专利名称：：高灵敏度快速检测血吸虫循环抗原药盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及的是应用血清学技术检测血吸虫病循环抗原时所用的药盒。在血吸虫病防治工作中，检测人体内是否有血吸虫成虫或虫卵代谢物的存在，是诊断、治疗和疗效考核的重要判断依据，运用血清学技术进行检验是目前的主要检测手段。由于人体被感染后，虽经治疗并已痊愈，其体内因此所产生的抗体仍可保留较长时间，因而以往对抗体检测的方法和结果常常不能真实反映出体内是否还存在有活虫及活动性感染的程度，也不便准确判断和考核治疗效果，现已逐渐被可直接反映体内有活虫寄生因而更具诊断意义的对循环抗原的检测所代替。经长期研究，现已了解这些循环抗原可包括如成虫表膜抗原、肠相关抗原等由血吸虫成虫排泄释放入患者血中的虫源性抗原和由毛蚴分泌物进入循环系统而形成的虫卵源性抗原等几大类。经电泳分析表明它们是由蛋白质、多糖和核糖核酸等几类大分子物质的数十种抗原组分组成的十分复杂的抗原谱。由于这些循环抗原在感染患者血清中的浓度一般都很低，加之这众多的抗原成分在是否具有诊断意义及诊断价值的大小上又各不相同，因而增加了对具有病原学诊断意义和价值的循环抗原检测工作的困难和难度。在目前的血吸虫病循环抗原检测中，报道较多的一类是用由不同抗原制备得到的单克降抗体进行特异性检测的方法。例如，严自助等人曾在《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》1990.Vol.8(3)中报道了用肠相关阴极抗原的单克隆抗体直接法斑点酶联试验检测的方法;在《上海免疫学杂志》1991.Vol.11(3)中又报道了采用循环虫卵可溶性糖蛋白抗原的单克隆抗体直接法斑点酶联试验检测循环虫卵抗原的方法。裘丽姝等人在上述前种杂志的同一期中报道了采用成虫表膜抗原的单克隆抗体进行检测的方法。周蕊等人在该杂志1990年的第4期中也报道了用血吸虫的排泄分泌抗原(S.ESA)制备的单克隆抗体的斑点酶联免疫吸附试验的检测方法。虽然这种由某种特定抗原所得到的单克隆抗体对该种抗原可具有排除其它干扰因素的较高特异选择性，但由前述内容可知，在成分众多的复杂抗原谱中，其这种特异性的作用范围毕竟过于局限，且所检出抗原的诊断意义有无或大小也尚属待测。这些存在问题有些在上述有关文献中也已有所论及。由于在检测中对处于低水平状态的循环抗原检测的敏感性不高导致了其在实际使用中的检出率和准确性很难达到如文献中所报道的水平，尤其是对轻度感染的检测影响更为明显。除此以外，上述文献报道的检测多采用斑点法，其操作步骤多，要求及控制条件较严格，对某些偏远穷困地区而言甚至可称是难以实现的苛求，而且检测所用的时间长，材料浪费也较大，这些也造成了普遍推广应用中的困难。本申请内容的发明人在《免疫学杂志》1988.Vol.4(1)中曾报道过一种由可同时针对虫源性和虫卵源性等多种抗原所制备的多克隆抗体免疫血清，利用生物素-亲合素系统(BAS)多级放大原理的抗原探针进行检测的方法。虽然就某一特定抗原而言，多克隆抗体在某些方面可能不及单克隆抗体的特异选择性高，但由于其是经专门选择的动物由实验室制备得到的，而且是可针对血吸虫病多种循环抗原，因此其不仅在排除其它寄生虫感染干扰而仅针对血吸虫抗原上具有必要的特异性，而且对各种循环抗原而言的总敏感性和检出率明显提高。但由于其检测方法仍未能克服斑点法所固有的缺点，例如在为广泛普及使用所必须的简化操作和对各种简陋或恶劣环境条件的广泛适应性，以及在进一步提高检测准确性，尤其是对低感染度检测的敏感性和检出率等方面都还有着需进一步改进和完善之处。本发明的目的正是为进一步提高检测水平和简化操作并可对各种环境条件都有广泛适应性而提供一种检测血吸虫循环抗原，尤其是以多克隆抗体为基础检测血吸虫循环抗原的检测工具，即通常所称的药盒。本发明的检测药盒仍包括有应相互配合使用的固相载体与检测试剂两部分组成。其中的固相载体以聚氯乙烯(PVC)材料为支承基质。由于现在已知PVC材料本身就具有该载体应具备的吸附抗循环抗原抗体的作用，因此所说的固相载体可以就采用此材料构成的支承基质本身。目前除PVC材料外，也有采用如硝酸纤维薄膜或其它适当材料形式的固相载体，因此本发明所说的固相载体除上述形式外，也可以为在PVC基质材料表面以各种形式被覆有其它适当材料膜层的复合形式，例如本发明优先推荐的是被覆有硝酸纤维膜层的复合载体形式。本发明所说的检测试剂是有A、B两组分的混合液体形式。