专利名称：梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种梅毒特异性总抗体检测试剂，尤其是涉及一种采用胶体金免 疫层析技术(immimochromatography)进行的梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂
条 ο
背景技术：
梅毒(Syphilis)是一种由梅毒螺旋体(Tr印onema pallidum, TP)引起的性传播 性疾�。洳≡迨敲范韭菪澹袈菪蹇�。梅毒螺旋体主要通过性接触、输血、创口或 者胎盘等途径传播。梅毒螺旋体从感染区附近的淋巴结进入血液，播散全身，使机体几乎 所有的组织及器官受累，临床表现为全身性，可分为不同临床阶段，包括一期、二期、三期和 潜伏期。世界卫生组织(WHO)曾乐观地预言“由于有高敏度检测方法和高效的治疗方案， 梅毒是一种能够通过公共卫生措施得到成功控制的性传播性疾病”。遗憾的是，至今梅毒 依然是世界范围的公共卫生问题，缺乏有效的行政控制措施，每年全球大约有1200万的患 #，胃中 60 力■^女gii#。 ( :He￡ilth Protection Agency Centre for Infections. International Encyclopediaof Public Health-Syphilis[M]. London, UK :Health Protection Agency Centre，2008，289-297)事实上，梅毒的感染现状可能要比想象中的更 让人悲观。调查发现，梅毒感染者已经较广泛地存在于普通人群中。梅毒螺旋体尚不能进行体外培养，梅毒诊断与流行病学调查主要依赖于血清学试 验，包括特异性抗体和反应素检测两大类型。梅毒特异性抗体IgM(TP-IgM)和IgG(TP-IgG) 抗体分别于2周和4周后产生，即使患者经过足够治疗，其仍能长期存在，甚至终身不消失 (参见:Luis J F, Felipe U S, Santa G C, et al. Evaluation of a rapid strip and a particle agglutinationtests for syphilis diagnosis[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2007，59 :123-126)；而另一种抗体物质反应素产生较晚，一般在 受感染后5 7周产生(参见林月圆.TPPA和TRUST在梅毒诊断中的价值与临床相关问 题[J].放射免疫学杂志，2009，22 (3) :295-297.)，而且晚期梅毒、梅毒治疗后期以及潜伏 梅毒可能阴性。因此梅毒特异性抗体的阳性率、敏感性显著高于反应素。TP-IgM是梅毒感染 后，机体最先出现的特异性抗体。只要有活的梅毒螺旋体存在，其TP-IgM将会维持在一定 的水平』artinaH等(参见:MartinaH, DaanffN,Mart Μ, et al. Comparison of a Treponema pallidum IgM immunoblot with a 19S fluorescenttreponemal antibody absorption test for the diagnosis of congenital syphilis[J]. DiagnosticMicrobiology and Infectious Disease, 2007, 59 :61_66.)认为TP-IgM是梅毒早期感染并活动的一项血清 学标志，李步荣等(参见李步荣，贺军涛，张毅，等.梅毒螺旋体IgM抗体检测的临床意义 [J].第四军医大学学报，2007,28(16) 1495-1497)认为TP-IgM与TP-DNA —样，代表着梅 毒传染性指标。在排除近期抗梅毒治疗的前提下，TP-IgM若不转阴，提示体内可能残存梅毒 螺旋体或治疗不彻底。TP-IgM阴转者随访时再转阳性，表明再次感染梅毒(参见=RawstronSA, Mehta S，Bromberg K，et al. Evaluation of a Treponema pallidum2specific IgMenzyme immunoassay and Treponema pallidum western blot antibody detection in the diagnosisofmaternal and congenital syphilis[J]. Sex Transm Dis，2004，31 (2) 123-126)。尽管TP-IgM阴性不能完全排除传染性，但TP-IgM阳性必定提示该患者具有传 染性。早期的血清学方法使用完整梅毒螺旋体作为抗原，研究和诊断用的TP是以TP感 染兔睾丸获得，这种方法花费大、获得的TP量少、不纯(混有宿主蛋白)，与其他病原体存 在交叉反应，因此假阳性也时有发生。随着分子生物学技术的普及及梅毒螺旋体抗原的相 继克�。刈榭乖τ糜诿范臼笛橐丫嚼丛蕉�。目前研究比较多的TP抗原有TPW7、 TPN47、TPNl5, TPN44. 5、TPN36、TP0453、TP0684 及 TPr 家族。采用重组 DNA 技术制备的重 组抗原可以克服完整TP抗原的缺点，能快速、经济地制备无限量特异重组TP抗原。梅毒特异性抗体检测是梅毒确证试验，包括TPHA，TPPA, ELISA，FTA-ABS及 Western-blot等，其特异性均较高。然而，面对严峻的防制形式，不但需要特异准确的检测 手段，还需要一种更简便快捷的试剂来筛查，以便为临床和疾病防控提供对策。
发明内容本实用新型的目的是提供一种梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条。本实用新型设有载体板、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜(NC膜)、梅毒特异性总抗 体检测线、对照线和吸收垫。加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端 设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设在 硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性总抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅 毒特异性总抗体检测线处包被抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原TPN17和/或梅毒特 异性抗原TPN47，在对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体。所述载体板可采用PVC板。