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专利名称：系统性红斑狼疮阶段性蛋白表达差异图谱模型及构建方法
系统性红斑狼疮阶段性蛋白表达差异图谱模型及构建方法技术领域：
本发明涉及蛋白组学技术领域，尤其涉及一种系统性红斑狼疮阶段性蛋白表达差 异图谱模型及其构建方法。
背景技术：
系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种累及全身多个系 统，复发和缓解交替出现的自身免疫性疾�。�男女在各年龄阶段均可发�。�但首次发病以40 岁以下的年轻女性为主。该病的病程长，结果不可预知，任何器官都可受损。常见的临床症 状包括疲乏、发热、关节炎等等；尽管近些年SLE患者的治疗、预后和长期存活已得到明显 改善，SLE的发病率和死亡率仍然较高，大多数病人随着病程的延长会出现明显的器官受损 和功能受限，严重者可出现包括肾、肺、心脏、脑等多器官的病理损害。同时，由于病理损害 所致的相应器官功能受限，影响患者的日常生活和工作，甚至丧失工作能力，在加重患者及 其家人的生活负担及心理负担的同时，进一步加重了社会负担。SLE的致病机制尚未完全阐明，涉及遗传、T/B细胞调节性功能缺陷、感染、激素、 环境因素等多种内在因素和外部因素的复杂作用。其中，淋巴细胞异常凋亡及活化、Thl和 Th2调节失衡，淋巴细胞分泌功能及其免疫通路异常等被认为在SLE的致病中发挥了非常 重要的作用。另一方面，由于SLE临床表现复杂，SLE的早期和准确诊断仍然是困扰临床医 生的一大难题。传统的实验室诊断方法包括抗核抗体的检查等无论是特异性还是敏感性 都不能有效地满足临床需求，也没有发现能较好地反应SLE疾病活动情况的标志物来监测 SLE的疾病进程。

发明内容基于此，有必要提供一种系统性红斑狼疮阶段性蛋白表达差异图谱模型，以用于 研究SLE的发病机理，为SLE的诊断和治疗提供新途径。此外，还有必要提供一种系统性红斑狼疮阶段性蛋白表达差异图谱模型的构建方 法。一种系统性红斑狼疮阶段性蛋白表达差异图谱模型，包括系统性红斑狼疮稳定组与健康对照组的阶段性蛋白表达差异图谱，由分类号 为 IPI00908723、IPI00873029、IPI00910473 的表达上调蛋白和分类号为 IPI00219420、 IPI00027462、IPI00007047、IPI00218131、IPI00019038、IPI00917714 的表达下调蛋白构 成；系统性红斑狼疮活动组与健康对照组的阶段性蛋白表达差异图谱，由分类号 为 IPI00908723、 IPI00743870、 IPI00940952、 IPI00291764、 IPI00027409、 IPI00299024、 IPI00017526、 IPI0000572U IPI00168213、 IPI00942787、 IPI00784258、 IPI00006988, IPI00873029、IPI00419722、IPI00930596, IPI00217465、IPI00910615、IPI00926799、 IPI00795501、IPI00910473 的表达上调蛋白和分类号为 IPI00917714、IPI00552225、IPI00941907、 IPI00220278、 IPI00289944、 IPI0001893U IPI0091740U IPI00339385、 IPI00940950, IPI00640525, IPI00219097、IPI00009904, IPI00645646, IPI00011770、 IPI00012269的表达下调蛋白构成；系统性红斑狼疮稳定组与类风湿性关节炎对照组的阶段性蛋白表达差异图 谱，由分类号为 IPI00856098、IPI00872028、IPI00797175、IPI00873029、IPI00908723、 IPI00420108、 IPI00646486、 IPI00930363、 IPI00909717、 IPI00921274、 IPI00021855 的表达上调蛋白和分类号为 IPI00219420、IPI00941854、IPI00289944、IPI00006988、 IPI00917714、IPI00026627、IPI00930688、IPI00878066 的表达下调蛋白构成；系统性红斑狼疮活动组与类风湿性关节炎对照组的阶段性蛋白表达差异图 谱，由分类号为 IPI00908723、IPI00797175、IPI00784258、IPI00873029、IPI00816779、 IPI00743870、 IPI00921274、 IPI00291764、 