专利名称：用于血吸虫病检测的组合检测试剂及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种用于血吸虫病检测的组合检测试剂及检测方法。
背景技术：
血吸虫病是世界性分布的人兽共患寄生虫�。饕餍杏谘侵蕖⒎侵藓屠∶乐薜热却脱侨却�74个国家和地区，受威胁人口约6亿，感染人数约2亿，患者达2千万，�：ρ现�。在我国流行的日本血吸虫(S.japonicum)是�：ψ畲蟮囊恢�。50多年来，虽然我国血吸虫病的防治工作取得了很大成绩，但是，由于各种社会经济原因，本病疫情仍较严重，给疫区人民健康和社会经济发展造成巨大损失。截至1999年，全国尚有119个血吸虫病流行县、市，87万血吸虫病人，54万头病畜。近年部分地区有螺面积扩大，急性感染病人增加，因此，血吸虫病仍然是我国一个重要的公共卫生问题。
在血吸虫病检测中，以粪检虫卵为主的病原学检测虽为经典可靠的“金标准”，但已无法适应当今血吸虫病检测的需要，主要表现在①对慢性感染粪便检查常为阴性；②低度感染容易漏检；③因不易掌握血吸虫在人体内的排卵规律，因而不能满足疫情监测的需要；④粪便检查费时费力，易污染环境。而在免疫学检测中，通常采用的检测方法，由于所用的抗原为成虫(或虫卵)浸出抗原，成份复杂，许多蛋白质并非是抗原蛋白，用粗制抗原进行免疫检测，与许多其它寄生虫抗原(旋毛虫、肝吸虫等)间存在交叉反应，因而免疫检测的特异性不理想，且不易标准化和规模化生产。从其特异性、敏感性、稳定性、实用性、标准化、商品化等综合因素考虑，临床使用效果固然与免疫检测技术有关，但检测所用的抗原/抗体的质量及来源是关键因素。
从防治实际角度讲，理想的血吸虫病检测方法力求同时具备6个条件①敏感特异准确无误；②试剂稳定标准可靠；③操作简便容易推广；④结果客观容易判断；⑤估计虫荷区别病程；⑥疗效考核指导用药。但至今还没有一种方法或检测系统可达到这一标准。为此，开发基因工程重组分子抗原及制备其相应的单克隆抗体，象乙型肝炎检测那样，建立一个组合检测(profile tests)试剂盒，是血吸虫病免疫检测的新模式。该种试剂易标准化，即能大规模应用于现场的血清学检测，又可用于散发病例检测。
目前血吸虫病抗体检测方法多样，从环卵沉淀试验(COPT)、间接荧光抗体试验(IFAT)、间接血凝(IHA)到酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶联免疫印迹(Western blot)等，这些技术各具优缺点。ELISA及其衍生的方法已成为检测血吸虫病的主要辅助检测方法，并广泛用于流行病学调查和散发病例的检测，在传播已控制地区用于综合查病。
发明内容
本发明的目的是开发基因工程重组分子抗原及制备其相应的单克隆抗体，提供一个组合检测试剂盒用于血吸虫病免疫检测。该种试剂易标准化，即能大规模应用于现场的血清学检测，又可用于散发病例检测。
实现上述发明目的的技术解决方案如下1、用于血吸虫病检测的组合检测试剂，其特征在于由下列浓度配比的原料组成重组抗原混合物 0.2-0.4ug/孔重组血吸虫信号蛋白14-3-3单克隆抗体(14-3-3mAb) 0.5-1ug/孔，所述重组抗原混合物为A、重组血吸虫信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3) 0.1-0.2ug/孔B、重组血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶(SjGST) 0.1-0.2ug/孔且A和B按照蛋白质浓度1∶1混合配伍；所述重组血吸虫信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)蛋白质，PI4.86；分子量29KD；含254个氨基酸MRDSFVLQQKDLSPSDLVQIARLAEQAERYDDMAAAMKAYAELPAELGSEERNLFSVAYKNVVGARRSAWRVISAVEHKHDENSKKRQLTKEYRVKMEEELNEICREVLTLLSKYLTPKSNGFESQVFYRKMEGDYYRYLAEVATGDARKEVVEKSQAAYEKATEIAEEMLPSTHPIRLGLALNFSVFYYEIKCDPTQACNLAKRAFDTSIGELDSLQDDSYKDSTLIMQL；所述重组血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶(GST)蛋白质，PI6.35分子量26KD；含218个氨基酸MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPK；
所述重组血吸虫信号蛋白14-3-3单克隆抗体(14-3-3mAb)蛋白质，IgG1抗体；分子量约为140KDL；.