以下给出本实用新型的制备方法，包括以下步骤1)制备梅毒重组抗原TPN17和TPN47采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其 表达，得梅毒重组抗原TPN17和TPN47 ；2)硝酸纤维素膜的点样在梅毒特异性总抗体检测线上包被抗人Ig单克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅 毒抗原TPN17和TPN47 IgG抗体，晾干，所述抗人Ig单克隆抗体的浓度为1 4mg/mL，羊 抗梅毒抗原TPNl7和TPN47的IgG抗体由抗TPm7_IgG抗体与抗TPN47_IgG抗体按体积比 1 1混合，其终浓度为1 4mg/mL ；三者点样量为1 μ L/cm ；3)制备胶体金采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，取氯金酸ImL加入到IOOmL去离 子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01%，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热 搅拌下加入柠檬酸三钠水溶液2. OmL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于 棕色瓶中4°C冰箱保存备用，所述柠檬酸三钠的浓度可为2% ；[0018]4)胶体金与TPm7、TPN47的标记胶体金与梅毒特异性抗原TPW7的标记取胶体金10ml，用0. Imol/LNaOH调至 ρΗ5· 4，加 100 μ g 丁卩附7，混勻，放置51^11，加入5%85八 Iml 混勻，4°C、10000r/min 离心 lh, 弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10ml，4°C、10000r/min离心lh，弃上清，沉淀用TBS稀 释至1ml，得胶体金标记的TPN17抗原；胶体金与梅毒特异性抗原TPN47的标记同上操作，得胶体金标记的TPN47抗原； 将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合后，均勻地涂于玻璃 纤维膜上，烘干，制备成胶体金垫；所述将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合，最好胶体金标 记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原以体积比1 (0. 2 5)混合；所述烘干的温 度可为37°C ；5)制备免疫层析检测条将加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一 端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设 在硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性总抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在 梅毒特异性总抗体检测线处包被抗人Ig单克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅毒抗原TPm7 和TPN47的IgG抗体，用切条机切成条状，得梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂
^^ ο本实用新型提供了一种采用胶体金免疫层析技术建立梅毒特异性总抗体胶体金 免疫层析检测试剂条，可用于全血、血清、血浆及脑脊液等标本中梅毒特异性总抗体的检 测。在检测时，所需的标本量极�。恍枰厥庖瞧鳎庋壑苯优卸两峁壹觳饧虮憧焖伲� 特异性强，灵敏度高，准确可靠，成本低，应用广泛。
图1为本实用新型实施例的结构组成示意图。图2为实验结果模式示意图。在图2中，(1)为使用前的示意图，(2)为无效试验 (产品质量问题)，(3)毒特异性总抗体阴性，(4)毒特异性总抗体阳性。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本实用新型作进一步的说明。参见图1，本实用新型所述实施例设有载体板1、加样垫2、胶体金垫3、硝酸纤维膜 (NC膜)4、梅毒特异性总抗体检测线5、对照线7和吸收垫8。加样垫2、胶体金垫3、硝酸纤维膜4和吸收垫8依次粘贴在载体板1上表面，加样 垫2的一端设在胶体金垫3的一端上，胶体金垫3的另一端设在硝酸纤维膜4的一端上，吸 收垫8的一端设在硝酸纤维膜4的另一端上，梅毒特异性总抗体检测线5和对照线8依次设 在硝酸纤维膜4上；在梅毒特异性总抗体检测线5处包被抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性 抗原TPN17和/或梅毒特异性抗原TPN47，在对照线7处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47 的IgG抗体。所述载体板1采用PVC板。
5[0032]以下给出本实用新型实施例的制备方法，包括以下步骤1)制备梅毒重组抗原TPN17和TPN47采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其 表达，得梅毒重组抗原TPN17和TPN47。2)硝酸纤维素膜的点样在梅毒特异性总抗体检测线上包被抗人Ig单克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅 毒抗原TPN17和TPN47 IgG抗体，晾干，所述抗人Ig单克隆抗体的浓度为1 4mg/mL，羊 抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体由抗TPm7_IgG抗体与抗TPN47_IgG抗体按体积比 1 1混合，其终浓度为1 4mg/mL;三者点样量为lyL/cm。3)制备胶体金采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，取1 %氯金酸ImL加入到IOOmL去离 子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01%，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热 搅拌下加入柠檬酸三钠水溶液2. OmL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于 棕色瓶中4°C冰箱保存备用，所述柠檬酸三钠的浓度可为2%。