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专利名称：海产品气味辨别方法
技术领域：
本发明属于有机分析联用技术领域，更具体涉及一种海产品气味辨别方法。
背景技术：
海产品(如鱼、虾、蟹及贝类等)储藏不当，极易腐坏变质。因此，鲜度是评价海产品 品质的关键指标。目前，海产品鲜度评定方法主要有感官法、物理法、微生物学以及化学评 价法等。感官评价主要用眼看、鼻嗅的方法检验，受主观感觉影响大，不易形成标准。物理 方法评价鲜度主要有僵硬指数和激光测定两种，但是其应用一般只限于鱼类，且随储藏温度 不同，僵硬指数变化较大，易产生偏差。而微生物评价无法对非微生物引起的变质进行评价 ，且存在操作繁琐的缺点。
在海产品尤其海鲜产品的变质过程中，气味的变化一般都先于性质的变化，气味特征的 变化可用于预示海产品的变质。因此，通过监测某些挥发性化合物(V0Cs)含量的变化来评 价海产品鲜度的化学方法是应用最为广泛的海产品鲜度评价方法。目前，海产品鲜度评价的 指标性VOCs主要包括三甲胺、丙二醛、挥发性盐基氮、氨基态氮等。但是，由于海产品变质 过程中气味特征的变化，不仅仅是由某种或者某几种VOCs变化引起的，因此，采用单一 VOCs指标来评价海产品鲜度往往具有局限性和不准确性。
而且，采用气味评价海产品鲜度的研究刚起步，许多研究仅仅停留在对某些VOCs组分的 定性和初步定量，缺乏海产品变质过程整体气味特征及潜在气味标志物的系统研究。海产品 变质过程气味整体特征的研究主要有三个难点。第一，气味采样方法还不能全面采集海产品 V0Cs，可能丢失部分生物信息。同时，传统采样方法(如水蒸汽蒸馏等)耗时耗能、操作繁 琐、采样效率低、污染严重，需要进一步发展溶剂用量少、高效节能、采样效率高、对环境 友好的新型采样方法。第二，对气味整体特征的研究必然得到海量的原始实验数据，只有采 用合适的数据解析方法才能有效解析海产品变质过程气味整体特征的变化以及提取隐藏在气 味特征差异后面的生物信息。
发明目的
本发明的目的是提供一种海产品气味辨别方法，解决现有技术中对于海产品气味分析方 法中的不足之处，联用有机分析技术，结合生物学原理，找到预示海产品变质的气味标志物 ，海产品变质过程气味色谱特征及其鲜度的关系，为海产品鲜度判别提供一种可靠有效的方法。
本发明的海产品气味辨别方法采用固相微萃取方法SPME采集海产品储藏过程的气味气体；将采集的气味气体用气质联用技术GC-MS检测，获得海产品的气味特征；联合采用归一化法、主成分分析PCA和共有模式结合的数据解析方法，解析海产品储藏过程气味特征的变化，寻找海产品鲜度变化的气味预警及标志物，以此辨别出海产品的新鲜程度，具体的海产品为蛏、蟹或对虫下。
本发明的显著优点是1)采用HSSPME采集海产品气味成分，具有高效、无损、无溶剂、环境友好、操作简便的优点；2)采用归一化、PCA以及共有模式联用的方式解析海产品储藏过程中气味特征，能最大限度的获得鲜度判别信息，提取到海产品变质预警信息。3)该海产品鲜度判别方法比传统的化学判别法更方便准确。


图1采用HSSPME获得的蛏子新鲜(A)和变质(B)状态下的气味分析色谱图。图2采用HSSPME获得的红斑蟹新鲜(A)和变质(B)状态下的气味分析色谱图。图3采用HSSPME获得的斑节对奸新鲜(A)和变质(B)状态下的气味分析色谱图。图4为蛏子(A)、红斑蟹(B)、斑节对虾(C)储藏过程气味特征的PCA模式识别。(〇.新鲜样品；□.变质样品；參.未知新鲜样品；■.未知变质样品；*.储藏过程中的
样品；标记"1"的标记点为三甲胺出现的采样点)
具体实施方式
海产品为蛏、蟹或对虫下。