2、根据上述1所述的用于血吸虫病检测的组合检测试剂的检测方法，其特征在于具体检测方法分为两种(1)、重组抗原混合物按照间接酶联免疫吸附试验(ELISA)操作方法对被测血清进行抗体检测；(2)、重组血吸虫信号蛋白14-3-3单克隆抗体按照双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(Sandwich-ELISA)对被测血清进行血吸虫循环抗原检测。
以上两步检测可单独进行，也可同时进行。
免疫检测方法的标准化关键在于抗原/抗体的标准化(高度的均一性、质量的可控性、生产的程序化)和检测技术的标准化(手工操作程序、标本的采集和保存、试剂的制备、结果判读等)。血吸虫信号蛋白Sj14-3-3是一组分布广泛、高度保守的信号转导分子，在血吸虫生存发育中起重要作用。根据我们已有的研究，血吸虫信号蛋白Sj14-3-3存在血吸虫生活史的各期，在尾蚴、童虫、成虫表达尤为丰富。同时重组血吸虫信号蛋白rSj14-3-3免疫动物可产生高滴度的抗体，显示了较好的免疫原性。我们在重组血吸虫信号蛋白rSj14-3-3基因克隆、表达、免疫定位、抗原纯化、动物感染检测(感染度、感染时间)、疗效考核、单克隆抗体制备及循环抗原检测等各个方面都做了系统的研究。尤其是纯化的重组血吸虫信号蛋白rSj14-3-3检测急、慢性血吸虫病患者血清抗体具有高度的特异性和敏感性，提示重组血吸虫信号蛋白rSj14-3-3具有开发的价值。我们利用纯化的重组血吸虫信号蛋白rSj14-3-3抗原进行间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测急、慢性以及治疗前和治疗后2、4、6、12个月日本血吸虫病患者及不同感染度、不同感染时期和用吡喹酮治疗后2、4、6个月的感染日本血吸虫的兔血清中特异性抗体；以纯化的兔抗重组血吸虫信号蛋白rSj14-3-3多抗为捕捉系统，利用纯化的抗重组血吸虫信号蛋白rSj14-3-3单克隆抗体和酶标第二抗体为检测系统，进行酶联免疫吸附试验检测相应患者血清中的循环抗原。通过与使用普通可溶性虫卵抗原的SEA-ELISA比较，敏感性与SEA-ELISA相当(P＞0.05)，而与正常人、肝吸虫病和钩虫病患者无(或很少)交叉反应；对治疗后不同时期患者及不同感染度、不同感染时期和治疗后不同时期的感染日本血吸虫的兔血清，使用重组血吸虫信号蛋白rSj14-3-3的ELISA优于SEA-ELISA。
分子量为26kDa的血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶(SjGST)是日本血吸虫肠道中分泌的解毒酶。实验证实，基因工程重组的rSjGST可与日本血吸虫感染动物和人类的特异性抗体反应，因而可望用于日本血吸虫病免疫诊断。目前用此重组抗原建立的免疫酶测定法诊断血吸虫病的效果与常用的诊断抗原可溶性虫卵抗原(SEA)相似。现今还没有利用这两种重组抗原或/及相应的单克隆抗体组合检测用于血吸虫病免疫诊断的报告。
根据cDNA文库筛选得到的血吸虫信号蛋白Sj14-3-3编码基因的开放阅读框，设计引物，从我国流行的日本血吸虫基因组中克隆出重组血吸虫信号蛋白rSj14-3-3和重组血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶rSjGST，插入原核表达质粒PET28a，转染大肠杆菌，诱导表达重组血吸虫信号蛋白rSj14-3-3和重组血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶rSjGST，大量表达、亲和层析纯化rSj14-3-3和rSjGST，同时制备抗rSj14-3-3的单克隆抗体(mAb)。用纯化的、适当比例的rSj14-3-3和rSjGST包被聚苯乙烯微量反应板，研制成快速间接酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒，用来检测病人血清中的特异性抗体；以抗重组血吸虫信号蛋白rSj14-3-3的单克隆抗体(mAb)包被反应版，用来检测病人血清中的虫源性循环抗原。