其中组分A为用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗荧光素抗体，组分B为用荧光素标记的抗血吸虫循环抗原抗体。组分A中的抗荧光素抗体可由常规免疫注射法制备动物的高效价抗荧光素抗体，免疫血清纯化后用过碘酸钠法标记上HRP。实验证明，在用HRP标记时，以使每个抗荧光素抗体分子平均结合1.5-2个HRP分子为好，低于或高于此值可因HRP量不足或过量可能造成在用显色剂显色时的显色不足或非特异性显色等不利影响，不同程度地影响显色准确性。组分B中的抗血吸虫循环抗原抗体由前述内容可知，虽不必完全排除使用单克隆抗体，但经使用单株单克隆抗体和多克隆抗体比较，在试验方法特异性很好的情况下，后者明显优于前者，因此建议以采用可同时针对虫源性和虫卵源性等多种抗原的多克隆抗体为佳，它们均可由普通免疫方法制备得到，经纯化后再按常规方法用荧光素标记而成。实验结果显示，用荧光素(F)标记抗循环抗原抗体(P)时，每毫升被标记抗体中的F/P的克分子比值为1-2为佳，比值过大因易出现多个抗体的空间位阻等原因反而可能产生不利影响。与一般免疫试验一样，检测试剂中各组分因其制备的原料源和/或方法等原因，使用效果上会有所差异，即使同批制备出的各组分在混合时的混配比例不同检测效果也不相同。因此，除在通常试剂中均必不可少的缓冲液、无机盐及表面活性剂等成分外，组分A与组分B各自的最佳使用浓度或/和最适混配比例均可由常规免疫试验的棋盘式方阵最佳滴度选择确定。在上述内容基础上，经反复试验和比较发现，如能将所用的固相载体由通常的平面板形式改为带有可盛纳液体的适当形式的凹窝式，例如带有一个或数个柱状或半球状凹窝等形式，可进一步提高检测效果和水平，并且操作也很方便。尤其当采用有被覆膜层的复合式固相载体时，所复合的膜层仅被覆在凹窝的底表面与把包括凹窝侧壁在内的全部表面都被覆上膜层相比效果相近，但前者至少在经济上讲是更可取的。由上述内容不难看出，本发明检测药盒的重要特点之一就是检测试剂中利用了优于BAS系统的荧光素-抗荧光素抗体系统的多级放大作用和原理。利用具有半抗原性质的小分子荧光素与大分子的抗荧光素抗体间很高的特异亲合性可产生多级放大作用近来虽有报道，但在本发明上述内容提出之前，在对寄生虫�。绕涫嵌匝娌⊙房乖募觳庵腥次醇挥行У赜τ�。加之对固相载体形式的改进和最佳形式的选择，使得本发明的检测工具无论在操作方法的简易性、检测所用时间的长短和对环境条件的要求程度和广泛适应性，还是在检测效果和水平，尤其是对低感染度的检测水平上均远远优于前述文献中的各种方法。例如在操作方法上，检测中必不可少的冲洗用水可用自来水或井水、河水等任何水源的洁净水代替在斑点法中所严格要求使用的蒸馏水及缓冲液，并且也完全省却了通常为斑点法所不可少的恒温箱、烘烤箱、摇床等仪器设备;被检者的血样既可以为通常所用的血清，也可以为未加分离的全血;检测耗时也可由斑点法的数小时减少为20-30分钟;每次检测规模要求也可由斑点法的必须数十上百人份一批降为一人份一批，检测成本也可降低50%以上。其中有些优点显然是目前各种方法所完全无法实现的，它们无疑都具有特别重要的实用意义和价值，为在门诊快速检测，特别是为在环境和条件极简陋的偏远地区开展和普及实地检测提供了极大的便利条件，并使之能得以实现。在检测效果上，用本发明的药盒检测血吸虫病循环抗原的灵敏度可以达到10-9g的水平，比现在的斑点试验(Dot-ELISA)法提高了30倍。对采自轻、中、重不同感染度的血吸虫病流行区粪检阳性患者的血清检测阳性率分别为92.9～100%，对急性血吸虫病人血清检测的阳性率为100%，而对正常人或患有其它寄生虫病人血清的假阳性率不超过0.11%，显示了对血吸虫病循环抗原，尤其是对轻度感染血清的检测具有理想的敏感度和特异性，这也是目前各种检测工具及方法所不及的。采用本发明检测药盒及方法与前述文献报道的检测技术的有关方面的比较数据见表1，文献报道的检测方法均为斑点试验法，其中“对比1”用的工具为严自助等人所报道的，“对比2”用的工具为裘丽姝等人所报道的，“对比3”用的工具为周蕊等人报道的。以下介绍的是作为本
