻/海草)，所述有机体在当有机体产生蛋白时引入氨基酸中的13Cn或另外同位素的富集混合物中生长。然后分离和纯化氨基酸。可选择地，氨基酸可用已知合成化学方法来制备。(d)标记的部分的施用标记的部分可通过数种方法施用至受试者。合适的施用路径包括静脉内、动脉内、 皮下、腹膜内、肌肉内或口服。在蛋白被标记的优选实施方案中，标记的部分可以是氨基酸。 在一个实施方案中，标记的氨基酸可通过静脉内输注来施用。在另一实施方案中，标记的氨基酸可口服摄入。在优选实施方案中，标记的部分可施用1)在一段时间内缓慢进行，幻较大单剂量取决于选择的分析类型(例如，稳定态或单次/追逐)，或幻初始单次剂量后在一段时间内缓慢进行。为了实现标记的生物分子或蛋白的稳定态水平，标记时间通常应该是足够的时间期间，使得标记的生物分子或蛋白可以可靠地量化。在一个实施方案中，标记的氨基酸可以是标记的亮氨酸并且标记的亮氨酸可静脉内施用。标记的亮氨酸可静脉内施用从约1 小时至约M小时的时间期间。标记的亮氨酸的施用速率可为约0. 5mg/kg/hr至约5mg/kg/ hr,优选为约 lmg/kg/hr 至约;3mg/kg/hr，或更优选为 1. 8mg/kg/hr 至约 2. 5mg/kg/hr。在另一实施方案中，标记的亮氨酸可作为单次剂量来施用，所述单次剂量为约50至约500mg/ kg受试者体重，约50至约300mg/kg受试者体重，或者约100至约300mg/kg受试者体重。 在又一实施方案中，标记的亮氨酸可作为单次剂量来施用，所述单次剂量为约200mg/kg受试者体重。在可替换的实施方案中，标记的亮氨酸可在初始单次剂量后如上详述静脉内施用，所述单次剂量为约0. 5至约10mg/kg，约1至约％ig/kg，或约ang/kg受试者体重。本领域技术人员将意识到标记的氨基酸的量(或剂量)可以并且将改变，通常，所述量取决于下列因素(和由下列因素来评价)(1)期望的分析类型。例如，为了在血浆中实现约15%标记的亮氨酸的稳定态，要求在IOmin内初始单次剂量ang/kg后在约9hr内施用约ang/kg/hr。相反，如果不要求稳定态，可以初始给予更大的单次剂量的标记的亮氨酸(例如，1或5克的标记的亮氨酸)。(2)分析中的蛋白。例如，如果蛋白快速产生，可需要较少的标记时间，并且可需要较少的标记-可能少至1小时内0. 5mg/kg。然而，大部分蛋白具有数小时至数天的半衰期，因此更加可能的是在0. 5mg/kg至％ig/kg下可使用连续输注4、9或12小时。以及(3)标记的检测灵敏度。例如，随着标记检测的灵敏度增加，需要的标记的量可降低。本领域技术人员将意识到在单一受试者中可使用多于一种的标记的氨基酸。这将允许目标蛋白的两种或多种同种型的多次标记，并且可提供在不同时间各同种型代谢的信息。例如，第一标记的氨基酸可在初始时间期限内给予受试者，然后可以施加治疗剂和第二标记的氨基酸。通常，得自该受试者的样品的分析将提供AND前和施用治疗剂后各蛋白同种型的代谢的测量，从而直接测量在相同受试者中治疗剂的药物动力学效果。可选择地，多次标记的氨基酸可在相同时间施用至受试者以增加目标蛋白的多种同种型的标记。(e)生物样品本发明的方法提供得自受试者的生物样品，使得可以测量目标生物分子或蛋白的两种或多种同种型的体内代谢。包含被收集用于分析的目标标记的和未标记的同种型的生物样品可以并且将取决于实施情况来改变。在一些实施方案中，生物样品可以是体液。合适的体液包括但不限于脑脊髓液(CSF)、血浆、血清、全血、尿液、唾液、汗液和眼泪。在其他实施方案中，生物样品可以是CNS组织，即，脑组织或脊髓组织。生物样品通常使用本领域技术人员熟知的标准方法来收集。例如，脑脊髓液可以使用或不使用留置CSF导管(如果在一定时间内进行多次收集，则优选导管)通过腰椎穿刺来获得。血液可以使用或不使用静脉内导管静脉穿刺来收集。尿液可通过简单尿液收集来收集，或使用导管来更精确地收集。唾液和眼泪可使用标准优良临床试验规范(GCP)方法通过直接收集来收集。