专利名称：脱氧核糖核酸电化学纳米传感器的制备方法
技术领域：
本发明属于脱氧核糖核酸电化学纳米传感器的制备方法。
背景技术：
人类基因组脱氧核糖核酸(DNA)测序工作已经初步完成，这不但会促使人们进一步了解困扰人类的致命疾病，还有助于诊断学和治疗学的发展。对特定病原或遗传疾病DNA序列的检测，以往的方法大多是建立在标记有放射性，荧光和化学发光物质的探针与靶序列杂交的基础上。如用32P或35S标记的检测体系是人们较早普遍使用的检测方法且有较高的灵敏度，但这种方法却需要特殊培训的技术人员，还会面临放射性标记活性探针的处理问题和其较短的贮藏寿命问题。因此，放射性标记探针被越来越多的非放射性基团替代并通过比色、荧光或化学发光的方法进行检测。这些方法各有其优缺点，目前还没有一个普遍接受最好的方法。因此，建立高效、快速、成本低的DNA序列测定新方法显得尤为重要。
DNA的杂交检测对于诊断和治疗与基因相关的疾病有着重要的意义，因此DNA传感器的研发是非常活跃的研究领域。其中，纳米材料的应用可以使DNA杂交检测的灵敏度大大提高。在纳米材料中，纳米金凭着比表面积大、表面活性和生物相容性都大大高于体材料，成为研制DNA传感器的首选材料。
近年来，有关纳米材料的合成和应用方面的研究工作进展迅速，特别是金纳米晶，在分子生物学领域的研究和应用已成为目前科学家研究的热点。鉴于金纳米粒子与巯基之间有强的共价键合，这使得金纳米晶与巯基标记的生物活性分子结合后形成的探针可用于生物体系的检测中。这种复合探针较早被人们用在免疫学检测中，人们对金纳米晶在功能化固体表面的化学组装行为也做了大量的研究，但对DNA片段作为程序化组装元件并未受到材料化学家足够的注意甚至还有一些争议。1996年以来，美国西北大学纳米技术研究所纳米装配和分子自组装中心Chad A.Mirkin教授领导的研究小组在金纳米晶与DNA片段之间的相互作用方面做了大量深入细致的工作。利用金纳米晶在DNA片段作为组装分子的引导下可形成超分子结构的特点，建立了用巯基化寡核苷酸探针标记金纳米晶并检测特定多核苷酸序列的新方法，但此种方法的灵敏度不是令人满意。Cai等(Cai，H.；Wang，Y.Q.；He，P.G.；Fang，Y.Z.Anal.Chim.Acta，2002，469，165)将已知序列的单链寡聚核苷酸(ss-DNA)固载在玻碳电极表面，用纳米金标记的互补DNA与之杂交。然后在纳米金表面在位沉积银，在酸性条件下将银溶出，通过电化学方法检测银，从而达到间接检测DNA的目的。不过没能获得很好的灵敏度。
发明内容
本发明的目的是提出一种脱氧核糖核酸电化学纳米传感器的制备方法。
在金电极表面化学修饰巯基化合物，如巯基苯胺、巯基乙胺等。利用巯基化合物的巯基端可以和金电极以化学键的方式结合，将巯基端固定在金电极上而使另一端的氨基裸露在电极表面。在一定条件下裸露的氨基可以和金纳米晶以化学键结合，从而将金纳米晶固定在金电极表面。利用金纳米晶可以与带有巯基功能团的DNA相互作用的特性将已知序列的目标ssDNA固定在金电极表面。然后与银纳米晶标记的互补DNA发生杂交，通过杂交反应将银纳米晶标记的互补DNA也固定在金电极表面。在酸性介质中将标记互补DNA的银纳米晶氧化释放，使其以离子状态存在于溶液中。通过电化学方法检测银离子的量从而达到间接检测目标DNA的量，制成了DNA电化学纳米传感器。
制备步骤如下一金纳米晶在金电极表面的固定1).处理好清洁的金电极浸入含有巯基化合物的溶液中，在室温下浸泡1～10个小时，取出后清洗，将物理吸附在电极表面的巯基化合物清洗干净，最后用大量高纯水清洗干净并用高纯氮气吹干；2).将电极放入pH值为3～7的金纳米晶溶液中，在暗处组装1～20个小时，取出后用高纯水清洗干净；二目标DNA在金纳米晶修饰电极上的固定将修饰了金纳米晶的电极放入含有目标DNA缓冲溶液中，pH范围为5～9，在10℃～50℃下，相互作用时间0.5～5小时。