采用固相微萃取方法SPME采集海产品储藏过程的气味气体的具体过程为将海产品随机分成50 g—组，分别用自来水和去离子水清洗，自然风干；取2.0 g样品于研钵中，加入2.0mLNaCl溶液(NaCl溶液的浓度一般为O. 04-0. 10 g/mL，可以根据不同的海产品适当改变浓度，如在处理蛏、红斑蟹、斑节对虾样品分别为0.06、 0.08及0. 10 g/mL)，均浆；取2. 0 g均浆样品于15 ml的顶空瓶中平衡5 min，在搅拌情况下，30 。C恒温下顶空固相微萃取(HSSPME)采样40 min; SPME手动取样装置100 mm聚二甲基硅氧烷(Polydimethysiloxane，PDMS) ， 65mm聚二甲基硅氧烷-聚二乙烯基苯(Polydimethysiloxane-divinylbenzene，PDMS-DVB) ， 65 mm聚乙二醇-聚二乙烯基苯(Carbowax-divinylbenzene, CW-DVB) ， 85mm聚丙烯酸酯(Polyacrylate， PA)和75 mm碳分子筛-聚二乙烯基苯(Carboxen-divinylbenzene, CAR-DVB)，电磁搅拌-加热操作台，搅拌子(3.0 mmXIO. 0mm) ， 15 mL顶端带有孔盖子和聚四氟乙烯隔垫的样品瓶；进行固相微萃取方法SPME采集海产品储藏过程的气味气体。
采集的气味气体用气质联用技术GC-MS检测，获得海产品的气味特征的具体过程为采样完毕后，将富集有海产品气味成分的固相微萃取纤维于GC/MS进样口以250 。C解吸后，在不分流模式下进行分析检测；分析仪器是安捷伦6890气相色谱仪GC-5973质谱检测系统MS (Palo Alto， CA)，采用HP-5MS (Agilent Scientific, USA)的毛细管柱(30 mX0.25 mmX0.25mm);高纯氦作为载气，高纯氦恒定流速l. 0 mL/min，进样口温度为25(TC;样品的GC/MS程序升温方式为样品的GC/MS程序升温方式为初始温度4(TC，保持2-3 min，以15。C/min升温至130。C-230°C，保持0-11 min;以10-20。C/min升温至250。C-280°C ，保持O-IOmin;(如对于不同的海产品的GC/MS程序升温方式为蛏样品的GC/MS程序升温方式为初始温度40。C，保持3 min，以15 。C/min升温至230。C，保持ll min;以20 。C/min升温至250°C;蟹样品的GC/MS程序升温方式为初始温度4(TC，保持2 min，以15 TVmin升温至13(TC;以IO 。C/min升温至28(TC，保持IO min;对虾样品的GC/MS程序升温方式为初始温度40°C，保持3 min，以15 。C/min升温至23(TC ，保持ll min;以20 。C/min升温至25(TC);质谱条件电子轰击电离(EI)，接口温度280。C，离子源温度150。C，在20-500 amu的扫描范围内获得全扫描质谱图，然后从图谱解析中获得相关数据，通过与标准谱图库(NIST)的标准质图谱的比较分析从而对海产品气味成分进行定性与定量分析，匹配度达到或超过85 (完全匹配为IOO)，可定性。对于一些特殊的海产品气味物质还需要进一步采用标准物质确认，方法为将其保留时间与标准物的保留时间进行对比，保留时间差值小于0.05 min，可定性
联合采用归一化法、主成分分析PCA和共有模式结合的数据解析方法，解析海产品储藏过程气味特征的变化，寻找海产品鲜度变化的气味预警及标志物，以此辨别出海产品的新鲜程度具体为根据得到的储藏过程海产品的气味色谱图，对各气味组分的峰面积进行归一化处理，获取各气味组分的归一化相对百分含量。海产品储藏过程中，随着鲜度的变化，各个气味组分量和质的变化表现为气味整体特征的变化，须采用化学计量学方法从统计层面上解析海产品储藏过程气味特征的差异。然后，采用PCA解析海产品储藏过程中气味色谱数据，发现不同新鲜度海产品气味色谱数据有不同的聚类规律，结果表明海产品储藏过程不同阶段有明显不同的气味特征。PCA聚类规律可以反映海产品储藏过程气味特征的整体差异。最后，采用共有模式统计和对比变质前后海产品气味特征，获取气味组分对于海产品气味特征的贡献，得到对海产品变质前后气味特征差异有贡各气味组分，这些特征气味成分即为海产品储藏过程鲜度判别的预警物质，具体操作如下应用归一化、PCA和共有模式分析三种数据