CNS组织可通过组织切片、解剖或切除来获得，可选择地，其可使用激光显微切割来获得。受试者可以或不可以被处死以获得 CNS组织样品，这取决于期望的CNS样品和利用的受试者。通常，在施用标记的部分之前，本发明典型地提供得自受试者的第一生物样品，以提供用于受试者的基线。在施用标记的部分后，一种或多种生物样品通常取自受试者。如本领域技术人员意识到的，样品数量和何时将它们取出通常将取决于多种因素，例如分析类型、施用类型、目标蛋白、代谢速率、检测类型等。在一个实施方案中，生物样品(例如，血液和/或CSF)可在开始标记后36小时每小时取样。可选择地，样品每隔其他小时或甚至更少频率地取样。通常，在蛋白的第一较小半衰期中获得的生物样品(例如，在开始标记淀粉样后约12hrs)可用于测定各同种型的产生率，在标记结束后(例如，开始标记淀粉样-β后约蛋白的数个半衰期取出的生物样品可用于测定各同种型的清除率。在其他可替换形式中，一种样品可在标记一段时间例如12小时后取出，以估计产生率，但这可比多次样品更加不精确。在其他可替换形式中，取决于蛋白的产生和清除率，样品可分别地从小时至数天或甚至数周来取出。(f)检测本发明还包括检测目标生物分子或蛋白的各标记的同种型和各未标记的同种型的量，使得可以测定不同的同种型的体内代谢。标记的同种型与未标记的同种型的比例直接成比例于受试者的CNS中同种型的代谢。检测标记的和未标记的同种型的合适的方法可以并且将改变，这取决于目标生物分子或蛋白和用于标记目标生物分子或蛋白的标记的部分的类型。在优选实施方案中，质谱可用于检测生物分子或蛋白的标记的和未标记的同种型之间的质量差别。在一个实施方案中，气相色谱-质谱可以用于检测标记的和未标记的同种型的量。在可替换的实施方案中，MALDI-T0F质谱可以用于检测标记的和未标记的同种型。在优选实施方案中，高分辨率串联质谱可以用于检测标记的和未标记的同种型。在示例性实施方案中，生物分子是蛋白，并且蛋白的不同同种型通过质谱检测。本领域技术人员将意识到对应于体内产生的裂解产物的同种型可直接检测，或者它们可体外进一步消化以产生更小的肽以用于通过质谱来检测。对应于蛋白的不同形式的同种型 (即，遗传等位基因、转录后、翻译或翻译后加工)通常离体消化以产生同种型特异性片段以用于通过质谱来检测。“同种型特异性片段"典型地通过下列方式来产生分离目标蛋白(参见下面)并且使用合适的蛋白酶将其消化(如实施例中详述)。可用于产生同种型特异性片段的合适蛋白酶的非限制性例子包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、肽链内切酶Arg-C、 肽链内切酶Lys-C和肽链内切酶Glu-C。在检测和分析之前，另外的技术可用于从生物样品中的其他生物分子中分离生物分子或蛋白的同种型。例如，标记的和未标记的同种型可使用特异性抗体通过免疫沉淀法来分离和纯化。在另一实施方案中，标记的和未标记的同种型可通过吸附至衍生聚合物来分离和纯化。例如，聚合物可以和对目标同种型具有特异性的抗体缀合，或者聚合物可缀合结合同种型的另外的底物。可选择地，聚合物可以是使用氧乙烯化脂肪醇衍生的多羟基亚甲基聚合物(例如PHM-Liposorb ，由Calbiochem，San Diego, CA生产)，使得聚合物结合脂蛋白。而且，同种型还可以通过液相色谱法分离和/或分开。例如，具有色谱设置设备的质谱仪可用于分离和/或分开同种型，然后其进行质谱，如实施例中所证实。在一个示例性实施方案中，同种型可被免疫沉淀，消化成更小的肽，然后通过接口有串联MS单元(装备电喷雾电离源(LC-ESI-串联MS))的液相色谱法系统进行分析。在另外示例性实施方案中，目标同种型可通过吸附至衍生的PHM基质而分离，消化成较小的肽(或同种型特异性片段)，然后通过接口有串联MS单元(装备电喷雾电离源(LC-ESI-串联MS))的液相色谱法系统进行分析。(g)分析一旦在样品中检测了两种或多种标记的和未标记的同种型的量，可确定各标记的同种型的百分率的比例。