4)胶体金与TPm7、TPN47的标记胶体金与梅毒特异性抗原TPW7的标记取胶体金10ml，用0. lmol/L NaOH调至 ρΗ5· 4，加 100 μ g TPNl7,混勻，放置 5min,加入 5 % BSA Iml 混勻，4°C、10000r/min 离心 Ih, 弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10ml，4°C、10000r/min离心lh，弃上清，沉淀用TBS稀 释至1ml，得胶体金标记的TPN17抗原。胶体金与梅毒特异性抗原TPN47的标记同上操作，得胶体金标记的TPN47抗原。将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合后，均勻地涂于玻璃 纤维膜上，烘干，制备成胶体金垫。所述将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合，最好胶体金标 记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原以体积比1 (0. 2 5)混合；所述烘干的温 度可为37°C。5)制备免疫层析检测条将加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一 端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设 在硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性总抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在 梅毒特异性总抗体检测线处包被抗人Ig单克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅毒抗原TPm7 和TPN47的IgG抗体，用切条机切成条状，得梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条。以下给出免疫层析法检测患者的临床标本参见图2，取待检标本(全血、血清、血浆、脑脊液)5 80yL，静置20min观察结 果。只在检测条对照区C有一紫红色条带出现，则判为阴性；在检测区T及对照区C均有一 紫红色条带出现，则判为阳性；加样检测后，检测区T和对照区C均不出现紫红色条带，为无
效结果。以下给出本实用新型的性能检定1)外观检查白色包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝，胶带无开胶，无切斜现象。2)阳性标本符合率用TP-总抗体阳性的不同滴度的阳性参比血清各50份采用 梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条检定，计算阳性符合率。阳性参比血清的确 定采用TPPA(日本富士株式会社)法确定的临床标本。3)阴性标本符合率用50份阴性参比血清检定，计算阳性符合率。阴性参比血清 的确定采用TPPA(日本富士株式会社)法确定的临床标本。4)灵敏度检测用卫生部室内质控血清检测，最低检出限度应小于或等于4NCU/ mL，与TPPA(日本富士株式会社)相当。5)批内差异同一批次梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条，用特征性 血清检测，要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。6)批间差异不同批次梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条，用特征性 血清检测，要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。7)干扰试验检测结果不受标本溶血(η = 50)、脂血(η = 50)和黄疸(η = 50) 的干扰。血清(或血浆)来自本申请人临床标本。8)交叉反应采用梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条，进行系统性红 斑狼疮(η = 30)、类风湿病(η = 30)、免疫性肝炎(η = 30)等自身免疫系统疾病的检测， 未发现交叉反应。自身免疫系统疾病的血清来自本申请人临床确诊患者。9)稳定性检测应用Arrhenius法则，将试剂条放置37°C 20天后检测，以上各项 指标无显著变化，确保成品在室温干燥条件下保存，有效期为18个月。以下给出具体实施例。实施例1在硝酸纤维素膜(NC膜)总检测线上包被抗人Ig单克隆抗体，在对照线处包被羊 抗梅毒抗原(TPN 17和TPN47) IgG抗体，室温晾干，密封室温保存备用。其中，抗人Ig单克 隆抗体的浓度为lmg/mL，羊抗梅毒抗原(TPN17和TPN47)IgG抗体由抗TPm7-IgG抗体与抗 TPN47-IgG抗体按体积比1 1混合，其终浓度为lmg/mL; 二者点样量为lyL/cm。将已纯化的金标记的梅毒重组抗原TPN17和TPN47以体积比1 1混合后，均勻 地涂于玻璃纤维纸上，在37°C烘干，制备成金胶体垫，密封备用。将固相化的纤维膜与胶体 金结合的玻璃纤维、吸水纸等按一定顺序，通过PVC不干胶底板组合在一起，用切条机切成 一定宽度检测条。把梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条与干燥剂一起装入铝箔 袋中，机器封口，密封保存。取待检标本血清50 μ L，加样于梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条加 样区，静置20min观察结果。只在梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条对照区有 一紫红色条带出现，则判为阴性；在检测区及对照区均有一紫红色条带出现，则判为阳性； 加样检测后，检测区和对照区均不出现紫红色条带，为无效结果。实施例2与实施例1相似，区别在于金胶体垫仅由TPW7组成，不含有TPN47。结果判断与 实施例1相同。实施例3与实施例1相似，区别在于金胶体垫仅由TPN47组成，不含有TPW7。结果判断与