IPI0047919U IPI00872028,IPI00027409, IPI00217465、IPI00218131 的表达上调蛋白和分类号为 IPI00917714、IPI00289944、 IPI00220278、 IPI00930688、 IPI00552225、 IPI00941907、 IPI00472138、 IPI00339385、 IPI00940950, IPI00917064, IPI00022445, IPI00220739, IPI00938244, IPI00645646, IPI00640525、IPI00021766、IPI00011770、IPI00791367、IPI00937584、IPI00940441 的表 达下调蛋白构成；以及系统性红斑狼疮活动组与系统性红斑狼疮稳定组的阶段性蛋白表达差异图 谱，由分类号为 IPI00219420、IPI00291764、IPI00006988、IPI00941854、IPI00017526、 IPI00026627、 IPI00784258、 IPI00743870、 IPI00027409、 IPI00643623、 IPI00218131、 IPI00942787、 IPI0000572U IPI00292532、 IPI00299024,IPI0094196U IPI00910615 的表达上调蛋白和分类号为 IPI00856098、IPI00220278、IPI00009904、IPI00420108、 IPI00552225、 IPI00930363、 IPI00941907、 IPI00012269、 IPI00220739、 IPI00646486、 IPI00640525、IPI00339385、IPI00917714 的表达下调蛋白构成；其中，各分类号为International Protein Index human V 3. 62蛋白数据库中的 蛋白分类号。优选的，蛋白表达差异图谱由相对和绝对定量的等量异位标签多重标记的外周血 单个核细胞全组蛋白，经串联质谱分析仪系统检测蛋白波谱，再经过软件统计进行报告离 子的相对定量分析得到。优选的，软件为ProteinPilot 3.0 Software。优选的，在相对定量分析中，采用质荷比114、115、116、117报告离子峰积分面积， 以质荷比114的报告离子峰为对照，按115 114,116 114,117 114的比值，选择比值 大于等于2或比值小于等于0. 5的结果进行报告，其中，比值大于等于2为蛋白表达上调， 比值小于等于0. 5为蛋白表达下调。一种如权利要求1的系统性红斑狼疮阶段性蛋白表达差异图谱模型的构建方法， 包括如下步骤分别采集系统性红斑狼疮稳定组、系统性红斑狼疮活动组、健康对照组、类 风湿性关节炎对照组的外周血单个核细胞标本；分别对各外周血单个核细胞标本进行细胞 总蛋白抽提和蛋白浓度测定；将细胞总蛋白经胰蛋白酶消化后，用相对和绝对定量的等量 异位标签标记，得到相对和绝对定量的等量异位标签多重标记的多肽；将多肽经强阳离子 交换和反相液相色谱分离，再进行串联质谱鉴定和相对定量分析，得到上述系统性红斑狼疮阶段性蛋白表达差异图谱模型。优选的，串联质谱鉴定过程中，采用一级质谱激光激发800次，在阳离子模式下用 反射模式进行检测，选择信噪比大于40的母离子进行二级质谱分析，采用二级质谱激光激 发1600次，碰撞能量为lkV，碰撞诱导解离小室内的氮气压力维持在2. OX 10_4Pa。优选的，相对定量分析使用的软件为ProteinPilot 3.0 Software.优选的，相对定量分析过程中设定蛋白置信度大于95%或ProtScore大于1. 3。优选的，在相对定量分析过程中，采用质荷比114、115、116、117报告离子峰积分 面积，以质荷比114的报告离子峰为对照，按115 114、116 114、117 114的比值，选 择比值大于等于2或比值小于等于0.5的结果进行报告，其中，选取报告离子的峰面积分面 积比值大于等于2为蛋白表达上调，比值小于等于0. 5为蛋白表达下调。优选的，分别根据报告，选取得到系统性红斑狼疮稳定组与健康对照组的阶段性 蛋白表达差异图谱、系统性红斑狼疮活动组与健康对照组的阶段性蛋白表达差异图谱、系 统性红斑狼疮稳定组与类风湿性关节炎对照组的阶段性蛋白表达差异图谱、系统性红斑狼 疮活动组与类风湿性关节炎对照组的阶段性蛋白表达差异图谱以及系统性红斑狼疮活动 组与系统性红斑狼疮稳定组的阶段性蛋白表达差异图谱，构建成为系统性红斑狼疮的阶段 性蛋白表达差异图谱模型。