各同种型的代谢(产生率、清除率、滞后时间、半衰期等)可从随着时间变化的标记与未标记的同种型的比来计算。有许多合适的方式来计算这些参数。本发明的方法允许同时在相同样品中测量各标记的和未标记的同种型的量，使得可以计算各同种型的标记与未标记的比。本领域技术人员熟悉可用于本发明的方法的标记的一级动力学模型。例如，可以计算各同种型的级分合成率(FSR)。FSR等于标记与未标记的同种型的初始增加率除以前体富集(precursor enrichment)。同样，可以计算各同种型的级分清除率(FCR)。另外，可以确定各同种型的其他参数(例如，绝对产生率、绝对清除率、新产生的生物分子的曲线下面积分析、滞后时间和同位素示踪剂稳定态)，并且可用作同种型的代谢和生理学的指示。此外，可以对数据进行建模以拟合多隔室模型，从而评价隔室之间的转移。当然，选择的数学建模的类型将取决于单个蛋白产生和清除参数(例如，单室、多室、稳定态、非稳定态、隔室建模等)。本发明提供目标同种型的产生典型地基于标记/未标记的同种型的比随着时间的增加率(即，斜率，指数拟合曲线，或隔室模型拟合限定产生速度)。对于这些计算，典型地需要最少量的一种样品(人员能够估计基线标记)，两种是优选的，并且多种样品是更优选的以计算标记摄取到生物分子或蛋白中的精确曲线(即，产生率)。相反地，在停止施用标记后，标记与未标记的同种型的比的降低率典型地反映同种型的清除率。对于这些计算， 典型地需要最少量的一种样品(人员能够估计基线标记)，两种是优选的，并且多种样品是更优选的以计算标记从生物分子或蛋白中随着时间而减少的精确曲线(即，清除率)。在给定时间在样品中的各标记的同种型的量反映产生率或清除率(即，去除或破坏)，并且通常表示为受试者中同种型的％ /小时或质量/时间(例如，mg/hr)。(h)应用本发明的方法可用于确定是否目标生物分子或蛋白的两种或多种同种型的体内代谢存在差别。一种同种型的产生率或清除率可有别于目标其他同种型的产生率或清除率。而且，本发明的方法可用于确定是否目标一种或多种同种型的体内代谢随着时间而改变。这种信息可允许本领域技术人员来诊断或监控神经病学或神经变性疾病或紊乱的进展或治疗。类似地，这种信息可有助于理解疾病或紊乱的病原学和/或病理学。另外，本发明的方法可用于确定设计的治疗性治疗方法不同地影响多种同种型的效果。例如，Y-分泌酶调节剂可设计来减少淀粉样-β H2同种型，而增加淀粉样-β i_38 同种型。本发明的方法可用于测量淀粉样同种型的产生和清除率，并且鉴定在相同样品和试验中对于两种同种型的特异性治疗性应答。本发明允许相同试验的相同样品的同种型的直接比较。这控制不同试验条件并且除去对照和试验条件之间假设的必要，因此减少试验的生物和试验可变性。另外，本发明还通过在各样品制剂中测量多于一种的同种型而直接减少样品制剂的数量。此外，本发明减低了对于各蛋白同种型的特异性纯化或抗体的需要，因为所有蛋白同种型可收集在一起，并且然后LC-MS可一起分析所有同种型。这将导致即使实质性减少，以开发各同种型的特异性抗体、样品制备时间，并且也开发质谱分析时间。更多的同种型被分析，并且更多时间和资源被节省。(II)确定治疗剂是否影响两种或多种蛋白片段的代谢的方法本发明的另一方面提供评价是否用于治疗神经病学或神经变性疾病或紊乱的治疗剂影响受试者的CNS中产生的生物分子或蛋白的各种同种型中任一种的代谢的方法。例如，各同种型的代谢可通过它们各自的片段来测量以确定是否特定治疗剂导致给定同种型的产生增加、产生降低、清除增加、或清除降低。因此，使用本方法将允许本领域技术人员精确地确定目标同种型的产生或清除的改变程度，并且使这些测量关联于治疗的临床结果。 因此，来自该方法的结果可有助于确定治疗剂的最佳剂量和给药频率，可有助于决定有关临床试验的设计，并且可最终加速用于治疗神经病学或神经退行性疾病的有效治疗剂的批
