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专利名称：：一种快速miRNAs茎环法检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本实用新型涉及一种快速miRNAs茎环法检测试剂盒。
背景技术：
：miRNAs是一类非编码、内源性的小RNA，生物体内源长度约2023个核苷酸(nucleotides,nt)，miRNAs由基因组DNA编码，在细胞核内由RNA聚合酶II转录为几百个核苷酸(nt)的初级转录本(pri-miRNA)。该茎-环结构的pri-miRNA被RNaseIII家族成员Drosha剪切成约70nt的发夹结构前体pre-miRNA。随后pre-miRNA被转运出细胞核，并进一步由胞桨的RNaseIII家族成员Dicer加工成miRNAs。植物中miRNAs的作用策略与siRNA类似，即通过碱基精确配对方式结合于耙mRNA的3'-UTR或开放阅读框，导致靶mRNA转录沉默。但绝大多数哺乳动物miRNAs则通过部分碱基配对结合于靶mRNA的3'-UTR，导致耙mRNA的特异性剪切或转录阻遏。miRNAs对转录后水平的基因调控广泛存在于真核生物的发育和代谢过程，包括细胞凋亡、细胞增殖、细胞分化、脂肪代谢、胰岛素分泌、免疫调节、应激反应等，并呈现时空表达特异性。miRNAs在人类基因组中miRNAs基因占据大约1%的数量，虽然在不同的时空发育阶段，它们的表达量不同，但是多种miRNAs在同一个细胞中的表达使得细胞处在一种内在的miRNAs环境中，这个环境控制着成千上万的编码基因的miRNAs水平，使得各种蛋白的表达处在一个适合的水平。miRNAs为非编码基因，无poly(A)尾，在进化上保守，并广泛存在于动物、植物、真菌及病毒基因组中。目前在人类中已发现695条miRNAs分子，但科学家预测人类基因组可能含有约1000条特异的miRNAs,它们调控近30%的基因表达。最近，研究发现许多miRNAs基因定位于与疾病相关的基因位点附近，并在肿瘤发生过程中有差异表达，而有的miRNAs可以作为早期癌症检测的生物标记。快速检测不同来源样品中miRNAs含量就成了人们研究中显得越来越重要了，但现有的一些检测技术，反应灵敏度、高重复性和高精确性还不能满足人们的需要。
发明内容本实用新型的目的是提供一种可用来快速检测不同来源样品中miRNAs含量，具有特异性更强、结果更精确、重复性更好的快速miRNAs茎环法检测试剂盒。本实用新型的目的通过以下技术方案来实现。一种快速miRNAs茎环法检测试剂盒，包括外盒体、内盒体，内盒体上设有承载孔，内盒体置于外盒体内，其特征在于所述内盒体上的承载孔内放置有装有用于配制逆转录反应体系的试剂的试剂瓶组、装有用于配置PCR反应体系的试剂的试剂瓶组，其中装有用于配制逆转录反应体系的试剂的试剂瓶组包括装有Stem-loopRTPrimer试剂的试剂瓶、装有dNTP试剂的试剂瓶、装有M-MLV试剂的试剂瓶、装有RTBuffer试剂的试剂瓶、装有RNaseInhibitor试剂的试剂瓶、装有DEPC水的试剂瓶，装有用于配置PCR反应体系的试剂的试剂瓶组包括装有SpecificForwardPrimer试剂的试剂瓶、装有Stem-loopqPCRPrimer试剂的试剂瓶、装有SYBRGreenMasterMix试剂的试剂瓶、装有灭菌蒸馏水的试剂瓶。所述装有M-MLV试剂的试剂瓶中的M-MLV的体积规格为5u1、装有RNaseInhibitor试剂的试剂瓶中的RNaseInhibitor体积规格为5p1、装有Stem-loopqPCRPrimer试剂的试剂瓶中的Stem-loopqPCRPrimer体积规格为20y1、装有dNTP试剂的试剂瓶中的dNTP体积规格为40ti1、装有SYBRGreenMasterMix试剂的试剂瓶中的SYBRGreenMasterMix体积规格为1000y1、装有Stem-loopqPCRPrimer试剂的试剂瓶中的Stem-loopqPCRPrimer体积规格为50u1、装有SpecificForwardPrimer试剂的试剂瓶中的SpecificForwardPrimer体积规格为50ii1、装有DEPC水的试剂瓶中的DEPC水体积规格为500ul、装有灭菌蒸馏水的试剂瓶中的灭菌蒸馏水体积规格为lml，其中装有RTBuffer试剂的试剂瓶中的RTBuffer5XRTBuffer体积规格为40ul。所述装有用于配制逆转录反应体系的试剂的试剂瓶组还包括装有非编码的总RNA的试剂瓶，总RNA的0D26。/0D^值在1.62.0之间，装有用于配置PCR反应体系的试剂的试剂瓶组还包括装有cDNA试剂的试剂瓶。所述外盒体通过薄膜封装。