7处理方式，获取海产品气味特征中的潜在信息，将样品以及空白的GC/MS原始数据，即保留时间以及信号强度经ChemSW软件转换为"mX2"矩阵，其中m代表采样频率，数据的第一列为具体采样的保留时间值，第二列为质谱检测器的信号响应强度。经过点对点的空白扣除，系统能得到不含空白值的海产品气味净谱图，经过小波平滑和多项式平滑处理以及保留时间和质谱响应校正，所有获得的海产品气味净谱图组成一个"mXn"的矩阵Y，其中n代表净谱图数，对矩阵Y进行奇异值分解(Single Value Decomposition, SVD) ， g口 ^=US\这里，U为标准列正交矩阵，VT为标准行正交矩阵，即得分矩阵和载荷矩阵，分别收集了特征值矩阵S中特征值所对应的列特征矢量和行特征矢量，在统计分析中，对得分矩阵的主成分进行投影分析，就可以得到代表原始矩阵Y在空间分布上差异的投影图，最终达到聚类分析目的，在此基础上对聚类数据进行分析，即共有模式分析，通过抽提这些子集数据中的共同特征并对不同的共有模式进行对比分析，即能找到各类数据的共同点与差异性。
以下是本发明的具体实施例，充分说明本发明，但是本发明不仅限于此。1 实验部分(实施例中删除了关于牡蛎的部分请确认数据正确性)1.1仪器与试剂
SPME手动取样装置(Supelco公司);Agilent 6890N/5973I GC/MS;各挥发性有机物的标准样品等。
1.2采样与数据处理
准确称取一定量的海产品，磨碎后加入一定浓度的NaCl溶液，磁力搅拌，3(TC恒温下顶空萃取后采用GC-MS检测。
采用在Matlab 6. 5平台上编辑的"色谱数据处理系统"对色谱数据进行统计处理。"色谱数据处理系统"功能实现如下
将样品以及空白的GC/MS原始数据，即保留时间以及信号强度经ChemSW软件转换为"mX2"矩阵，其中m代表采样频率，数据的第一列为具体采样的保留时间值，第二列为质谱检测器的信号响应强度。经过点对点的空白扣除，系统能得到不含空白值的海产品气味净谱图，经过小波平滑和多项式平滑处理以及保留时间和质谱响应校正，所有获得的海产品气味净谱图组成一个"mXn"的矩阵Y，其中n代表净谱图数，对矩阵Y进行奇异值分解(Single
Value Decomposition, SVD) ， g卩^=US\这里，U为标准列正交矩阵，vT为标准行正交矩阵，即得分矩阵和载荷矩阵，分别收集了特征值矩阵S中特征值所对应的列特征矢量和行特征矢量，在统计分析中，对得分矩阵的主成分进行投影分析，就可以得到代表原始矩阵Y在空间分布上差异的投影图，最终达到聚类分析目的，在此基础上对聚类数据进行分析，即共有模式分析，通过抽提这些子集数据中的共同特征并对不同的共有模式进行对比分析，即能找到各类数据的共同点与差异性。
2 结果讨论
2. 1海产品储藏过程的气味组成
海产品气味组分通过SPME富集后，在GC系统进行分离，采用GC/MS标准谱图库鉴定气味组分(匹配度》85); —些VOCs还通过与标准物质对比保留时间(峰位移小于0.05 min)进一步定性。图l给出了HSSPME采集的新鲜和变质蛏子的气味色谱图。HSSPME采集的新鲜蛏子、红斑蟹和斑节对奸气味组分分别为19、 13、和22种；变质蛏子、红斑蟹和斑节对奸的气味组分分别为21、 14和21种。
海产品储藏过程的气味特征及其与鲜度的关系
从归一化结果初步看出海产品储藏过程气味组分种类和含量发生很大变化，为了从统计层面上解析不同鲜度海产品气味特征，采用具体实施方式
中所述的方法，应用PCA和共有模式解析海产品储藏过程不同鲜度状态下的气味特征。结果表明蛏子、红斑蟹及斑节对虾，图4为部分海产品的PCA分析结果。
PCA分析结果表明海产品储藏过程不同鲜度状态VOCs特征存在普遍差异，从新鲜到变质状态，斑节对虾的气味特征呈现过渡变化特点。而且，气味特征的变化先于传统海产品变质气味标志物三甲胺的出现，说明采用海产品储藏过程气味特征的变化可以提供更加准确的海产品鲜度变化预警信息。