所述方法包括将治疗剂和标记的部分施用至受试者，其中当生物分子或蛋白在 CNS中产生时，标记引入其中。在一个实施方案中，治疗剂可在施用标记的部分之前施用至受试者。在另一实施方案中，标记的部分可在施用治疗剂之前施用至受试者。各种施用之间的时间期限可以是数分钟、1小时、数小时、或更多小时。在甚至另外实施方案中，治疗剂和标记的部分可同时施用。所述方法还包括收集至少一种包含目标生物分子或蛋白的标记的和未标记的同种型的生物样品，检测标记的和未标记的同种型的量以确定各同种型的代谢，并且比较各同种型的代谢和合适的对照值，以确定是否治疗剂改变受试者的CNS中特定同种型的产生率或清除率。神经退行性疾病、生物分子或蛋白的同种型、标记的部分、标记的部分的施用途径、生物样品、检测方式和分析方式的非限制性例子分别在上面章节(1) (a)、(1) (b)、(1) (c)、(1) (d)、(1) (e)、(1) (f)和(1) (g)中详述。(a)治疗剂本领域技术人员将意识到治疗剂可以并将改变，这取决于待治疗的神经病学或神经变性疾病或紊乱、和/或代谢被分析的同种型。在同种型包括可溶性APP-α、可溶性 APP-β或淀粉样(Αβ)肽的实施方案中，合适的治疗剂的非限制性例子包括Y-分泌酶抑制剂、Y -分泌酶调制剂、β -分泌酶抑制剂、α -分泌酶激活剂、RAGE抑制剂、A β产生的小分子抑制剂、A β聚合的小分子抑制剂、A β产生的钼-基抑制剂、聚合的钼-基抑制剂、 干扰金属-蛋白相互作用的药剂、结合可溶性Αβ的蛋白(例如，低密度脂蛋白受体-相关蛋白(LRP)或可溶性LRP)、和清除可溶性Aβ和/或断裂沉积的Αβ的抗体。用于治疗阿耳茨海默氏病的其他治疗剂包括胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、胆碱脂酶抑制剂、NMDA受体拮抗剂、激素、神经保护剂和细胞死亡抑制剂。上述治疗剂中的多种还可影响意指在神经变性紊乱中的其他蛋白的体内代谢。可影响tau和tau同种型的代谢的另外治疗剂，例如包括tau激酶抑制剂、tau聚集抑制剂、组织蛋白酶D抑制剂等。而且，可影响突触核蛋白和突触核蛋白同种型的体内代谢的治疗剂包括乙酰化酶2抑制剂、 突触核蛋白聚集抑制剂、蛋白体抑制剂等。本领域技术人员意识到多种不同治疗剂可用在本发明的方法中。治疗剂可依照已知的方法施用至受试者。典型地，治疗剂口服施用，但是其他施用途径例如胃肠外或局部施用也可以使用。施用至受试者的治疗剂的量可以并将改变，其取决于药剂的类型、受试者和施用的特定方式。本领域技术人员将意识到剂量可使用Goodman & Goldman' s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Tenth Edition(2001), Appendix II, pp. 475—493 禾口 the Physicians' Desk Reference 的指导来确定。(b)对照值通常，对照值是指在施用治疗剂之前目标特定同种型在相同受试者中的体内代谢，预计被治疗剂差别影响或在未施用治疗剂的不同受试者中的对照同种型。测试受试者和对照受试者之间的差别通常将揭示是否治疗剂影响目标特定同种型的产生率或清除率。 治疗剂可差别改变一种目标同种型的代谢，使得该信息可用于预计受试者对特定治疗剂产生应答。而且，该信息可用于确定特定治疗剂的合适剂量和施用时间。定义
除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的意思。下列参考文献提供技术人员本发明中使用的多种术语的通常定义Singleton et al. , Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994) ；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed. ,1988)； The Glossary of Genetics,5th Ed. , R. Rieger et al. (eds. ), Springer Verlag(1991)； 禾口 Hale & Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。