三杂交将修饰了目标DNA的金电极放入含有银纳米晶标记的互补DNA溶液中，温度选择为10℃～40℃，并不时地摇动，0.5～2小时后取出，用大量pH为7.0的磷酸缓冲溶液冲洗，确保银标记的DNA与目标DNA充分杂交后组装在电极表面；四检测将电极放入200μL 50％HNO3，停留5分钟，以保证银可以完全溶解，最后放入400μL 1×10-4～5×10-1M KBr和200μL 0.1MKNO3，在酸性条件下，经过氧化处理使标记在互补DNA上的银纳米晶以银离子的状态溶出，这样就可以通过电化学的方法检测银的量从而检测目标DNA的量。
本发明中在进行电化学检测时引入溴离子，起到了提高检测灵敏度的效应，使检测限提高到10pmol·L-1。
本发明制备的DNA电化学纳米传感器制备方法简单，利用金纳米晶固定DNA，可以使DNA固定得更牢固且固定数量增大。同时采用银纳米晶标记，利用电化学的方法检测，可以获得很高的灵敏度且具很好的选择性。
附图1是本发明技术方案示意图。图中采用巯基乙胺将金纳米晶固定在金电极表面。金纳米晶与带有巯基功能团的DNA相互作用而将已知序列的目标ssDNA固定在金电极表面。然后与银纳米晶标记的互补DNA发生杂交，通过杂交反应将银纳米晶标记的互补DNA也固定在金电极表面。在酸性介质中将标记互补DNA的银纳米晶氧化释放，使其以离子状态存在于溶液中。通过电化学方法检测银离子的量从而达到间接检测目标DNA的量。
附图2是用本发明的传感器检测不同浓度的DNA，采用阳极溶出伏安法检测银离子从而间接检测目标DNA的量。用此方法测定包含30个碱基的ssDNA的浓度在100～1000pmol L-1范围内有非�：玫南咝怨叵担觳庀尬�10pmol L-1。
具体实施例方式
实施例1一金纳米晶在金电极表面的固定1).处理好清洁的金电极浸入含有巯基乙胺的溶液中，在室温下浸泡1个小时，取出后清洗，将物理吸附在电极表面的巯基化合物清洗干净。最后用大量高纯水清洗干净并用高纯氮气吹干。
2).将电极放入pH值为3的金纳米晶溶液中，在暗处组装1个小时，取出后用高纯水清洗干净。
二目标DNA在金纳米晶修饰电极上的固定将修饰了金纳米晶的电极放入含有目标DNA的缓冲溶液中，pH为5。在10℃下，相互作用1小时。
三杂交将修饰了目标DNA的金电极放入含有银纳米晶标记的互补DNA溶液中，保持在一种适宜的环境条件下，温度选择为10℃，并不时地摇动，30分钟后取出，用大量pH为7.0的磷酸缓冲溶液冲洗，确保银标记的DNA与目标DNA充分杂交后组装在电极表面。
四检测将电极放入200μL 50％HNO3，停留5分钟，以保证银可以完全溶解。最后放入400μL 1×10-4KBr和200μL 0.1M KNO3。在酸性条件下，经过氧化处理可以使标记在互补DNA上的银纳米晶以银离子的状态溶出，通过阳极溶出伏安法检测银离子从而间接检测目标DNA的量。用此方法测定含有30个碱基的ssDNA的浓度范围在100～150pmol L-1。
实施例2一金纳米晶在金电极表面的固定1).将处理好清洁的金电极浸入含有巯基苯胺溶液中，在室温下浸泡10个小时，取出后清洗，将物理吸附在电极表面的巯基化合物清洗干净。最后用大量高纯水清洗干净并用高纯氮气吹干。
2).将电极放入pH值为7的金纳米晶溶液中，在暗处组装2个小时，取出后用高纯水清洗干净。
二目标DNA在金纳米晶修饰电极上的固定将修饰了金纳米晶的电极放入含有目标DNA的缓冲溶液中，pH为6。在20℃下，相互作用30分钟。
三杂交将修饰了目标DNA的金电极放入含有银纳米晶标记的互补DNA溶液中，保持在一种适宜的环境条件下，温度选择为20℃，并不时地摇动，1小时后取出，用大量pH为7.0的磷酸缓冲溶液冲洗，确保银标记的DNA与目标DNA充分杂交后组装在电极表面。
四检测将电极放入200μL 50％HNO3，停留5分钟，以保证银可以完全溶解。最后放入400μL 10-2M KBr和200μL 0.1M KNO3。在酸性条件下，经过氧化处理可以使标记在互补DNA上的银纳米晶以银离子的状态溶出，通过阳极溶出伏安法检测银离子从而间接检测目标DNA的量。用此方法测定含有30个碱基的ssDNA的浓度范围在100～120pmol L-1。
实施例3一金纳米晶在金电极表面的固定1).将处理好清洁的金电极浸入含有巯基乙胺的溶液中，在室温下浸泡4个小时，取出后清洗，将物理吸附在电极表面的巯基化合物清洗干净。最后用大量高纯水清洗干净并用高纯氮气吹干。