为了获取海产品VOCs组分对于海产品储藏过程气味特征的贡献，采用共有模式统计对比了新鲜和变质海产品气味特征聚类数据，提取对蛏子、红斑蟹及斑节对虾变质前后VOCs特征差异贡献前5位V0Cs及其贡献率，可为海产品储藏过程鲜度变化提供潜在的气味标志物。
权利要求
1.一种海产品气味辨别方法，其特征在于采用固相微萃取方法SPME采集海产品储藏过程的气味气体；将采集的气味气体用气质联用技术GC-MS检测，获得海产品的气味特征；联合采用归一化法、主成分分析PCA和共有模式结合的数据解析方法，解析海产品储藏过程气味特征的变化，寻找海产品鲜度变化的气味预警及标志物，以此辨别出海产品的新鲜程度。
2 根据权利要求l所述的海产品气味辨别方法，其特征在于所述的 海产品为蛏、蟹或对虫下。
3 根据权利要求2所述的海产品气味辨别方法，其特征在于所述采 用固相微萃取方法SPME采集海产品储藏过程的气味气体的具体过程为将所述海产品随机分 成50 g—组，分别用自来水和去离子水清洗，自然风干；取2.0 g样品于研钵中，加入2.0 mLNaCl溶液，均浆；取2. 0 g均浆样品于15 ml的顶空瓶中平衡5 min，在搅拌情况下，30 °C 恒温下顶空固相微萃取(HSSPME)采样40 min;采用SPME手动取样装置100 mm聚二甲基硅 氧烷(Polydimethysiloxane， PDMS) ， 65mm聚二甲基硅氧烷-聚二乙烯基苯( Polydimethysiloxane-divinylbenzene，PDMS-DVB) ， 65 mm聚乙二醇-聚二乙烯基苯( Carbowax—divinylbenzene， CW—DVB) ， 85 mm聚丙稀酸酉g (Polyacrylate， PA)禾口75 mm石炭 分子筛-聚二乙烯基苯(Carboxen-divinylbenzene， CAR-DVB)，电磁搅拌-加热操作台，搅 拌子(3.0 mmX10.0 mm) ， 15 mL顶端带有孔盖子和聚四氟乙烯隔垫的样品瓶；进行固相微 萃取方法SPME采集海产品储藏过程的气味气体。
4 根据权利要求3所述的海产品气味辨别方法，其特征在于所述 NaCl溶液的浓度为O. 06-0. 10 g/mL。
5 根据权利要求4所述的海产品气味辨别方法，其特征在于所述 NaCl溶液的浓度在处理对虾样品为O. 10 g/mL; NaCl溶液的浓度在处理蛏为O. 06 g/mL;在处 理蟹样品为0.08 g/mL。
6 根据权利要求2所述的海产品气味辨别方法，其特征在于所述采集的气味气体用气质联用技术GC-MS检测，获得海产品的气味特征的具体过程为采样完毕 后，将富集有海产品气味成分的固相微萃取纤维于GC/MS进样口以250 'C解吸后，在不分流 模式下进行分析检测；分析仪器是安捷伦6890气相色谱仪GC-5973质谱检测系统MS (Palo Alto， CA)，采用HP-5MS (Agilent Scientific, USA)的毛细管柱(30 mX0.25 mmXO.25 mm);高纯氦作为载气，高纯氦恒定流速l.O mL/min，进样口温度为25(TC;样品的GC/MS程 序升温方式为初始温度40。C，保持2-3 min，以15 。C/min升温至130。C-23CTC，保持O-ll min;以10-2(TC/min升温至25(TC-28(rC，保持O-IO min;质谱条件电子轰击电离(EI) ，接口温度28(TC，离子源温度15(TC，在20-500 amu的扫描范围内获得全扫描质谱图，然后 从图谱解析中获得相关数据，通过与标准谱图库(NIST)的标准质图谱的比较分析从而对海 产品气味成分进行定性与定量分析，匹配度达到或超过85，完全匹配为IOO，定性。
7.根据权利要求6所述的海产品气味辨别方法，其特征在于对于一 些特殊的海产品气味物质还需要进一步采用标准物质确认，方法为将其保留时间与标准物的 保留时间进行对比，保留时间差值小于0.05 min，定性。