如本文中使用， 除非另有说明，否则下列术语具有赋予它们的意思。“ Αβ 〃是指淀粉样β。“清除率"是指生物分子或其同种型除去的速率。“ CNS样品〃是指衍生自CNS组织或CNS流体的生物样品。丨‘CNS组织〃包括血脑屏障内的所有组织。类似地，“CNS流体"包括血脑屏障内的所有流体。“ CNS衍生的细胞〃包括血脑屏障内的所有细胞，包括神经元、星形细胞、小神经胶质细胞、脉络丛细胞、室管膜细胞、其他胶质细胞等。“级分清除率"或FCR计算为标记的生物分子或其同种型在指定的时间期限内比例的自然对数。“级分合成率"或FSR计算为标记的生物分子或其同种型在指定的时间期限内增加率的斜率除以标记的前体的预计的稳定态值。“同种型"是指任何可替换形式的生物分子或蛋白，蛋白的同种型可通过下列非限制性机理而产生不同遗传等位基因或拷贝、在转录过程中蛋白可选择的切割、在翻译过程改变的加工、翻译后修饰、产生后修饰、内源性加工、或内源性裂解成产物。“同位素"是指给定元素的所有形式，所述元素的细胞核具有相同的原子序数， 但是具有不同质量数，因为它们含有不同数量的中子。通过非限制性例子，12C和1V都是碳的稳定的同位素。“滞后时间"通常是指生物分子或其同种型首次标记直到标记的生物分子或其同种型被检测之间的时间延迟。“代谢"是指生物分子或其同种型的产生、运输、断裂、修饰或清除率的任何组
I=I O‘‘产生率〃是指生物分子或其同种型产生的速率。“稳定态"是指在指定的时间期限内测量参数未发生显著改变的状态。在代谢示踪剂研究中，“稳定同位素"是比最丰富的天然存在的同位素较少的非放射活性同位素。本文中使用的"受试者"意指具有中枢神经系统的活有机体。特别地，受试者可以是哺乳动物。合适的受试者包括研究动物、伴侣动物、家畜和动物园动物。在无需过度试验的情况下考虑本公开，可以实施和执行本文中公开和所要求的所有方法。尽管已经涉及优选实施方案来描述本发明的方法，但是本领域技术人员明白，在不偏离本发明的概念、精神和范围的条件下，可对方法、或本文所述的方法的步骤或步骤顺序进行改变。更具体地，明显的是，化学和生理相关的某些药剂可代替本文中所述的药剂，同时将实现相同或类似的结果。本领域技术人员明白的所有这些类似的代替和修改被认为在所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念内。实施例下列实施例被包括以证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该意识到下面实施例中公开的技术表示本发明人所发现的技术，其在实施本发明中发挥良好，并且因此可被认为构成其实施的优选方式。然而考虑本公开，本领域技术人员应该意识到在不偏离本发明的精神和范围的条件下，可以对公开的特定实施方案进行多种改变，并且仍旧获得相同或类似的结果。实施例1 载脂蛋白E同种型稳定的同位素标记动力学载脂蛋白E(ApoE)是阿耳茨海默氏病的主要风险因素。人有三种导致ApoE同种型的主要等位基因ApoE2(cysll2，cysl58)、ApoE3 (cysll2，argl58)和 ApoE4 (argll2， argl58)。下列例子证实使用稳定同位素-标记串联质谱在相同样品中同时检测和定量不同ApoE同种型的方法。ApoE源是13C-标记的和未标记的生物样品。标记的和未标记的人CSF样品得自正在进行的体内稳定的同位素标记研究。星形细胞培养基收集自永生小鼠星形细胞，所述永生小鼠星形细胞衍生自敲入小鼠表达人ApoE2或ApoE4。使细胞在含有血清的生长培养基中生长至接近融汇，此时培养基改变至无血清培养基M小时，所述培养基补充0、1. 25、 2. 