以上试剂单独和联合用于检测以下样本(1)不同感染度和不同感染时期的感染日本血吸虫的动物血清；(2)急、慢性日本血吸虫病患者血清；(3)吡喹酮治疗前和治疗后不同时期的日本血吸虫病患者血清；(4)正常人血清；(5)其他寄生虫病血清(以评价交叉反应性)；以上各份血清均同时以常规的环卵沉淀试验(COPT)、可溶性虫卵抗原的酶联免疫吸附试验(SEA-ELISA)、成虫抗原的酶联免疫吸附试验(AWA-ELISA)及间接血凝试验(IHA)平行检测。在此基础上，对所研制试剂的检查方法作进一步优化，以定量的抗原进行标记，对不同稀释度的血清样本进行检测，将各组的敏感性、特异性和交叉反应性平行比较，以探讨检测方法的最适条件、血清最适稀释度，从而实现试剂盒的标准化。再以确定的最适血清样本量对血吸虫病低度流行区的自然人群血清进行筛查并与粪检和目前几种已广泛应用的诊断试剂盒做单盲平行检测的结果进行比较，以评价现场应用价值，最后对试剂盒成品的重复性、检测效率、稳定性和检测费用进行评估，以期作为产品化的试剂盒推广应用。
本发明的有益技术效果是
1、所用的抗原为重组抗原，即重组血吸虫信号蛋白rSj14-3-3和重组血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶rSjGST；所用的抗体为重组血吸虫信号蛋白rSj14-3-3单克隆抗体(14-3-3mAb)，使间接酶联免疫吸附试验(ELISA)技术易标准化，克服了非特异性交叉反应，具有特异性高，敏感性强，方法简便、快速，易标准化和工厂化生产，无需特殊设备，检测成本低廉(适宜血吸虫病流行的农村贫困地区)等优点。
2、本发明的检测方法，同时检测病人(病畜)体内抗血吸虫14-3-3和抗GST两种IgG抗体，在保证特异性的同时，也提高了敏感性；同时也检测病人(病畜)体内的寄生虫源性物质—循环抗原。抗原抗体同时检测，即提高了检出率，又具有现症感染检测、感染度估计和疗效考核的价值。
具体实施例方式
下面通过实施例，对本发明作进一步地描述。
实施例用于血吸虫病检测的组合检测试剂，其特征在于由下列浓度配比的原料组成重组抗原混合物 0.2-0.4ug/孔重组血吸虫信号蛋白14-3-3单克隆抗体(14-3-3mAb) 0.5-1ug/孔，所述重组抗原混合物为A、重组血吸虫信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3) 0.1-0.2ug/孔B、重组血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶(GST)0.1-0.2ug/孔且A和B按照蛋白质浓度1∶1混合配伍；重组血吸虫信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)蛋白质，PI4.86；分子量29KD；含254个氨基酸MRDSFVLQQKDLSPSDLVQIARLAEQAERYDDMAAAMKAYAELPAELGSEERNLFSVAYKNVVGARRSAWRVISAVEHKHDENSKKRQLTKEYRVKMEEELNEICREVLTLLSKYLTPKSNGFESQVFYRKMEGDYYRYLAEVATGDARKEVVEKSQAAYEKATEIAEEMLPSTHPIRLGLALNFSVFYYEIKCDPTQACNLAKRAFDTSIGELDSLQDDSYKDSTLIMQL；所述重组血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶(rSjGST)蛋白质，PI6.35分子量26KD；含218个氨基酸