8.根据权利要求6所述的海产品气味辨别方法，其特征在于所述对 于不同的海产品的GC/MS程序升温方式为蛏样品的GC/MS程序升温方式为初始温度4(TC，保持3min，以15 。C/min升温至23(TC ，保持ll min;以20 。C/min升温至250。C;蟹样品的GC/MS程序升温方式为初始温度40。C，保持2min，以15 。C/min升温至130。C ;以IO 。C/min升温至280。C，保持IO min;对虾样品的GC/MS程序升温方式为初始温度40。C，保持3min，以15 。C/min升温至230 。C，保持ll min;以20 。C/min升温至250。C 。
9.根据权利要求l所述的海产品气味辨别方法，其特征在于所述联 合采用归一化法、主成分分析PCA和共有模式结合的数据解析方法，解析海产品储藏过程气 味特征的变化，寻找海产品鲜度变化的气味预警及标志物，以此辨别出海产品的新鲜程度具 体为根据得到的储藏过程海产品的气味色谱图，对各气味组分的峰面积进行归一化处理， 获取各气味组分的归一化相对百分含量；海产品储藏过程中，随着鲜度的变化，各个气味组 分量和质的变化表现为气味整体特征的变化，须采用化学计量学方法从统计层面上解析海产 品储藏过程气味特征的差异；然后，采用PCA解析海产品储藏过程中气味色谱数据，发现不 同新鲜度海产品气味色谱数据有不同的聚类规律，结果表明海产品储藏过程不同阶段有明显不同的气味特征；PCA聚类规律可以反映海产品储藏过程气味特征的整体差异；最后，采用 共有模式统计和对比变质前后海产品气味特征，获取气味组分对于海产品气味特征的贡献， 得到对海产品变质前后气味特征差异有贡各气味组分，这些特征气味成分即为海产品储藏过 程鲜度判别的预警物质，具体操作如下应用归一化、PCA和共有模式分析三种数据处理方 式，获取海产品气味特征中的潜在信息，将样品以及空白的GC/MS原始数据，即保留时间以 及信号强度经ChemSW软件转换为"mX2"矩阵，其中m代表采样频率，数据的第一列为具体 采样的保留时间值，第二列为质谱检测器的信号响应强度；经过点对点的空白扣除，系统能 得到不含空白值的海产品气味净谱图，经过小波平滑和多项式平滑处理以及保留时间和质谱 响应校正，所有获得的海产品气味净谱图组成一个"mXn"的矩阵Y，其中n代表净谱图数，Y=US/t对矩阵Y进行奇异值分解(Single Value Decomposition, SVD) ， g卩 这里，U为标准列正交矩阵，VT为标准行正交矩阵，即得分矩阵和载荷矩阵，分别收集了特征值矩阵 S中特征值所对应的列特征矢量和行特征矢量，在统计分析中，对得分矩阵的主成分进行投 影分析，就可以得到代表原始矩阵Y在空间分布上差异的投影图，最终达到聚类分析目的， 在此基础上对聚类数据进行分析，即共有模式分析，通过抽提这些子集数据中的共同特征并 对不同的共有模式进行对比分析，即能找到各类数据的共同点与差异性。
全文摘要
本发明提供一种海产品气味辨别方法，解决现有技术中对于海产品气味分析方法中的不足之处，本发明的海产品气味辨别方法采用固相微萃取方法SPME采集海产品储藏过程的气味气体；将采集的气味气体用气质联用技术GC-MS检测，获得海产品的气味特征；联合采用归一化法、主成分分析PCA和共有模式结合的数据解析方法，解析海产品储藏过程气味特征的变化，寻找海产品鲜度变化的气味预警及标志物，以此辨别出海产品的新鲜程度。本发明联用有机分析技术，结合生物学原理，找到预示海产品变质的气味标志物，海产品变质过程气味色谱特征及其鲜度的关系，为海产品鲜度判别提供了一种可靠有效的方法。
文档编号G01N30/00GK101666787SQ200910308398
公开日2010年3月10日 申请日期2009年10月16日 优先权日2009年10月16日
发明者张卓旻, 曾丹丹, 李天麟, 林 罗, 陈国南 申请人:福州大学;罗 林;曾丹丹