5、5、10 或 20% 13C6-亮氨酸(98% 13C6, Cambridge Isotope Laboratories, Andover,ΜΑ) ApoE通过下列方式分离和耦合CNBr-激活的kpharose珠的抗-ApoE抗体 (WUE4)孵育过夜，或者和 PHM-LiposorbTM(Calbiochem，San Diego, CA)孵育 30mir^4°C )。 将珠用PBS和IOOmM Tris, pH 8. 5洗涤。结合的ApoE蛋白使用三氟乙醇(40%，在25mM 碳酸氢铵上)变性。在变性后，ApoE蛋白在室温下用5mM 二硫苏糖醇(DTT)还原30min，并且在黑暗中在室温下用IOmM碘乙酰胺(IAM)烷基化30min。将样品在珠上在37°C下使用 0. 5μ g的胰蛋白酶消化过夜。在使用Nu-tip碳尖(Glygen Corp. ,Columbia,MD)脱盐后，将含有 ApoE 肽的上清通过之前描述(Bateman et al. ,2006, Nature Medicine, 12 :856-861) 的纳升-LC 串联MS(Thermo-Finnigan LTQ，装备有 New Objective nanoflow ESI 源)来分析。样品使用由 Bateman et al. 2007 J Am Soc Mass Spectrum 18(6) :007-1006 描述的稳定同位素串联标记的(SILT)质谱法来定量。标记的离子质量偏移6、3、2或1.5m/z，这取决于任何特定前体的电荷(即，分别+1、+21、+3或+4)。标记的ApoE的百分率使用标记与未标记的肽的所有b和y离子的比来计算。检测4种同位素特异性ApoE肽(参见表1)。当集合在一起时，ApoE2和ApoE4培养基产生所有四种同种型特定肽(图1)。类似地，所有四种肽在来自表达两种不同同种型的杂合个体的CSF中进行检测(图幻。图1和2中检测的ApoE肽产生自ApoE蛋白，该蛋白通过吸附至Liposorb而分离。图3示出ApoE3肽的检测，该肽产生自ApoE蛋白，该蛋白通过免疫沉淀法分离。相对于测定对预计的标记与未标记的肽的百分率，所有四种ApoE肽在1-20% 13C-标记范围内显示强烈线性相关(图4)。这些数据指示这些同种型特定肽的检测对于定量是牢靠的和可重现的。表1.人ApoE同种型特异性胰蛋白酶肽
1权利要求
1.一种同时测量产生在受试者的中枢神经系统中产生的生物分子的两种或多种同种型的体内代谢的方法，该方法包括a)将标记的部分施用至所述受试者，在所述受试者中产生所述生物分子时，所述标记的部分引入所述生物分子中；b)从所述受试者获得生物样品，所述生物样品包含用所述部分标记的第一生物分子级分和不用所述部分标记的第二生物分子级分，所述第一生物分子级分包含所述生物分子的两种或多种标记的同种型，并且所述第二生物分子级分包含所述生物分子的两种或多种未标记的同种型；以及c)检测各标记的同种型的量和各未标记的同种型的量，其中对于特定同种型的标记的同种型与未标记的同种型的比例直接成比例于所述受试者中所述特定同种型的代谢。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物分子是蛋白，所述蛋白的两种或多种同种型选自通过蛋白酶活性体内产生的裂解片段、通过非蛋白酶活性体内产生的裂解片段、 所述蛋白的遗传等位基因、RNA加工产物和翻译后产物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述遗传等位基因、RNA加工产物和翻译后产物在步骤(c)中检测为通过蛋白酶活性离体产生的同种型特异性片段。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述蛋白选自淀粉样_β、载脂蛋白E、载脂蛋白 1、突触核蛋白、可溶性淀粉样前体蛋白、1^1130 -43、亨廷顿蛋白、前颗粒蛋白、0-2巨球蛋白、S100B、髓鞘碱性蛋白、白细胞介素和TNF。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记的部分包含选自2H、13C、15N、170、180、33S、 34S和siS的非放射活性同位素。