本实用新型与现有技术相比具有以下优点本实用新型由于在试剂瓶内装有用于配制逆转录反应体系的试剂、用于配置PCR反应体系的试剂，其中用于配制逆转录反应体系的试剂包括Stem-loopRTPrimer试剂、dNTP试剂、M-MLV试剂、RTBuffer试剂、RNaseInhibitor试剂、DEPC水，用于配置PCR反应体系的试齐U包括SpecificForwardPrimer试齐!]、Stem—loopqPCRPrimer试剂、SYBRGreenMasterMix试剂、灭菌蒸馏水，DEPC水、灭菌蒸馏水分及其余各试剂分别装于对应的试剂瓶内，各试剂瓶分别放置在内盒体上的承载孔内，这样本实用新型便提供了快速检测不同来源样品中miRNAs含量的方法。该试剂盒利用M-MLVRTase和独特设计逆转录引物(Stem-loopRTPrimer),将样本中特定的miRNAs逆转录为3'端带有茎环结构接头的cDNA，最后利用miRNAs特异性引物(Stem-loopqPCRForwardPrimer)和茎环接头配对引物(Stem-loopqPCRReversePrimer)以SYBRGreenI为荧光染料进行miRNAs快速定量检测。本试剂盒采用茎环法逆转录和SYBR定量PCR技术相结合，因此具有特异性更强、结果更精确、重复性更好的特点。本实用新型具有以下特点l)起始材料需要量少，低至10ng的总RNA样品便能用于本试剂盒检测；2)特异性强，更高精确度；3)极高的灵敏度，更广的动态变化范围。按推荐方案使用可获得最强的PCR扩增信号，可检测低至10个拷贝的miRNAs(检测7个数量级范围的动态变化)；4)更快速地进行检测，可短至3h内便可获得高质量数据。图1为本实用新型快速miRNAs茎环法检测试剂盒结构示意图。具体实施方式以下结合附图对本实用新型快速miRNAs茎环法检测试剂盒作进一步详细描述。如图1所示，本实用新型快速miRNAs茎环法检测试剂盒，包括外盒体1、内盒体2、用于配制逆转录反应体系的试剂3、用于配置PCR反应体系的试剂4，内盒体2上设有承载孔21，其中用于配制逆转录反应体系的试剂3包括Stem-loopRTPrimer试剂、dNTP试剂、M-MLV试剂、RTBuffer试剂、RNaseInhibitor试剂、DEPC水，用于配置PCR反应体系的试剂4包括SpecificForwardPrimer试剂、Stem-loopqPCRPrimer试剂、SYBRGreenMasterMix试剂、灭菌蒸馏水，DEPC水、灭菌蒸馏水分及其余各试剂分别装于对应的单个试剂瓶内，各试剂瓶分别放置在内盒体2上的承载孔21内。内盒体2置于外盒体1内，外盒体1通过薄膜封装。操作方法所需其他材料还包括1.)样品质量好纯度高的总RNA10ng10Pg或纯化的小分子RNA10ng2.5ug。2.)试剂抽提RNA需要使用Trizol，Tris饱和酚(pH4.5)，氯仿，异丙醇，或RNA抽提试剂盒;用于定量PCR的上游引物(10uM)。3.)仪器PCR仪或恒温仪、离心机、定量PCR仪。4.)耗材无RNase、DNase的枪头、离心管，移液器等。1.逆转录miRNAs在M-MLV逆转录酶作用下，PolyA化的miRNAs被逆转录为带有锚定序列的单链cDNA。本试剂盒的反转录系统提供经过检验的试剂，能够在40min之内对总RNA或poly(A)RNA进行高效的反转录，其产物可直接用于QPCR反应。①将2总RNA加入无RNase的EP管中，并于65。C温育5min。反应完毕立即置于冰上。进行RNA相关操作，需要严格防止污染。所有用于实验操作的离心管和枪头都应去除DNase、RNase并进行高温灭菌处理；实验操作人6员需戴口罩和一次性橡胶手套；所有反应液的配制等都需在冰上完成。总RNA起始用量在10ng10Pg之间，可根据样品的miRNAs丰度进行调整。最佳的总RNA用量在100ng到1.0化之间。如使用纯化的小分子RNA，其使用量可在IOng2.5Pg之间调整。②按下表顺序配制逆转录反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>依据RNA的用量多少，反应体积可以等倍增减。③RT反应轻弹混匀反应混合物，短暂离心后置于42"C反应30min。反应结束后于95。C加热5min终止反应。若时间充裕，采用3(TC反应10min，接着42匸反应30min的RT程序，效果更好。cDNA模板稀释RT所得cDNA模板用去离子水稀释5倍，轻弹混匀并短暂离心后，可立即进行miRNAs定量分析，也可分装保存于-20°C。2.miRNAs的qPCR检测本试剂盒采用SYBRGreenI嵌合荧光法进行miRNAs实时荧光定量PCR分析。SYBRGreenI是一种结合于双链DNA小沟的荧光染料。在PCR反应体系中，加入过量SYBRGreenI荧光染料，SYBRGreenI荧光染料特异性地掺入双链DNA后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBRGreenI染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。