专利名称：新的呼肠病毒、其抗体、疫苗及它们的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及与SARS相关的新呼肠病毒，特异结合或中和该病毒的抗体，用该病毒制备的疫苗，预防、诊断、和治疗动物呼肠病毒感染或SARS的方法等。
背景技术：
呼肠病毒属于呼肠病毒科(Reoviridae)，正呼肠病毒属(Orthoreovirus)，因其最初是从动物呼吸道和肠道分离出来又找不到与之有关的疾病而得名(Respiratory and Enteric Orphan virus)。该科分为9个属，其中有3个属(正呼肠病毒属、轮状病毒属和环状病毒属)(刘克洲、陈智，人类病毒性疾�。嗣裎郎霭嫔纾�2002年11月第一版，P534-541)，可以感染人和动物。为区别于科名，正呼肠病毒属的病毒常被称为正呼肠病毒或呼肠孤病毒。
呼肠病毒的病毒粒子直径在60-80nm之间，具有双层同心二十面体衣壳，无包膜。双层衣壳的病毒颗粒具有完全的感染力。另外呼肠病毒具有一定的热稳定性，可存活的pH值范围较大，并可存在于气溶胶内，相对湿度较高时更稳定。
呼肠病毒为双股RNA(dsRNA)组成，全基因组共约23kb，有10个片段L1、L2、L3、S1、S2、S3、S4、M1、M2、M3，分别编码8个结构蛋白质和3个非结构蛋白质，其中S1编码两个蛋白质σ1和σ1S。序列高度保守的蛋白质有λ1、σ3、σ2、σNS、μ1等。
S1基因编码的σ1蛋白质是呼肠病毒和宿主细胞相互作用的主要成分，该蛋白质可诱导宿主产生特异性中和抗体；L1基因编码的λ3蛋白，是依赖RNA的RNA聚合酶；S3基因编码的RNA结合多肽σNS，与单链RNA(dsRNA)具有很高的亲和力，在呼肠病毒组装过程中发挥重要功能。
呼肠病毒外面的双层衣壳由8种结构蛋白质构成，其中内层衣壳也称为核心区域，由5种蛋白质组成(λ1、λ2、λ3、μ2和σ2)，外层衣壳由另外的三种蛋白质(μ1、σ3和σ1)组成。基因组片段和病毒的转录酶被封装在内层衣壳内。
非结构蛋白质有M3基因编码的μNS蛋白、S1基因编码的σ1S蛋白和M1基因编码的μ2蛋白，但它们的功能目前尚不十分明确。
SARS的全球性爆发，引起了全世界的广泛重视。2003年4月，美国国家疾病控制中心在新英格兰医学杂志上发表论文报道从SARS患者体内分离到冠状病毒，并用特异性引物的RT-PCR方法检测患者标本；其他地区的科研单位也陆续发表了数篇类似的研究论文。RT-PCR检测的病原体包括肺炎衣原体、肺炎支原体、副黏液病毒等常见的非典型肺炎的病原体，但其中尚无呼肠病毒感染的报道，甚至没有同一科其它病毒感染的报道。
发明内容
发明人首次从SARS患者体内分离到两株新的呼肠病毒，分别称为BYD1和BLD1，并证明与SARS的发病有关，由此完成本发明。
本发明涉及含有SEQ ID NO5和SEQ ID NO6的序列的分离的呼肠病毒。
本发明还涉及两株分离的呼肠病毒，其保藏号分别为CGMCCNo.0950和CGMCC No.0951。
本发明还涉及特异结合上述本发明的呼肠病毒或其蛋白的分离的抗体。本发明的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
本发明还涉及免疫原性组合物，其含有生理可接受的载体和本发明的呼肠病毒。
本发明还涉及一种(用于保护哺乳动物免受呼肠病毒引起的病毒感染或SARS侵袭的)疫苗，其含有生理可接受的载体和如下组中的至少一个成员
(a)活的本发明的呼肠病毒；(b)修饰的活的本发明的呼肠病毒；(c)减毒的活的本发明的呼肠病毒；(d)灭活的本发明的呼肠病毒。
在优选实施方案中，该疫苗还含有佐剂。
本发明还涉及在动物中检测呼肠病毒感染或诊断SARS的方法，包括将本发明的抗体或本发明的呼肠病毒与来自所述动物的生物样品接触，并检测或观察抗原-抗体复合物的存在。该动物优选是哺乳动物，例如人。
本发明还涉及保护哺乳动物免受呼肠病毒引起的病毒感染或SARS侵袭的方法，包括给有此需要的动物接种免疫有效量的本发明的疫苗。优选地，接种途径是皮下、鼻内、口服、皮内、肌内、或肠胃外途径。
本发明还涉及一种抗体，能中和本发明的病毒。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明还涉及治疗呼肠病毒引起的病毒感染或SARS的方法，包括给动物施用本发明的中和性抗体或疫苗。
本发明还涉及抗病毒药物的筛选方法，包括将候选药物与本发明的病毒接触，并测定所述病毒的活力。
本发明还涉及本发明的病毒在制备本发明抗体或疫苗中的用途。
本发明还涉及本发明的呼肠病毒在制备用于诊断SARS的试剂中的用途。
本发明还涉及本发明的呼肠病毒在诊断SARS中的用途。
本发明还涉及本发明的呼肠病毒在制备用于治疗SARS的药物中的用途。