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记的部分是包含1V的氨基酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记的部分通过选自静脉内、动脉内、皮下、 腹膜内、肌肉内和口服的途径施用至所述受试者。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品选自脑脊髓液、血液、尿液、唾液、 眼泪、脑组织和脊髓组织。
9.根据权利要求1所述的方法，还包括从所述生物样品分离所述标记的同种型和所述未标记的同种型。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述标记的片段和所述未标记的片段通过选自下列的方法分离自所述生物样品免疫沉淀法、吸附至衍生聚合物、液相色谱法及其组合。
11.根据权利要求1所述的方法，其中各标记的同种型的量和各未标记的同种型的量通过质谱检测。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物分子是蛋白；所述标记的部分是13C6-亮氨酸；所述蛋白是载脂蛋白E(ApoE) ；ApoE通过免疫沉淀法或吸附至衍生多羟基亚甲基聚合物分离自所述生物样品；被检测的所述同种型是通过ApoE的离体裂解产生的ApoE同种型特异性片段；以及所述标记的和未标记的同种型通过质谱检测。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物分子是蛋白；所述标记的部分是13C6-亮氨酸；所述蛋白是淀粉样前体蛋白(APP)；所述同种型是可溶性APP-α和可溶性ΑΡΡ-β ； 所述标记的和未标记的同种型通过免疫沉淀法分离自所述样品；以及所述标记的和未标记的同种型通过质谱检测。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物分子是蛋白；所述标记的部分是 13C6-亮氨酸；所述蛋白是淀粉样- β ；所述同种型选自淀粉样- β i_38、淀粉样- β M9、淀粉样-β ^、淀粉样-β H1和淀粉样-β H2 ；所述标记的和未标记的同种型通过免疫沉淀法分离自所述样品；以及所述标记的和未标记的同种型通过质谱检测。
15.一种确定治疗剂是否影响在受试者的中枢神经系统中产生的生物分子的两种或多种同种型的体内代谢的方法，该方法包括a)将所述治疗剂施用至所述受试者；b)将标记的部分施用至所述受试者，在所述受试者中产生所述生物分子时，所述标记的部分引入所述生物分子中；c)从所述受试者获得生物样品，所述生物样品包含用所述部分标记的第一生物分子级分和不用所述部分标记的第二生物分子级分，所述第一生物分子级分包含所述生物分子的两种或多种标记的同种型，并且所述第二生物分子级分包含所述生物分子的两种或多种未标记的同种型；d)检测所述生物样品中各标记的同种型的量和各未标记的同种型的量，其中对于特定同种型的标记的同种型与未标记的同种型的比例直接成比例于所述受试者中所述特定同种型的代谢；以及e)比较各同种型的代谢和合适的对照值，使得对于特定同种型从所述对照值的改变指示所述治疗剂影响在所述受试者的所述中枢神经系统中所述特定同种型的代谢。