2).将电极放入pH值为4的金纳米晶溶液中，在暗处组装20个小时，取出后用高纯水清洗干净。
二目标DNA在金纳米晶修饰电极上的固定将修饰了金纳米晶的电极放入含有目标DNA的缓冲溶液中，pH为7。在50℃下，相互作用2小时。
三杂交将修饰了目标DNA的金电极放入含有银纳米晶标记的互补DNA溶液中，保持在一种适宜的环境条件下，温度为25℃，并不时地摇动，2小时后取出，用大量pH为7.0的磷酸缓冲溶液冲洗，确保银标记的DNA与目标DNA充分杂交后组装在电极表面。
四检测将电极放入200μL 50％HNO3，停留5分钟，以保证银可以完全溶解。最后放入400μL 10-1M KBr和200μL 0.1M KNO3。在酸性条件下，经过氧化处理可以使标记在互补DNA上的银纳米晶以银离子的状态溶出，通过阳极溶出伏安法检测银离子从而间接检测目标DNA的量。用此方法测定含有30个碱基的ssDNA的浓度范围在100～800pmol L-1。
实施例4一金纳米晶在金电极表面的固定1).将处理好清洁的金电极浸入含有巯基苯胺的溶液中，在室温下浸泡2个小时，取出后清洗，将物理吸附在电极表面的巯基化合物清洗干净。最后用大量高纯水清洗干净并用高纯氮气吹干。
2).将电极放入pH值为4的金纳米晶溶液中，在暗处组装8个小时，取出后用高纯水清洗干净。
二目标DNA在金纳米晶修饰电极上的固定将修饰了金纳米晶的电极放入含有目标DNA的缓冲溶液中，pH为9。在50℃下，相互作用2小时。
三杂交将修饰了目标DNA的金电极放入含有银纳米晶标记的互补DNA溶液中，保持在一种适宜的环境条件下，温度选择为37℃，并不时地摇动，1小时后取出，用大量pH为7.0的磷酸缓冲溶液冲洗，确保银标记的DNA与目标DNA充分杂化后组装在电极表面。
四检测将电极放入200μL 50％HNO3，停留5分钟，以保证银可以完全溶解。最后放入400μL 10-3M KBr和200μL 0.1M KNO3。在酸性条件下，经过氧化处理可以使标记在互补DNA上的银纳米晶以银离子的状态溶出，通过阳极溶出伏安法检测银离子从而间接检测目标DNA的量。用此方法测定含有30个碱基的ssDNA的浓度范围在100～600pmol L-1。
实施例5一金纳米晶在金电极表面的固定1).将处理好清洁的金电极浸入含有巯基乙胺的溶液中，在室温下浸泡6个小时，取出后清洗，将物理吸附在电极表面的巯基化合物清洗干净。最后用大量高纯水清洗干净并用高纯氮气吹干。
2).将电极放入pH值为6的金纳米晶溶液中，在暗处组装6个小时，取出后用高纯水清洗干净。
二目标DNA在金纳米晶修饰电极上的固定将修饰了金纳米晶的电极放入含有目标DNA的缓冲溶液中，pH为9。在30℃下，相互作用3小时。
三杂交将修饰了目标DNA的金电极放入含有银纳米晶标记的互补DNA溶液中，保持在一种适宜的环境条件下，温度选择40℃并不时地摇动，2h后取出，用大量pH为7.0的磷酸缓冲溶液冲洗，确保银标记的DNA与目标DNA充分杂交后组装在电极表面。
四检测将电极放入200μL 50％HNO3，停留5分钟，以保证银可以完全溶解。最后放入400μL 2.5×10-1M KBr和200μL 0.1M KNO3。在酸性条件下，经过氧化处理可以使标记在互补DNA上的银纳米晶以银离子的状态溶出，通过阳极溶出伏安法检测银离子从而间接检测目标DNA的量。用此方法测定含有30个碱基的ssDNA的浓度范围在100～600pmol L-1。
实施例6
一金纳米晶在金电极表面的固定1).将处理好清洁的金电极浸入含有巯基乙胺的溶液中，在室温下浸泡8个小时，取出后清洗，将物理吸附在电极表面的巯基化合物清洗干净。最后用大量高纯水清洗干净并用高纯氮气吹干。
2).将电极放入pH值为5的金纳米晶溶液中，在暗处组装10个小时，取出后用高纯水清洗干净。
二目标DNA在金纳米晶修饰电极上的固定将修饰了金纳米晶的电极放入含有目标DNA的缓冲溶液中，pH选择为7。在37℃下，相互作用5小时。
三杂交将修饰了目标DNA的金电极放入含有银纳米晶标记的互补DNA溶液中，保持在一种适宜的环境条件下，温度控制在37℃，并不时地摇动，1小时后取出，用大量pH为7.0的磷酸缓冲溶液冲洗，确保银标记的DNA与目标DNA充分杂交后组装在电极表面。