发明内容的实例，但本发明的范围并不仅限于下述实例。例1本例药盒中的固相载体采用带有若干圆柱状凹窝的PVC片材为支承基质，并在各凹窝内的底平面上被覆有硝酸纤维膜层。本例药盒中的检测试剂有A、B两部分组成，按常规与无机盐、缓冲液、表面活性剂及蒸馏水等混合。用免疫注射法制备高效价的兔抗FITC(异硫氰酸荧光素)免疫血清，经硫酸铵盐析后用过碘酸钠法标记制备与HRP的结合物，得到组分A，其中每个抗体分子平均结合1.5个HRP分子。由可针对血吸虫成虫释放的肠相关抗原和表膜抗原及虫卵源性抗原等多种抗原制备的高效价(106)多克隆抗循环抗原抗体经硫酸铵盐盐析及柱层析纯化后，用FITC标记，使每个抗体分子平均标记1.75个FITC分子，得到组分B。将按1∶25-1000稀释度的组分B与按1∶100稀释度的同量抗原在棋盘式固相载体上作方阵滴度选择后，确定组分B的最佳稀释浓度为1∶200。以此效价的组分B对按1∶25～1000不同稀释度的组分A用同样方法确定了组分A的最佳稀释度为1∶100以及在检测试剂中A与B两组分的最适混合比例为2∶1。用本例检测试剂对标准阴性与阳性血清的四次消光值(OD值)检测结果分别为0.95，0.98，0.89和0.92，标准差0.039，变异系数4.12%。例2固相载体及制备检测试剂的方法同例1。其中检测试剂中组分A每个抗体分子平均标记1.7分子HRP，组分B中每个抗体分子平均标记1.9分子FITC，其最佳稀释浓度均同例1，A与B的最适混合比例为1∶1。本例试剂对标准血清检测的四次消光值分别为1.10，1.05，1.15和0.97，标准差0.082，变异系数7.66%。例3固相载体及制备检测试剂的方法同例1。其中检测试剂中组分A每抗体分子平均标记1.95分子HRP，组分B每抗体分子平均标记1.5分子FITC，其最佳稀释浓度均同例1，A与B的最适混合比例为1.5∶1。本例试剂对标准血清的四次消光值检测结果分别为1.30，1.20，1.26和1.15，标准差0.066，变异系数5.13%。以上三例检测试剂实测感染血清确定的效价均在1∶4096以上，完全符合实测的要求。本发明上述检测药盒使用时的操作方法十分简单。首先将经稀释的待测血清(必要时可用全血，但注意不要溶血)铺满固相载体中的某一凹窝底面，室温25℃放置10分钟(延长时间不限)，倾去血清，自来水洗10次后空干。加入按1∶50-100工作浓度稀释的检测试剂，25℃放置10分钟后倾去，自来水洗10次以上，最后最好再用蒸馏水洗一次，空干。加入含H2O2的TMB底物溶液反应5-10分钟，即可用目测或分光光度计作比色分析，判断结果。除此以外并无其它更多的仪器设备及操作条件方面的要求。表1</tables>权利要求1.一种用于检测血吸虫病循环抗原的药盒，包括相互配合使用的固相载体和检测试剂两部分组成，其特征在于固相载体采用聚氯乙烯材料为支承基质，检测试剂为用辣根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体与用荧光素标记的抗血吸虫循环抗原抗体的混合物。2.如权利要求1所述的药盒，其特征在于所说检测试剂中用辣根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体中，每个抗体分子上被结合的标记酶分子为1.5-2个。3.如权利要求1所述的药盒，其特征在于所说检测试剂中被标记的抗血吸虫病循环抗原抗体为同时针对血吸虫虫源性和虫卵源性抗原的多克隆抗体。4.如权利要求1至3之一所述的药盒，其特征在于所说检测试剂中被标记于抗血吸虫病循环抗原抗体(P)上的荧光素(F)分子的P/F摩尔数之比为1/1～2。5.如权利要求4所述的药盒，其特征在于所说检测试剂中用酶标记的抗荧光素抗体与用荧光素标记的抗血吸虫病循环抗原抗体间的优化混合比例由免疫试验的棋盘式方阵滴度选择确定。6.如权利要求1所述的药盒，其特征在于所说的固相载体为至少带有一个凹窝的形式。7.如权利要求1或6所述的药盒，其特征在于所说的固相载体为在聚氯乙烯支承基质上被覆有硝酸纤维膜层的复合形式。8.如权利要求6所述的药盒，其特征在于所说的固相载体为仅在支承基质凹窝的底面上被覆有硝酸纤维膜层的复合形式。9.如权利要求5所述的药盒，其特征在于所说的固相载体为在由聚氯乙烯片状材料制成的带凹窝的支承基质上，仅在凹窝的底面上被覆有硝酸纤维膜层的复合形式。全文摘要本发明提供的是由相互配合使用的固相载体和检测试剂组成的血吸虫病循环抗原检测药盒。其中的固相载体以PVC为支承基质，检测试剂为采用荧光素-抗荧光素多级放大系统放大的抗血吸虫循环抗原抗体酶结合物。本发明药盒具有高灵敏度、快速及操作简单方便的优点，符合普及推广应用的实际要求。文档编号G01N33/535GK1062601SQ9210801公开日1992年7月8日申请日期1992年1月17日优先权日1992年1月17日发明者黎世涛,王秀珍,周肇西申请人:四川省医学科学院寄生虫病防治研究所
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