16.根据权利要求15所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前进行。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物分子是蛋白，所述蛋白的两种或多种同种型选自通过蛋白酶活性体内产生的裂解片段、通过非蛋白酶活性体内产生的裂解片段、所述蛋白的遗传等位基因、RNA加工产物和翻译后产物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述遗传等位基因、RNA加工产物和翻译后产物在步骤(d)中检测为通过蛋白酶活性离体产生的同种型特异性片段。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述蛋白选自淀粉样-β、载脂蛋白E、载脂蛋白J、突触核蛋白、可溶性淀粉样前体蛋白、Tau、TDP-43、亨廷顿蛋白、前颗粒蛋白、α _2巨球蛋白、S100B、髓鞘碱性蛋白、白细胞介素和TNF。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述标记的部分包含选自咕、13(、151170、180、335、 34S和siS的非放射活性同位素。
21.根据权利要求15所述的方法，其中所述标记的部分是包含13C的氨基酸。
22.根据权利要求15所述的方法，其中所述标记的部分通过选自静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌肉内和口服的途径施用至所述受试者。
23.根据权利要求15所述的方法，其中所述治疗剂通过选自静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌肉内和口服的途径施用至所述受试者。
24.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物样品选自脑脊髓液、血液、尿液、唾液、眼泪、脑组织和脊髓组织。
25.根据权利要求15所述的方法，其中所述合适的对照值选自施用所述治疗剂之前的相同受试者、未施用所述治疗剂的对照受试者和对照同种型。
26.根据权利要求15所述的方法，还包括从所述生物样品分离所述标记的同种型和所述未标记的同种型。
27.根据权利要求沈所述的方法，其中所述标记的同种型和所述未标记的同种型通过选自下列的方法分离自所述生物样品免疫沉淀法、吸附至衍生聚合物、液相色谱法及其组合。
28.根据权利要求15所述的方法，其中各标记的同种型的量和各未标记的同种型的量通过质谱检测。
29.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物分子是蛋白；所述标记的部分是 UC6-亮氨酸；所述蛋白是载脂蛋白E(ApoE) ；ApoE通过免疫沉淀法或吸附至衍生多羟基亚甲基聚合物分离自所述生物样品；被检测的所述同种型是通过ApoE的离体裂解产生的 ApoE同种型特异性片段；以及所述标记的和未标记的同种型通过质谱检测。
30.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物分子是蛋白；所述标记的部分是 UC6-亮氨酸；所述蛋白是淀粉样前体蛋白(APP)；所述同种型是可溶性APP-α和可溶性 APP-β ；所述标记的和未标记的同种型通过免疫沉淀法分离自所述样品；以及所述标记的和未标记的同种型通过质谱检测。
31.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物分子是蛋白；所述蛋白是淀粉样-β； 所述标记的部分是1%-亮氨酸；所述同种型选自淀粉样-β i-38、淀粉样-β H9、淀粉样-β ^、淀粉样-β H1和淀粉样-β H2 ；所述标记的和未标记的同种型通过免疫沉淀法分离自所述样品；以及所述标记的和未标记的同种型通过质谱检测。
全文摘要
本发明包括同时测量生物分子的两种或多种同种型的体内代谢的方法。生物分子典型地产生在中枢神经系统中。
文档编号G01N33/48GK102246033SQ200980150353
公开日2011年11月16日 申请日期2009年11月12日 优先权日2008年11月12日
发明者J·多布罗夫斯卡, K·G·穆恩耶加, K·R·怀尔德史密斯, L·芒赛尔, R·J·贝特曼 申请人:华盛顿大学
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