上述得到的SLE阶段性蛋白表达差异图谱模型，可用于SLE的后续分析，对这些信 息进一步进行验证分析和研究将有助于SLE的原理分析，有助于揭示SLE的致病机制和疾 病进程，对于SLE临床诊断及病情了解具有重要的意义，并为从蛋白质组学的角度探讨SLE 的发病机制及早期诊断提供新思路和新依据。相对和绝对定量的等量异位标签(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)多重标记串联质谱技术可有效地对人外周血单个核细胞蛋白进行鉴 定和相对定量；采用该技术获得了 SLE病人外周血单个核细胞的阶段性蛋白表达差异图谱 模型；深入研究这些蛋白的分子机制将有助于进一步阐明SLE的发病机理，为SLE的诊断和 治疗提供新途径。上述的系统性红斑狼疮的阶段性蛋白表达差异图谱模型的构建方法，设计合理可 行，能够有效地协助建立上述系统性红斑狼疮的阶段性蛋白表达差异图谱模型，获取作为 中间结果的SLE相关信息。

图1为系统性红斑狼疮的阶段性蛋白表达差异图谱构建流程图。
具体实施方式比较蛋白质组学是当今蛋白质组学研究的一个重要领域，比较不同生理和病理状 态下细胞内蛋白质的表达差异，对于揭示生物系统复杂的生理和病理过程具有十分重要的 意义。近年来，为满足定量蛋白质组学研究的需要，基于高度敏感性和精确性的串联质谱分 析进行蛋白质定量的相关标记技术发展迅速，iTRAQ标记串联质谱技术是这些新进展中的 一大主力。本实施例提供了一种系统性红斑狼疮阶段性蛋白表达差异图谱模型的构建方法，
7具体步骤如下分别采集系统性红斑狼疮活动组、系统性红斑狼疮稳定组、健康对照组、类风湿性 关节炎对照组的外周血单个核细胞标本，并对该标本进行细胞总蛋白抽提和蛋白浓度测 定，根据测定的细胞蛋白浓度使用适量的胰蛋白酶进行蛋白消化，然后用相对和绝对定量 的等量异位标签进行多肽标记，再将该标记的多肽经强阳离子交换和反相液相色谱分离， 然后对分离的多肽进行串联质谱鉴定和相对定量分析即得到系统性红斑狼疮的阶段性蛋 白表达差异图谱模型。下面主要结合附图及具体实施例对SLE阶段性蛋白表达差异图谱模型及其构建 方法作进一步的说明。1、材料1.1、主要仪器如下超高速低温离心机紫外分光光度仪(德国Eppendorf公司)真空冷冻干燥机(德国Martin Christ公司)Agilent 1100 series 色谱分离系统(美国 Agilent 公司)Tempo LC MALDI高效液相色谱仪4800 Plus MALDI T0F/T0F 串联质谱分析仪(美国 Applied Biosystems 公司)。1.2、主要试剂如下质谱级超纯水、乙腈(德国Merck公司)、三氟乙酸(TFA)、丙酮(美国Sigma公 司)、外周血单个核细胞分离液Lympholyte -H (加拿大Cedarlane公司)；M-PERs^ 白抽提试剂盒、Pierce BCA (bicinchoninic acid，二喹林甲酸)蛋白定量试剂盒(美 国Pierce公司)、三乙基碳酸氢铵、氯化钾、质谱级胰蛋白酶(美国Promega公司)、iTRAQ 4-plex标记试剂盒及缓冲液(美国Applied Biosystems公司)。1. 3、样本 SLE稳定组女5例，男1例，平均年龄33. 67 士9. 24岁；SLE活动组女5例，男1例， 平均年龄31. 83士7. 96岁；RA (类风湿性关节炎)组女5例，男1例，平均年龄40. 17士 10. 19 岁；健康对照组女5例，男1例，平均年龄35. 67士8. 14岁。其中，SLE的诊断依据 1982 美国 ACR(American College Of Rheumatology, 美国风湿病学学会)修订的诊断标准，并按疾病活动性指数(SLEDAI)将SLE分为稳定 组(SLEDAI ^ 8)和活动组(SLEDAI > 8) ；RA的诊断符合1987年美国ARA (American Rheumatism Association，美国风湿病协会)修订的诊断标准。2、操作步骤，如图1所示为操作流程，具体如下2.1、样品准备2. 1. 1人外周血单个核细胞分离，常用方法有物理方法和化学方法，物理方法如密 度梯度离心法、细胞比重法等，例如常用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法；化学方法如低 渗盐水法、氯化铵溶红细胞法等。下面按照一种相关试剂盒的操作说明书，说明分离步骤如 下(1)、收集肝素锂抗凝全血约5ml，用等量的PBS(Phosphate buffer saline，磷 酸盐缓冲液)稀释，将稀释后的血液轻置于Lympholyte -H分离液的上层，并于22°C、14，OOOg条件下离心IOmin ；(2)、弃掉上层血浆，吸取中间层的单个核细胞至另一试管中，加入5mlPBS，混勻， 洗涤，然后于22°C、14，OOOg条件下离心5min ；(3)、弃掉上清液，重复步骤(2) —次；(4)、弃上清液，将管底的细胞沉淀悬浮于100 μ L的PBS中，用血球计数板在显微 镜下进行细胞计数后转入1. 