7实施例1相同。实施例4与实施例1相似，区别在于待检标本为脑脊液标本，结果判断与实施例1相同。实施例5性能验证试验按实施例1的方案制备梅毒特异性总抗体快速检测试剂，然后进 行性能验证。1)外观检查白色包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝，胶带无开胶，试剂 条宽度在3 士 0. 1mm，无切斜现象。2)阳性标本符合率50份梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA)(日本富士 株式会社)检测确定的TP-总抗体阳性参比血清，采用梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析 检测试剂条检出TP-总抗体阳性50份，阳性标本符合率100%。3)阴性标本符合率50份梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA)(日本富士 株式会社)阴性参比血清，采用梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条检测未检出 阳性标本，阴性标本符合率100%。4)灵敏度检测用卫生部室内质控血清检测，最低检出限度应小于或等于4NCU/ mL，与TPPA(日本富士株式会社)相当。5)批内差异同一批次梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条，用特征性 阳性血清(TPPA(日本富士株式会社)检测确定的临床标本阳性TP-总参比高、中、低血清) 检测，相同滴度检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。6)批间差异不同批次梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条，用特征性 阳性血清(TPPA(日本富士株式会社)检测确定的临床标本阳性TP-总参比高、中、低血清) 检测，相同滴度检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。7)干扰试验检测结果不受标本溶血(η = 50)、脂血(η = 50)和黄疸(η = 50) 的干扰。8)交叉反应采用梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条，进行系统性红 斑狼疮(η = 30)、类风湿病(η = 38)、免疫性肝炎(η = 40)等自身免疫系统疾病的检测， 未发现交叉反应。9)稳定性检测将梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条放置37°C 20天 后检测，以上各项指标无显著变化。本实用新型的检测在一条梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条上进行， 通过两种方式实现梅毒特异性总抗体的检测。方式一利用胶体金免疫层析技术，在硝酸纤维素膜上总抗体检测线和对照线处 分别包被抗人Ig单克隆抗体[或梅毒特异性抗原(TPN17和/或TPN47)]和羊抗梅毒抗原 (TPN17和/或TPN47) IgG抗体。将已纯化的金标记的梅毒重组抗原TPN17和TPN47以一定 的比例混合后预包被在玻璃纤维纸上，干燥处理，制备成金胶体垫，再辅以恰当的样品处理 垫，组合试剂条(组装方式见图1)。检测阳性样本时，样本中梅毒特异性总抗体与胶体金标 记的重组抗原TPN17和/或TPN47结合形成免疫复合物。由于层析作用，复合物沿纸条吸 水纸方向向前移动。经过检测线时，①TP总抗体免疫复合物与预包被的抗人Ig单克隆抗 体[或梅毒特异性抗原(TPN17和/或TPN47)]结合形成“Au_TPN17 (和/或TPN47)-特异
8性抗梅毒总抗体_抗人Ig单克隆抗体_固相材料”或“AU-TPN17 (和/或TPN47)-特异性 抗梅毒总抗体_抗人Ig单克隆抗体_固相材料”夹心物而凝聚显色；②游离金标抗原则在 对照线处与羊抗梅毒抗原(TPN17和TPN47)的抗体结合而富集显色。阴性标本则仅在对照 线处显色。方式二，将方式一的包被抗原、抗体对调在硝酸纤维素膜上总抗体检测线和对照 线处分别包被梅毒重组抗原(TPm7/TPN47组合)和人IgG抗体，将金标记的抗人Ig单克 隆抗体预包被在玻璃纤维纸上。两种方式所制备的梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条，均可用于全 血、血清、血浆及脑脊液等标本中梅毒特异性总抗体的检测，标本用量微�。恍枰厥庖� 器，肉眼直接判读结果。且检测简便快速，特异性强，灵敏度高，准确可靠，成本低，应用广 泛。
权利要求梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条，其特征在于设有载体板、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜、梅毒特异性总抗体检测线、对照线和吸收垫；加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性总抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性总抗体检测线处包被抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原TPN17和/或梅毒特异性抗原TPN47，在对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体。
2.如权利要求1所述的梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条，其特征在于所 述载体板为PVC板。
专利摘要梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条，涉及梅毒特异性总抗体检测试剂。设载体板、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜、梅毒特异性总抗体检测线、对照线和吸收垫。加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫粘贴在载体板上表面，加样垫一端设在胶体金垫一端上，胶体金垫另一端设在硝酸纤维膜一端上，吸收垫一端设在硝酸纤维膜另一端上，梅毒特异性总抗体检测线和对照线设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性总抗体检测线处包被抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原TPN17和/或梅毒特异性抗原TPN47，在对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体。标本量极�。恍杼厥庖瞧鳎觳饧虮憧焖伲匾煨郧浚槊舳雀撸既房煽�。
文档编号G01N33/543GK201673157SQ20102019882
公开日2010年12月15日 申请日期2010年5月19日 优先权日2010年5月19日
发明者张忠英, 张长弓, 杨天赐, 林丽蓉 申请人:厦门大学附属中山医院
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