专利名称：甲型h1n1流感病毒总抗体快速检测试纸的制作方法
技术领域：
本发明是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种以胶体金免疫层析法快速检测 甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸。
背景技术：
甲型H1N1流感病毒是一种新型的流感病毒，2009年在世界范围内大流行，严重 危害人类的健康。其"Ha"指的是血球凝集素(Hemagglutinin) 、"Na"指的是神经氨酸酶 (Neuraminidase),甲型流感病毒H有1 15型，有1 9型。H1N1是甲型流感病毒的一 种，也是�：ψ畲蟮牟《局�。在历史上曾造成数次大流行。 目前对甲型H1N1流感检测的主要方法是PCR基因扩增诊断方法，鼻咽试纸抗原诊 断方法等。在抗体检测方面，有ELISA等检测方法，但用胶体金类免疫层析技术对甲型H1N1 总抗体进行检测尚未有相关报道。对H1N1总抗体检测主要有已下作用1 :对H1N1流感进 行辅助诊断。根据"甲型H1N1流感诊疗方案"第三版，甲型H1N1流感病原学检测方法之一 为动态检测双份血清甲型H1N1流感病毒特异性抗体水平呈4倍或4倍以上升高，是感染 H1N1流感病毒的指标。2 :对是否已感染H1N1进行鉴别，隐性感染或感染过该病毒的人体 内抗H1N1病毒总抗体将长期存在。3 :对免疫接种的效果进行评价，从数据上看，目前H1N1 接种的有效率约为90%，尚有10%的人需要筛选出来重新接种或用其它方式进行该病的 预防。考虑到感染和接种的人群巨大，运用一种快速、简便、有效的抗体检测方法非常必要。
免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术，在抗体检测方面已得到较为广泛运用， 基本原理如下利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试剂的NC膜上包被相应的配对抗原或 抗体，检测时当样品中含相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗�：脱分信涮逑嘟� 合形成复合物，然后在NC膜上层析，再被包被抗原或抗体捕获，形成肉眼可见的检测T线， 通过检测线的有无实现对结果的判定。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合 现场检测和经济实用等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，采用双抗原 夹心法制备，具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优 点。 本发明提供一种甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于塑料支撑 板7 —端连接上样垫1 ，上样垫1的一端紧密压接含有标记H1N1特异性的血球凝集素Ha或 H1N1特异性的血球凝集素Ha和神经氨酸酶Na抗原的胶体金垫2，胶体金垫2 —端紧密压 接硝酸纤维素NC膜3，硝酸纤维素NC膜3包被有相互分离的检测T线5和质控C线6， T线 为包被在NC膜上的的H1N1特异性的血球凝集素Ha或H1N1特异性的血球凝集素Ha和神 经氨酸酶Na抗原，C线为包被在NC膜上的抗H1N1抗体，硝酸纤维素NC膜3的另一端连接 吸样垫4形成试纸。
3
所述的甲型HlNl流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于所述的抗原为HlNl 特异性的血球凝集素(Ha)和神经氨酸酶(Na)抗原，抗原可以从H1N1病毒中纯化提取或利 用基因工程重组表达。 所述的甲型HlNl流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于所述的上样垫1为玻 璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成4。 所述的甲型HlNl流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于，所述的抗原的包被 方法为以0. 01M pH 7. 2磷酸盐缓冲液(PBS)将HlNl特异性的血球凝集素(Ha)和(或) 神经氨酸酶(Na)抗原配制成O. 5-2mg/ml的溶液，用喷膜仪在NC膜下部以lul/cm的参数进 行划线，包被T线，同时在NC膜上部包被抗HlNl抗体作为C线，划线后将NC膜在干燥间， 温度20-25。C，湿度小于30%，干燥2-5小时。 上述的甲型HlNl流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于，所述的抗原标记胶 体金颗粒的方法为以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-50nm的胶体金溶液，制备 完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0. 2MI^C03调至pH8.0，按100ml胶体金溶液加入 0. 5-2mgHlNl血球凝集素(Ha)和神经氨酸酶(Na)抗原，室温搅拌2小时，加入1%牛血清 白蛋白BSA， 0. 1 %聚乙二醇PEG20000封闭20min， 12000r/m离心30分钟，弃上清，用胶体金 工作液复溶至100ml，按lml溶液铺22cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置 干燥间，温度20-25t:，湿度小于30%，干燥2-5小时，制成胶体金垫。