5ml的EP管中备用。2. 1. 2细胞总蛋白抽提和蛋白浓度测定(1)、按IX IO6个细胞加入约IOOyL蛋白抽提液的比例，加入适量的蛋白抽提液， 然后于220C、14，OOOg离心IOmin,收集上清；(2)、采用BCA蛋白定量试剂盒，以BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白)为 标准品，波长562nm，做标准曲线，然后测定上清液中的蛋白浓度；(3)、每组每例标本分别取40ug蛋白样品等量混合，然后从4组混合样品中各取 IOOug蛋白进行下游的标记试验。2.2、iTRAQ 标记2. 2. 1、丙酮沉淀每组混合样品各取IOOug蛋白，加入6倍体积、-20°C预冷的丙 酮，混勻后于-20°C冻存，过夜后将样品于4°C、5000g条件下离心5min，倒去丙酮，取沉淀、
真空干燥；2. 2. 2、蛋白变性、还原、半胱氨酸封闭和胰酶消化在干燥后的蛋白样品中逐步加 入酶解缓冲液、变性剂和还原剂，混勻，60°C孵育Ih ；然后加入半胱氨酸封闭剂，室温孵育 IOmin ；再加入胰蛋白酶，37°C酶解过夜，其中，酶解缓冲液为0. 5mmol/L、pH 8. 5的三乙基
碳酸氢铵溶液。2. 2. 3、iTRAQ标记乙醇溶解iTRAQ标记试剂，分别加入胰酶消化后的样品中 iTRAQ114-健康对照组，iTRAQ115-SLE 稳定组、iTRAQ116_SLE 活动组、iTRAQ117_RA 组。室 温反应Ih后混合所有标记样品，真空干燥。2. 3、强阳离子交换上述混合标记样品用上样缓冲液(IOmM KH2PO4, 25%乙腈，pH 3. 0)稀释10倍，上 样到强阳离子交换预装柱(35X0. 3mm，300A, 3. 5 μ m，Zorbax Bio-SCX)，用 Agilent 1100 series进行自动梯度洗脱，流速设定为20 μ L/min。先用0_20 %缓冲液B (IOmM KH2PO4, IM KC1，25%乙腈，pH 3.0)洗脱40min，每5min收集一次各盐浓度洗脱下的多肽；再用 20% -50%缓冲液B继续洗脱20min，每IOmin收集一次洗脱液。2. 4、反相液相色谱分离洗脱下来各多肽组分经TempoTM LC MALDI在线分离系统进行自动上样、反相洗脱 和点靶。C18 反相柱规格为 150X0. 2讓，200A,3ym(Michrom Bioresources，美国)。流 动相B由98 %乙腈和0. 1 % TFA组成，流速设定为2 μ L/min,每块MALDI靶板可点样380个 点左右。流动相B的线性梯度(％ eluent B)和洗脱时间(Time)设定如下 2. 5质谱分析及数据库检索用美国AB公司生产的4800 Plus MALDI T0F/T0F蛋白质分析仪进行多肽的串联质 谱鉴定和相对定量分析。一级质谱激光激发800次，在阳离子模式下用反射模式进行检测， 选择信噪比大于40的母离子做二级质谱(MS/MS)分析，每个样品点上最多选择40个母离 子；二级MS/MS激光激发 1600 次，5並撞能量 lkV，CID (Collision induced dissociation，碰 撞诱导解离)碰撞小室内的氮气压力维持在2. 0 X IO-4Pa0用AB分司提供的ProteinPilot 3. 0软件进行报告离子的相对定量分析，选用IPI (International Protein Index)human V 3.62蛋白数据库进行蛋白的检索和鉴定，同时用m/z (mass-to-charge ratio，质荷 比)114、115、116、117报告离子峰积分面积进行相对定量分析，以!11/2 114的报告离子峰为 对照，按115 114,116 114,117 114的比值，选择比值彡2或彡0. 5的结果进行报告， 其中比值彡2为蛋白表达上调，比值< 0. 5为蛋白表达下调。3、结果采用蛋白置信度或ProtScore为指标，其中，ProtScore是ProteinPilot 3. 0软 件中Pro Group 算法的一个值，用于更直观地表示蛋白置信度，其数值越大表示可信度越 高。例如，ProtScore为2.0时，蛋白置信度为99%，ProtScore为1.3时，蛋白置信度为 95% ；下面以蛋白置信度大于95%或ProtScore大于1. 3为限，共鉴定了 4056个肽段、452 个非冗余蛋白，各组之间相对定量结果比较如下3. USLE稳定组与健康对照组的比较蛋白质组学与健康对照组相比，SLE稳定组 有3个蛋白表达上调，6个蛋白表达下调，具体见表1。