四检测将电极放入200μL 50％HNO3，停留5分钟，以保证银可以完全溶解。最后放入400μL 10-1M KBr和200μL 0.1M KNO3。在酸性条件下，经过氧化处理可以使标记在互补DNA上的银纳米晶以银离子的状态溶出，通过阳极溶出伏安法检测银离子从而间接检测目标DNA的量。用此方法测定含有30个碱基的ssDNA的浓度范围在100～900pmol L-1。
实施例7一金纳米晶在金电极表面的固定
1).将处理好清洁的金电极浸入含有巯基乙胺的溶液中，在室温下浸泡2个小时，取出后清洗，将物理吸附在电极表面的巯基化合物清洗干净。最后用大量高纯水清洗干净并用高纯氮气吹干。
2).将电极放入pH值为3.5的金纳米晶溶液中，在暗处组装8个小时，取出后用高纯水清洗干净。
二目标DNA在金纳米晶修饰电极上的固定将修饰了金纳米晶的电极放入含有目标DNA的缓冲溶液中，pH为7。在25℃下，相互作用2个小时。
三杂交将修饰了目标DNA的金电极放入含有银纳米晶标记的互补DNA溶液中，保持在一种适宜的环境条件下，温度选择为37℃，并不时地摇动，2小时后取出，用大量pH为7的磷酸缓冲溶液冲洗，确保银标记的DNA与目标DNA充分杂交后组装在电极表面。
四检测将电极放入200μL 50％HNO3，停留5分钟，以保证银可以完全溶解。最后放入400μL 5×10-1M KBr和200μL 0.1M KNO3。在酸性条件下，经过氧化处理可以使标记在互补DNA上的银纳米晶以银离子的状态溶出，通过阳极溶出伏安法检测银离子从而间接检测目标DNA的量。用此方法测定含有30个碱基的ssDNA的浓度范围在100～1000pmol L-1。
权利要求
1.一种脱氧核糖核酸电化学纳米传感器的制备方法，制备步骤如下一金纳米晶在金电极表面的固定1).处理好清洁的金电极浸入含有巯基化合物的溶液中，在室温下浸泡1～10个小时，取出后清洗，将物理吸附在电极表面的巯基化合物清洗干净，最后用大量高纯水清洗干净并用高纯氮气吹干；2).将电极放入pH值为3～7的金纳米晶溶液中，在暗处组装1～20个小时，取出后用高纯水清洗干净；二目标脱氧核糖核酸在金纳米晶修饰电极上的固定将修饰了金纳米晶的电极放入含有目标脱氧核糖核酸缓冲溶液中，pH范围为5～9，在10℃～50℃下，相互作用时间0.5～5小时；三杂交将修饰了目标脱氧核糖核酸的金电极放入含有银纳米晶标记的互补脱氧核糖核酸溶液中，温度选择为10℃～40℃，并不时地摇动，0.5～2小时后取出，用大量pH为7.0的磷酸缓冲溶液冲洗，确保银标记的脱氧核糖核酸与目标脱氧核糖核酸充分杂交后组装在电极表面；四检测将电极放入200μL 50％HNO3，停留5分钟，以保证银可以完全溶解，最后放入400μL 1×10-4～5×10-1M KBr和200μL 0.1MKNO3，在酸性条件下，经过氧化处理使标记在互补脱氧核糖核酸上的银纳米晶以银离子的状态溶出，这样就可以通过电化学的方法检测银的量从而检测目标脱氧核糖核酸的量。
2.如权利要求1所述的脱氧核糖核酸电化学纳米传感器的制备方法，其特征在于所述巯基化合物为巯基乙胺或巯基苯胺。
全文摘要
本发明属于脱氧核糖核酸电化学纳米传感器的制备方法。将金纳米晶固定在金电极表面后，利用金纳米晶可以与带有巯基功能团的DNA相互作用的特性将已知序列的目标单链DNA(ssDNA)固定在金电极表面。采用银纳米晶标记的互补DNA与固定在金电极表面的目标ssDNA发生杂交反应。在酸性介质中将银纳米晶氧化释放以离子状态存在于溶液中。通过电化学方法检测银离子的量从而检测目标DNA的量。这种新型的DNA电化学传感器具有很强的选择性和很高的灵敏度。
文档编号G01N33/53GK1525163SQ03127158
公开日2004年9月1日 申请日期2003年9月17日 优先权日2003年9月17日
发明者李景虹, 王美佳, 刘晓庆 申请人:中国科学院长春应用化学研究所
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