上述的甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于所述的试纸的装配 方法为在干燥室内，温度20-25°C ，湿度小于30% ，取塑料支撑板板，将已包被的NC膜放置 在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴，在胶 体金垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金垫的1/5 ;在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫 的1/10 ;最后用裁剪机将贴好塑料板切成2-5mm宽的试纸条，切好的试纸条可以再装入塑 料卡内，形成检测卡。 所述的甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于，检测方法为将被 检血清或血浆平衡至温室，将试纸条或试剂卡平放，在上样垫上加入50-100ul被检样品， 样品溶解胶体金并在NC膜上层析，然后用肉眼直接观察在20分钟内C、T线的出现情况，并 判定检测结果。 本发明的有益效果是提供一种利用免疫层析胶体金技术检测甲型H1N1流感病 毒总抗体快速检测试纸。采用双抗原夹心法实现对总抗体的检测。采用胶体金标记甲型 H1N1流感病毒抗原，包被甲型H1N1流感病青抗原实现对血液中抗甲型H1N1流感病毒总抗 体的检测。可同时检测IgG和IgM。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现 场检测和经济实用等优点。
图1甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸结构示意图。
附图符号说明 1 :上样垫；2 :胶体金垫；3 :NC膜；4 :吸样垫
5 :检测(T)线;6 :质控(C)线;7 :塑料支撑板
具体实施例方式实施例制备甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸
l主要材料 1. l特异性甲型HlNl流感病毒Ha抗原Sino Biological Inc.公司产品，为重组
抗原，用于胶体金标记和NC膜T线包被；抗Ha抗体，用Ha免疫山羊自制，用于NC膜包被；
氯金酸Sigma公司产品；硝酸纤维素(NC)膜:Millipore公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，
聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。 1. 2临床血清由公司在相关医院获得，其中在近期接种H1N1疫苗样本80份，未
接种疫苗样本120份。 1. 3甲型H1N1流感病毒IgG ELISA试剂盒，Sino Biological Inc.产品。
2方法 2. 1甲型H1N1流感病毒Ha重组抗原的胶体金标记氯金酸_柠檬酸三钠还原法 制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0. 2M K2C03将溶液调 到pH7. 0、 pH8. 0和pH9. 0。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液加入 0. 5mg、lmg、1. 5mg将重组抗原将蛋白缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再滴加入 到终浓度为0. 1 %的PEG2000和1 %的BSA进行封闭20min，标记结束后以12000r/m离心， 弃上清，沉淀按原体积复溶至不同配比的胶体金工作液硼酸盐缓冲液，pH8. O，含BSA、羊血 清，蔗糖和表面活性剂中。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺22cm2的比例加样于无纺 布上，在温度20-251:，相对湿度在< 30%的干燥间干燥2-4小时，制成胶体金垫。
2. 2H1N1流感病毒Ha重组抗原的包被用0. 01M pH7. 2PBS将H1N1流感病毒Ha重 组抗原分别稀释成0. 5mg/ml、 lmg/ml、2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜下部按lul/cm进行划 线包被，同时在NC膜上部包被抗Ha抗体，用于产品的质控，包被完成后将NC膜在在温度 20-25"，相对湿度在< 30%的干燥间干燥2-5小时。 2. 3甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸的组装在干燥室内(温度20_25°C， 相对湿度< 30% )取塑料支撑板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜 T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫(搭 胶体金垫的1/5);在NC膜C线一侧搭接吸样垫(搭吸样垫的1/10);然后用裁剪机将贴好 塑料板切成3mm或4mm宽的试纸条。切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成甲型H1N1流 感病毒总抗体检测试剂卡。 2. 4检测方法将被检血清或血浆平衡至温室，将制备好的试纸条或试剂卡平放，在 上样垫上加入50-100ul被检样品，若样品中含抗甲型HlNl流感病毒总抗体，则和样品垫上 的标记甲型H1N1流感病毒抗原的胶体金结合，形成复合物，并扩散到NC膜上进一步层析， 当遇到包被在NC膜上T线处的H1N1流感病毒Ha重组抗原时，复合物则又和包被抗抗原结 合，被捕获在包被处，当被捕获的胶体金复合物达到一定数量时，则形成一条肉眼可见的T 线；若血清中不含特异性抗体，则不能形成免疫复合物，亦不能形成T线，C线作为试剂的质 控标准，阳性和阴性样品检测时均会出现。用肉眼直接观察在5、10、15、20、30和45分钟内 C、 T线的出现情况，并判定检测结果。 2. 5试纸工艺参数调试将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备小样，利 用质控血清对试剂进行测试，发现最佳组合。