表1、SLE稳定组与健康对照组相比有显著表达差异的蛋白质 3. 2,SLE活动组与健康对照组的比较蛋白质组学与健康对照组相比，SLE活动组 有20个蛋白表达上调，15个蛋白表达下调，具体见表2。表2、SLE活动组与健康对照组相比有显著表达差异的蛋白质 3. 3,SLE稳定组与RA对照组的比较蛋白质组学与RA对照组相比，SLE稳定组有 11个蛋白表达上调，8个蛋白表达下调，具体见表3。表3、SLE稳定组与RA对照组相比有显著表达差异的蛋白质 3. 4,SLE活动组与RA对照组的比较蛋白质组学与RA对照组相比，SLE活动组有 13个蛋白表达上调，20个蛋白表达下调，具体见表4。表4、SLE活动组与RA对照组相比有显著表达差异的蛋白质 3. 5,SLE活动组与SLE稳定组的比较蛋白质组学与SLE稳定组相比，SLE活动组 有17个蛋白表达上调，13个蛋白表达下调，具体见表5。表5、SLE活动组与SLE稳定组相比有显著表达差异的蛋白质 由上述结果各组对照实验中表达上调蛋白和表达下调蛋白，即构成了 SLE阶段性 蛋白表达差异图谱模型。该模型包括系统性红斑狼疮稳定组与健康对照组的阶段性蛋白 表达差异图谱、系统性红斑狼疮活动组与健康对照组的阶段性蛋白表达差异图谱、系统性 红斑狼疮稳定组与类风湿性关节炎对照组的阶段性蛋白表达差异图谱、系统性红斑狼疮活 动组与类风湿性关节炎对照组的阶段性蛋白表达差异图谱以及系统性红斑狼疮活动组与 系统性红斑狼疮稳定组的阶段性蛋白表达差异图谱。其中，系统性红斑狼疮稳定组与健康对照组的阶段性蛋白表达差异图谱，由分类 号为 IPI00908723、IPI00873029、IPI00910473 的表达上调蛋白和分类号为 IPI00219420、 IPI00027462、IPI00007047、IPI00218131、IPI00019038、IPI00917714 的表达下调蛋白构 成；其中，系统性红斑狼疮活动组与健康对照组的阶段性蛋白表达差异图谱，由分类号为 IPI00908723、IPI00743870、IPI00940952、IPI00291764、IPI00027409、IPI00299024、 IPI00017526、IPI00005721, IPI00168213、IPI00942787、IPI00784258、IPI00006988, IPI00873029、 IPI00419722、 IPI00930596,IPI00217465、 IPI00910615、 IPI00926799、 IPI00795501、IPI00910473 的表达上调蛋白和分类号为 IPI00917714、IPI00552225、 IPI00941907、 IPI00220278、 IPI00289944、 IPI0001893U IPI0091740U IPI00339385、 IPI00940950, IPI00640525, IPI00219097、IPI00009904, IPI00645646, IPI00011770、 IPI00012269的表达下调蛋白构成；其中，系统性红斑狼疮稳定组与类风湿性关节炎对照组的阶段性蛋白表达差异 图谱，由分类号为 IPI00856098、IPI00872028、IPI00797175、IPI00873029、IPI00908723、 IPI00420108、 IPI00646486、 IPI00930363、 IPI00909717、 IPI00921274、 IPI00021855 的表达上调蛋白和分类号为 IPI00219420、IPI00941854、IPI00289944、IPI00006988、 IPI00917714、IPI00026627、IPI00930688、IPI00878066 的表达下调蛋白构成；其中，系统性红斑狼疮活动组与类风湿性关节炎对照组的阶段性蛋白表达差异 图谱，由分类号为 IPI00908723、IPI00797175、IPI00784258、IPI00873029、IPI00816779、 IPI00743870, IPI00921274, IPI00291764, IPI0047919U IPI00872028, IPI00027409, IPI00217465、IPI00218131 的表达上调蛋白和分类号为 IPI00917714、IPI00289944、 IPI00220278、 IPI00930688、 IPI00552225、 IPI00941907、 IPI00472138、 IPI00339385、 