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPK；所述重组血吸虫信号蛋白14-3-3单克隆抗体(14-3-3mAb)蛋白质，IgG1抗体；分子量约为75kDa。L；；试剂保存1、重组血吸虫信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)、重组血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶(rSjGST)经亲和层析纯化后，用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)碳酸盐包被缓冲液(pH9.6，0.05ml/L)，以1∶800-1∶1000稀释(含重组多肽约1ug-2ug/ml)，每孔0.2ml包被聚苯乙烯微量反应板，4℃过夜，次晨甩干包被液，用pH7.6 PBS-Tween洗涤5次，加10％小牛血清0.1ml/孔，37℃封闭1小时，同上洗涤，塑料袋密封，4℃保存备用。
以上2种重组抗原按照蛋白质浓度配伍为1∶1。用此2种抗原组合检测，即保持了重组抗原用于免疫诊断的高度特异性，又避免了用单一抗原检测时敏感性的降低(可同时检测针对Sj14-3-3和SjGST两种抗原的2种IgG抗体)。
2、重组血吸虫信号蛋白14-3-3单克隆抗体(14-3-3mAb)为小鼠骨髓瘤细胞和免疫脾细胞融合后，经筛选的持续分泌抗rSj14-3-3抗原的单克隆细胞株。融合细胞接种小鼠腹腔后，腹腔液经Sepharose 4B纯化，获得IgG，过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶(HRP)，置磷酸缓冲液(PBS)中保存，使用时按照1∶2000稀释，4℃保存期为3个月。
用基因工程重组的血吸虫rSj14-3-3抗原免疫家兔，取血清分离纯化IgG抗体，碳酸盐包被缓冲液(pH9.6，0.05ml/L)，稀释成适当浓度，每孔0.2ml包被聚苯乙烯微量反应板，4℃过夜，次晨甩干包被液，用pH7.6 PBS-Tween洗涤5次，加10％小牛血清0.1ml/孔，37℃封闭1小时，同上洗涤，塑料袋密封，4℃保存备用。
具体检测方法分为两步第一步重组抗原混合物按照间接酶联免疫吸附试验操作方法对被测血清进行抗体检测；具体操作如下取上述rSj14-3-3和rSjGST包被的聚苯乙烯微量反应板(试剂盒内提供)，每孔加血吸虫病人待检血清20μl，置37℃孵育1小时，pH7.6 PBS-Tween洗涤5次；加1∶1000用PBS稀释的酶标记第二抗体(辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG，试剂盒内提供)0.1ml，37℃孵育1小时，pH7.6 PBS-Tween震荡洗涤5次；每孔加底物OPD溶液0.1ml(试剂盒内提供)，37℃孵育10min显色，最后每孔滴加2mol/L硫酸终止液(试剂盒内提供)0.1ml，检测492nm波长的光密值(OD)。以OD值大于0.05为阳性。
用上述rSj14-3-3和rSjGST包被酶标反应板，检测血吸虫实验感染家兔，阳性率达到98％，治疗后血清抗体有下降趋势；同法检测血吸虫病流行区急性感染的患者血清标本110份，与粪便检查虫卵阳性符合率达到95以上％。
第二步重组血吸虫信号蛋白rSj14-3-3单克隆抗体(mAb)按照双抗体夹心法对被测血清进行循环抗原检测；具体操作如下用于检测血吸虫循环抗原兔抗血吸虫14-3-3多克隆抗体，经适当稀释后包被酶标反应板，4℃过夜，次晨甩去包被液，PBS洗涤5次(试剂盒提供，即取即用)；每孔加待测的患者血清20μl，37℃孵育1小时，PBS洗涤5次；每孔加辣根过氧化物酶标记的抗血吸虫rSj14-3-3单克隆抗体(试剂盒提供，1∶2000稀释)0.1ml，37℃孵育1小时，同上洗涤，每孔加0.1ml底物OPD溶液(试剂盒提供)，37℃孵育10min显色，最后每孔滴加0.1ml的2mol/L的硫酸终止液(试剂盒提供)，检测492nm波长的光密值(OD)。以OD值大于0.05为阳性。
以上双抗体夹心法检测实验动物急性感染和血吸虫病患者，经有效杀虫药物治疗后，血清检测结果大部分转阴(阴转率90％以上)，具有疗效考核价值。
以上两步可单独检测，也可同时检测。