①冰上配置下列PCR反应体系:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>用于qPCR的cDNA模板的添加量通常在100ng以下。不同种类的cDNA模板中含有耙miRNAs的含量不同，必要时可进行梯度稀释，以确定最佳模板浓度。引物的浓度为0.2MM时，进行qPCR的结果较好。反应性能较差时，引物浓度可在O.1l.OMM之间调整。进行miRNAs定量PCR检测，建议设置其他无相关、表达稳定的小分子RNA作为内参，例如U6snRNA、5SrRNA、tRNA。检测双内参可以使数据更为准确和具说服力。有时miRNAs如let-7a、miR-10b、miR_16、miR-21也被用作miRNAs定量的内参。建议反应液体积为2050②进行QPCR反应事先设置好仪器参数(以ABI-PRISM7000/7700/7900HT仪器为例)。充分混匀反应混合物，短暂离心后将反应管置于机器内，然后进行PCR反应。SYBRGreenMasterMix中含有R0X校正染料，用于校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，可以使用在ABI、Stratagene、Roche等公司的Real-TimePCR扩增仪上。使用其他仪器进行定量PCR分析时，请按照仪器说明调整反应条件。使用SYBRGreenI染料进行qPCR，需要监测产物的溶解曲线。单一的PCR产物只有一个熔解峰。权利要求1、一种快速miRNAs茎环法检测试剂盒，包括外盒体、内盒体，内盒体上设有承载孔，内盒体置于外盒体内，其特征在于所述内盒体上的承载孔内放置有装有用于配制逆转录反应体系的试剂的试剂瓶组、装有用于配置PCR反应体系的试剂的试剂瓶组，其中装有用于配制逆转录反应体系的试剂的试剂瓶组包括装有Stem-loopRTPrimer试剂的试剂瓶、装有dNTP试剂的试剂瓶、装有M-MLV试剂的试剂瓶、装有RTBuffer试剂的试剂瓶、装有RNaseInhibitor试剂的试剂瓶、装有DEPC水的试剂瓶，装有用于配置PCR反应体系的试剂的试剂瓶组包括装有SpecificForwardPrimer试剂的试剂瓶、装有Stem-loopqPCRPrimer试剂的试剂瓶、装有SYBRGreenMasterMix试剂的试剂瓶、装有灭菌蒸馏水的试剂瓶。2.根据权利要求1所述的快速miRNAs茎环法检测试剂盒，其特征在于所述装有M-MLV试剂的试剂瓶中的M-MLV的体积规格为5"1、装有RNaseInhibitor试剂的试剂瓶中的RNaseInhibitor体积规格为5ul、装有Stem-loopqPCRPrimer试剂的试剂瓶中的Stem-loopqPCRPrimer体积规格为20y1、装有dNTP试剂的试剂瓶中的dNTP体积规格为40u1、装有SYBRGreenMasterMix试剂的试剂瓶中的SYBRGreenMasterMix体积规格为1000u1、装有Stem-loopqPCRPrimer试剂的试剂瓶中的Stem-loopqPCRPrimer体积规格为50u1、装有SpecificForwardPrimer试剂的试剂瓶中的SpecificForwardPrimer体积规格为50u1、装有DEPC水的试剂瓶中的DEPC水体积规格为500u1、装有灭菌蒸馏水的试剂瓶中的灭菌蒸馏水体积规格为1ml，其中装有RTBuffer试剂的试剂瓶中的RTBuffer5XRTBuffer体积规格为40u1。3.根据权利要求1所述的快速miRNAs茎环法检测试剂盒，其特征在于所述装有用于配制逆转录反应体系的试剂的试剂瓶组还包括装有非编码的总RNA的试剂瓶，总RNA的0D26Q/0D咖值在1.62.0之间，装有用于配置PCR反应体系的试剂的试剂瓶组还包括装有cDNA试剂的试剂瓶。4.根据权利要求2或3所述的快速miRNAs茎环法检测试剂盒，其特征在于所述外盒体通过薄膜封装。专利摘要本实用新型公开了一种快速miRNAs茎环法检测试剂盒，包括外盒体、内盒体，内盒体上设有承载孔，其特征在于所述miRNA定量PCR检测试剂盒还包括用于配制逆转录反应体系的试剂、用于配置PCR反应体系的试剂，其中用于配制逆转录反应体系的试剂包括Stem-loopRTPrimer试剂、dNTP试剂、M-MLV试剂、RTBuffer试剂、RNaseInhibitor试剂、DEPC水，用于配置PCR反应体系的试剂包括SpecificForwardPrimer试剂、Stem-loopqPCRPrimer试剂、SYBRGreenMasterMix试剂、灭菌蒸馏水，DEPC水、灭菌蒸馏水分及其余各试剂分别装于对应的试剂瓶内，各试剂瓶分别放置在内盒体上的承载孔内。本实用新型具有特异性更强、结果更精确、重复性更好的优点。文档编号G01N21/64GK201381321SQ20092005258公开日2010年1月13日申请日期2009年3月13日优先权日2009年3月13日发明者孙奋勇申请人:广州华灿医药科技有限公司