IPI00940950, IPI00917064, IPI00022445, IPI00220739, IPI00938244, IPI00645646, IPI00640525、IPI00021766、IPI00011770、IPI00791367、IPI00937584、IPI00940441 的表 达下调蛋白构成；其中，系统性红斑狼疮活动组与系统性红斑狼疮稳定组的阶段性蛋白表达差异 图谱，由分类号为 IPI00219420、IPI00291764、IPI00006988、IPI00941854、IPI00017526、 IPI00026627、 IPI00784258、 IPI00743870、 IPI00027409、 IPI00643623、 IPI00218131、 IPI00942787、IPI0000572U IPI00292532、IPI00299024, IPI0094196U IPI00910615 的表达上调蛋白和分类号为 IPI00856098、IPI00220278、IPI00009904、IPI00420108、 IPI00552225、 IPI00930363、 IPI00941907、 IPI00012269、 IPI00220739、 IPI00646486、 IPI00640525、IPI00339385、IPI00917714 的表达下调蛋白构成；其中，各所述分类号为International Protein Index human V 3. 62蛋白数据库 中的蛋白分类号。或者，各所述分类号在上述数据库中所分别对应的蛋白，为后续蛋白数据 库中的分类号相对应的蛋白。应用于上例，所述蛋白表达差异图谱由相对和绝对定量的等量异位标签多重标记 的外周血单个核细胞全组蛋白，经串联质谱分析仪系统检测蛋白波谱，再经过软件统计进 行报告离子的相对定量分析得到。应用于上述各例，所述软件为ProteinPilot 3.0 Software或同类具有相关功能 的软件。应用于上述各例，在所述相对定量分析中，采用质荷比114、115、116、117报告离 子峰积分面积，以质荷比114的报告离子峰为对照，按115 114,116 114,117 114的 比值，选择比值大于等于2或比值小于等于0. 5的结果进行报告，其中，比值大于等于2为 蛋白表达上调，比值小于等于0. 5为蛋白表达下调。
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综上所述，SLE和RA均为涉及广泛的组织炎性损伤和器官功能异常的自身免疫 性疾�。�研究表明它们的发病都与某些生化因子的作用相关，并具有相同的遗传易感性，但 是，作为一种独立的疾病，SLE与RA又不尽相同，为寻找区别于RA的参与SLE致病的蛋白标 志物，本例对SLE与RA患者的外周血单核细胞进行了比较蛋白组学相对定量分析，与RA相 比，SLE稳定组和SLE活动组分别有11、13个蛋白表达上调，有8、20个蛋白表达下调。对这 些蛋白进行进一步的验证分析和研究将有助于阐明SLE和RA在发病机制上的异同，为SLE 的鉴别诊断与个性化治疗打下基础。通过采用iTRAQ标记相关技术对SLE病人外周血单个核细胞总蛋白进行鉴定和比 较蛋白组学相对定量分析，共鉴定了 452个蛋白，其中有67个蛋白在不同组间出现显著差 异表达，表明将iTRAQ标记串联质谱技术用于SLE病人外周血单个核细胞的比较蛋白组学 分析是一种行之有效的方法。另外通过采用二维凝胶电泳技术对SLE病人和正常人的外周 血单个核细胞进行比较蛋白组学分析，共鉴定了 5个出现差异表达的蛋白，其中表达上调 的谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase)和表达下调的锌指蛋白(zinc finger protein)也在iTRAQ标记中得到证实，且iTRAQ相对定量的比值与二维凝胶电泳相对丰度 的改变保持一致，说明iTRAQ是一种可靠的可用于SLE病人外周血单个核细胞蛋白相对定 量的体外标记技术，因此，iTRAQ在上述各例的应用，其结果是可信的。采用上述系统性红斑狼疮的阶段性蛋白表达差异图谱模型及其构建方法，在“整 体”蛋白组范围内对系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞的“全组”蛋白进行鉴定、比较 和相对定量分析，建立系统性红斑狼疮疾病外周血单个核细胞蛋白的“全组信息”，并绘制 出SLE疾病特异性蛋白图谱，构建图谱模型，以获得参与SLE淋巴细胞调节通路的新的关键 因子，进一步阐明SLE的发病机制，为SLE的诊断和治疗提供新的方法和依据，并有助于作 为新靶点开发临床诊断试剂盒和临床治疗药物。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