采用本发明方法检测可得到四种检测结果(1)、当重组抗原混合物试剂检测血吸虫病人或感染者血清抗体为阳性、单克隆抗体试剂检测病人或感染者血清血吸虫循环抗原为阳性时，提示为现症感染；(2)、当重组抗原混合物试剂检测血吸虫病人或感染者血清抗体为阳性、单克隆抗体试剂检测病人或感染者血清血吸虫循环抗原为阴性时，提示为既往感染，药物治疗有效；(3)、当重组抗原混合物试剂检测血吸虫病人或感染者血清抗体为阴性、单克隆抗体试剂检测病人或感染者血清血吸虫循环抗原为阳性时，提示为早期感染；(4)、当重组抗原混合物试剂检测可疑病人血清抗体为阴性、单克隆抗体试剂检测为当重组，表示为未受血吸虫感染。
权利要求
1.用于血吸虫病检测的组合检测试剂，其特征在于由下列浓度配比的原料组成重组抗原混合物 0.2-0.4ug/孔重组血吸虫信号蛋白14-3-3单克隆抗体(14-3-3mAb)0.5-1ug/孔，所述重组抗原混合物为A、重组血吸虫信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3) 0.1-0.2ug/孔B、重组血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶(SjGST)0.1-0.2ug/孔且A和B按照蛋白质浓度1∶1混合配伍；所述重组血吸虫信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)蛋白质，PI4.86；分子量29KD；含254个氨基酸MRDSFVLQQKDLSPSDLVQIARLAEQAERYDDMAAAMKAYAELPAELGSEERNLFSVAYKNVVGARRSAWRVISAVEHKHDENSKKRQLTKEYRVKMEEELNEICREVLTLLSKYLTPKSNGFESQVFYRKMEGDYYRYLAEVATGDARKEVVEKSQAAYEKATEIAEEMLPSTHPIRLGLALNFSVFYYEIKCDPTQACNLAKRAFDTSIGELDSLQDDSYKDSTLIMQL；所述重组血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶(GST)蛋白质，PI6.35 分子量26KD；含218个氨基酸MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPK；所述重组血吸虫信号蛋白14-3-3单克隆抗体(14-3-3mAb)蛋白质，IgG1抗体；分子量约为140KDL。
2.根据权利要求1所述的用于血吸虫病检测的组合检测试剂的检测方法，其特征在于具体检测方法分为两种(1)、重组抗原混合物按照间接酶联免疫吸附试验(ELISA)操作方法对被测血清进行抗体检测；(2)、重组血吸虫信号蛋白14-3-3单克隆抗体按照双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(Sandwich-ELISA)对被测血清进行血吸虫循环抗原检测。以上两步检测可单独进行，也可同时进行。
全文摘要
本发明涉及用于血吸虫病检测的组合检测试剂及检测方法。特点是试剂包括重组抗原混合物和重组血吸虫信号蛋白(rSj14－3－3)单克隆抗体，重组抗原混合为重组血吸虫信号蛋白(rSj14－3－3)和重组血吸虫谷胱苷肽－S－转移酶(rSjGST)。检测分别按照间接酶联免疫吸附试验和双抗体夹心法进行操作。本发明采用这两种纯化的优势诊断抗原分子及其相应的单克隆抗体建立的组合检测试剂盒，与传统方法比较，具有特异性高，敏感性强，方法简便、快速，易标准化和工厂化生产，无需特殊设备，检测成本低廉等优点。
文档编号G01N33/569GK1700007SQ20051003929
公开日2005年11月23日 申请日期2005年5月10日 优先权日2005年5月10日
发明者沈继龙, 汪学龙, 葛继华, 沈光金 申请人:安徽医科大学
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