2. 6临床血清检测用本试剂按检测方法对所有临床血清进行检测，同时用Sino Biological Inc.甲型H1N1 ELISA抗体检测试剂进行对照检测。 3结果3. l试纸参数确定根据小样的检测结果，确定了试纸的最佳标记pH值为 8. 0 ;重组混合抗原的最佳标记量为lmg/100ml胶体金溶液；最佳的胶体金工作液为10mM 硼酸酸盐缓冲液，pH8. O，含0. 5% BSA、10X羊血清，2X蔗糖，0. 2% Tween 20 ;最佳H1N1流 感病毒Ha重组抗原包被浓度为lmg/ml。检测结果的最佳判定时间为5_20分钟。但以上参 数在制备不同批次产品时可能需要适当调整。 3. 2临床血清检测以ELISA试剂为对照，80份近期接种甲型H1N1流感病毒疫苗 人员的样本中，检测出阳性70份，ELISA检测出阳性血清72份，灵敏度二 70/72 = 97.2%; 本试剂对120份未接种H1N1疫苗人员样本中检出阴性为110份，ELISA试剂的检测阴性为 112分，相对特异性为110/112 = 98. 2%。 P > 0. 05。试剂性能和ELISA试剂相比无显著 性差异，适合临床检测需要。
权利要求
一种甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于塑料支撑板(7)一端连接上样垫(1)，上样垫(1)的一端紧密压接含有标记H1N1特异性的血球凝集素Ha或H1N1特异性的血球凝集素Ha和神经氨酸酶Na抗原的胶体金垫(2)，胶体金垫(2)一端紧密压接硝酸纤维素(NC)膜(3)，硝酸纤维素(NC)膜(3)包被有相互分离的检测(T)线(5)和质控(C)线(6)，T线为包被在NC膜上的的H1N1特异性的血球凝集素Ha或H1N1特异性的血球凝集素Ha和神经氨酸酶Na抗原，C线为包被在NC膜上的抗H1N1抗体，硝酸纤维素(NC)膜(3)的另一端连接吸样垫(4)形成试纸。
2. 根据权利要求1所述的甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于所述的 抗原为H1N1特异性的血球凝集素(Ha)和神经氨酸酶(Na)抗原，抗原可以从H1N1病毒中 纯化提取或利用基因工程重组表达。
3. 根据权利要求1所述的甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于所述的 上样垫(1)为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成(4)。
4. 根据权利要求1和2所述的甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于， 所述的抗原的包被方法为以0. 01M pH 7. 2磷酸盐缓冲液(PBS)将H1N1特异性的血球凝 集素(Ha)和(或)神经氨酸酶(Na)抗原配制成0. 5_2mg/ml的溶液，用喷膜仪在NC膜下 部以lul/cm的参数进行划线，包被T线，同时在NC膜上部包被抗H1N1抗体作为C线，划线 后将NC膜在干燥间，温度20-25t:，湿度小于30%，干燥2-5小时。
5. 根据权利要求1和2所述的甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于， 所述的抗原标记胶体金颗粒的方法为以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-50nm 的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0. 2M K2C03调至pH8. 0，按 100ml胶体金溶液加入0. 5-2mg H1N1血球凝集素(Ha)和神经氨酸酶(Na)抗原，室温搅拌 2小时，加入1%牛血清白蛋白BSA，O. 1X聚乙二醇PEG20000封闭20min， 12000r/m离心30 分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至100ml，按lml溶液铺22cm的比例均匀地铺在玻璃纤 维膜或无纺布上，再置干燥间，温度20-25°C ，湿度小于30% ，干燥2-5小时，制成胶体金垫。
6. 根据权利要求1和3所述的甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于所 述的试纸的装配方法为在干燥室内，温度20-251:，湿度小于30%，取塑料支撑板板，将已 包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫 的1/3)粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金垫的1/5 ;在NC膜C线一侧搭 接吸样垫，搭吸样垫的1/10 ;最后用裁剪机将贴好塑料板切成2-5mm宽的试纸条，切好的试 纸条可以再装入塑料卡内，形成检测卡。
全文摘要
本发明是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，采用双抗原夹心法实现对总抗体的检测。采用胶体金标记甲型H1N1流感病毒抗原，包被甲型H1N1流感病毒抗原实现对血液中抗甲型H1N1流感病毒总抗体的检测。可同时检测IgG和IgM。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
文档编号G01N33/569GK101788562SQ20101013318
公开日2010年7月28日 申请日期2010年3月26日 优先权日2010年3月26日
发明者李洲, 杨发青 申请人:天津中新科炬生物制药有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