权利要求
一种系统性红斑狼疮阶段性蛋白表达差异图谱模型，其特征在于，包括系统性红斑狼疮稳定组与健康对照组的阶段性蛋白表达差异图谱，由分类号为IPI00908723、IPI00873029、IPI00910473的表达上调蛋白和分类号为IPI00219420、IPI00027462、IPI00007047、IPI00218131、IPI00019038、IPI00917714的表达下调蛋白构成；系统性红斑狼疮活动组与健康对照组的阶段性蛋白表达差异图谱，由分类号为IPI00908723、IPI00743870、IPI00940952、IPI00291764、IPI00027409、IPI00299024、IPI00017526、IPI00005721、IPI00168213、IPI00942787、IPI00784258、IPI00006988、IPI00873029、IPI00419722、IPI00930596、IPI00217465、IPI00910615、IPI00926799、IPI00795501、IPI00910473的表达上调蛋白和分类号为IPI00917714、IPI00552225、IPI00941907、IPI00220278、IPI00289944、IPI00018931、IPI00917401、IPI00339385、IPI00940950、IPI00640525、IPI00219097、IPI00009904、IPI00645646、IPI00011770、IPI00012269的表达下调蛋白构成；系统性红斑狼疮稳定组与类风湿性关节炎对照组的阶段性蛋白表达差异图谱，由分类号为IPI00856098、IPI00872028、IPI00797175、IPI00873029、IPI00908723、IPI00420108、IPI00646486、IPI00930363、IPI00909717、IPI00921274、IPI00021855的表达上调蛋白和分类号为IPI00219420、IPI00941854、IPI00289944、IPI00006988、IPI00917714、IPI00026627、IPI00930688、IPI00878066的表达下调蛋白构成；系统性红斑狼疮活动组与类风湿性关节炎对照组的阶段性蛋白表达差异图谱，由分类号为IPI00908723、IPI00797175、IPI00784258、IPI00873029、IPI00816779、IPI00743870、IPI00921274、IPI00291764、IPI00479191、IPI00872028、IPI00027409、IPI00217465、IPI00218131的表达上调蛋白和分类号为IPI00917714、IPI00289944、IPI00220278、IPI00930688、IPI00552225、IPI00941907、IPI00472138、IPI00339385、IPI00940950、IPI00917064、IPI00022445、IPI00220739、IPI00938244、IPI00645646、IPI00640525、IPI00021766、IPI00011770、IPI00791367、IPI00937584、IPI00940441的表达下调蛋白构成；以及系统性红斑狼疮活动组与系统性红斑狼疮稳定组的阶段性蛋白表达差异图谱，由分类号为IPI00219420、IPI00291764、IPI00006988、IPI00941854、IPI00017526、IPI00026627、IPI00784258、IPI00743870、IPI00027409、IPI00643623、IPI00218131、IPI00942787、IPI00005721、IPI00292532、IPI00299024、IPI00941961、IPI00910615的表达上调蛋白和分类号为IPI00856098、IPI00220278、IPI00009904、IPI00420108、IPI00552225、IPI00930363、IPI00941907、IPI00012269、IPI00220739、IPI00646486、IPI00640525、IPI00339385、IPI00917714的表达下调蛋白构成；其中，各所述分类号为International Protein Index human V 3.62蛋白数据库中的蛋白分类号。
2.如权利要求1所述的阶段性蛋白表达差异图谱模型，其特征在于，所述蛋白表达差 异图谱由相对和绝对定量的等量异位标签多重标记的外周血单个核细胞全组蛋白，经串联 质谱分析仪系统检测蛋白波谱，再经过软件统计进行报告离子的相对定量分析得到。
3.如权利要求2所述的阶段性蛋白表达差异图谱模型，其特征在于，所述软件为ProteinPilot 3.0 Software。
4.如权利要求2所述的阶段性蛋白表达差异图谱模型，其特征在于，在所述相对定量 分析中，采用质荷比114、115、116、117报告离子峰积分面积，以质荷比114的报告离子峰为 对照，按115 114,116 114,117 114的比值，选择比值大于等于2或比值小于等于 0. 5的结果进行报告，其中，比值大于等于2为蛋白表达上调，比值小于等于0. 5为蛋白表达 下调。
5.一种如权利要求1所述的系统性红斑狼疮阶段性蛋白表达差异图谱模型的构建方 法，包括如下步骤分别采集系统性红斑狼疮稳定组、系统性红斑狼疮活动组、健康对照组、类风湿性关节 炎对照组的外周血单个核细胞标本；分别对各所述外周血单个核细胞标本进行细胞总蛋白抽提和蛋白浓度测定；将所述细胞总蛋白经蛋白酶消化后，用相对和绝对定量的等量异位标签标记，得到相 对和绝对定量的等量异位标签多重标记的多肽；将所述多肽经强阳离子交换和反相液相色谱分离，再进行串联质谱鉴定和相对定量分 析，得到如权利要求1所述系统性红斑狼疮阶段性蛋白表达差异图谱模型，包括如权利要 求1所述的系统性红斑狼疮稳定组与健康对照组的阶段性蛋白表达差异图谱、系统性红斑 狼疮活动组与健康对照组的阶段性蛋白表达差异图谱、系统性红斑狼疮稳定组与类风湿性 关节炎对照组的阶段性蛋白表达差异图谱、系统性红斑狼疮活动组与类风湿性关节炎对照 组的阶段性蛋白表达差异图谱以及系统性红斑狼疮活动组与系统性红斑狼疮稳定组的阶 段性蛋白表达差异图谱，其中，各蛋白的分类号为International Protein Index human V 3. 62蛋白数据库中的蛋白分类号。
6.如权利要求5所述的系统性红斑狼疮阶段性蛋白表达差异图谱模型的构建方法，其 特征在于，所述串联质谱鉴定过程中，采用一级质谱激光激发800次，在阳离子模式下用反 射模式进行检测，选择信噪比大于40的母离子进行二级质谱分析，采用二级质谱激光激发 1600次，碰撞能量为lkV，碰撞诱导解离小室内的氮气压力维持在2. OX 10_4Pa。
7.如权利要求5所述的系统性红斑狼疮阶段性蛋白表达差异图谱模型的构建方法，其 特征在于，所述相对定量分析使用的软件为ProteinPilot 3. OSoftware0
8.如权利要求7所述的系统性红斑狼疮阶段性蛋白表达差异图谱的构建方法，其特征 在于，所述相对定量分析过程中设定蛋白置信度大于95%或ProtScore大于1. 3。
9.如权利要求7所述的系统性红斑狼疮阶段性蛋白表达差异图谱模型的构建方法，其 特征在于，在所述相对定量分析过程中，采用质荷比114、115、116、117报告离子峰积分面 积，以质荷比114的报告离子峰为对照，按115 114,116 114,117 114的比值，选择 比值大于等于2或比值小于等于0. 5的结果进行报告，其中，选取报告离子的峰面积分面积 比值大于等于2为蛋白表达上调，比值小于等于0. 5为蛋白表达下调。
10.如权利要求9所述的系统性红斑狼疮阶段性蛋白表达差异图谱模型的构建方法， 其特征在于，分别根据所述报告，选取得到所述系统性红斑狼疮稳定组与健康对照组的阶 段性蛋白表达差异图谱、所述系统性红斑狼疮活动组与健康对照组的阶段性蛋白表达差异 图谱、所述系统性红斑狼疮稳定组与类风湿性关节炎对照组的阶段性蛋白表达差异图谱、 所述系统性红斑狼疮活动组与类风湿性关节炎对照组的阶段性蛋白表达差异图谱以及所述系统性红斑狼疮活动组与系统性红斑狼疮稳定组的阶段性蛋白表达差异图谱，构建成为 所述系统性红斑狼疮的阶段性蛋白表达差异图谱模型。
全文摘要
本发明涉及一种系统性红斑狼疮(SLE)阶段性蛋白表达差异图谱模型，通过比较SLE活动期和稳定期病人与正常人或类风湿性关节炎病人蛋白组学的差异，获得系统性红斑狼疮的阶段性蛋白表达差异图谱，对SLE的临床诊断及病情了解具有重要的意义。此外，本发明还涉及一种系统性红斑狼疮阶段性蛋白表达差异图谱模型的构建方法，采用相对和绝对定量的等量异位标签(iTRAQ)多重标记串联质谱技术，可有效地对人外周血单个核细胞蛋白进行鉴定和相对定量；采用该技术获得了SLE病人外周血单个核细胞的阶段性蛋白表达差异图谱模型，有助于进一步阐明SLE的发病机理，为SLE的诊断和治疗提供新途径。
文档编号G01N30/72GK101916325SQ20101022312
公开日2010年12月15日 申请日期2010年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者戴勇, 王林纤 申请人:戴勇;王林纤