本发明还涉及本发明的呼肠病毒在治疗SARS中的用途。
具体实施例方式
发明人从北京两位SARS患者痰漱液和咽拭子标本分离到两株BYD1和BLD1新的病毒，最初用SCV(SARS冠状病毒)引物扩增，但PCR无法扩增出SCV特异性基因片段。经初步血清学试验证明，该病毒和SARS的发生相关。
通过对所述病毒的培养、形态学观察、理化试验、血清学反应和部分基因组序列测定，证实我们用Hep-2细胞分离到病毒直径分别在60-80nm，不同于已知直径为80-120nm的SCV(SARS冠状病毒)，而且更为符合呼肠病毒属病毒的特征。
尤其是，本发明人采用分子生物学方法即RT-PCR技术扩增出2个片段，经序列测定，所得PCR产物测序结果与已公布的呼肠病毒序列同源性为87％-93％(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)。鉴于可以感染人类的一般呼肠病毒没有引起SARS的能力，因此，推测从SARS患者样本中分离的是一种SARS相关的新呼肠病毒。
提供含有所述病毒样本的两位SARS患者为母女关系，女儿患病后传染给母亲。试验结果表明，从女儿和母亲的标本中均能分离呼肠病毒。所分离到的呼肠病毒能与康复病人血清凝集，表明所分离到的新呼肠病毒可能是引起SARS的病原体之一。
因此，一方面，本发明涉及含有SEQ ID NO5和SEQ ID NO6的序列的分离的呼肠病毒。在具体实施方案中，本发明涉及两株分离的呼肠病毒(Orthoreovirus)，其保藏号分别为CGMCC No.0950和CGMCC No.0951。
根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，本发明的两株新病毒已经于2003年6月9日保藏在国际保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。并给予了保藏号CGMCC No.0950(BYD1)和CGMCC No.0951(BLD1)。该国际保藏单位的地址是中国北京市海淀区中关村北一条13号。
本发明的病毒可以通过常规方法进行分离。例如，在一个具体实施方式
中，可以将痰漱液和咽拭子标本，浸于无血清1640培养基，8000rpm离心10min，上清经孔径为0.22μm无菌滤膜过滤，将处理好的标本接种于长成单层的Hep-2细胞培养瓶中，每份标本接种两瓶，37℃孵育1h，吸出标本液，加含有2％小牛血清的1640细胞维持液，置37℃培养，每天观察细胞病变(CPE)。
本发明的病毒可以通过常规方法进行培养。例如，可在Hep-2细胞和Vero-E6细胞系上传代培养。
抗体组合物、其片段及其它结合剂另一方面，本发明还提供结合剂，如抗体及其抗原结合片段，它们显示与本发明公开的病毒或其蛋白免疫学结合(特异结合)。如果一种抗体或其抗原结合片段与本发明的病毒或其蛋白以可检测的水平反应(例如ELISA测定)，而在类似条件下不与无关病毒或其蛋白可检测地反应，则称其可与该病毒或其蛋白“特异结合”、“免疫学结合”和/或是“免疫反应性的”。
抗体的“抗原结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子参与抗原结合的部分。
抗体的制备是本领域熟知的，例如，可采用如下文献中描述的方法《当代免疫学技术与应用》，巴德年等编，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998。
本发明病毒特异的单克隆抗体可用Kohler和Milstein，Eur，J.Immunol.6511-519，1976的技术及其改进方法制备。简言之，这些方法包括制备能产生具有希望特异性(即与目的抗原的反应性)的抗体的无限增殖化细胞系。例如，可以用本发明活病毒、修饰病毒、减毒病毒、或灭活病毒免疫动物(优选哺乳动物，例如兔)，收集致敏淋巴细胞。然后通过例如与骨髓瘤细胞融合，优选地与免疫动物同源的骨髓瘤细胞融合，使所述淋巴细胞无限增殖化。可以使用多种融合技术，例如，致敏淋巴细胞和骨髓瘤细胞可以与非离子型去污剂结合几分钟，然后以低密度接种于支持杂种细胞生长但不支持骨髓瘤细胞生长的选择性培养基中。一种优选的筛选技术使用HAT(次黄嘌呤、氨喋呤、胸苷)筛选。经足够的时间后，通常1至2周，观察到杂种集落。选择单集落，检测其培养上清液对病毒或蛋白的结合活性。优选具有高反应性和特异性的杂交瘤。
可从生长的杂交瘤集落的上清液中分离单克隆抗体。另外，也可以利用多种技术提高产量，如向合适的脊椎动物宿主(如小鼠)的腹膜腔中注射杂交瘤细胞系。然后从腹水或血液中收集单克隆抗体。可以利用常规技术，如层析、凝胶过滤、沉淀和抽提，从抗体中除去污染物。
疫苗和免疫接种本发明还提供一种用于保护哺乳动物免受呼肠病毒引起的病毒感染或SARS侵袭的疫苗，其含有生理可接受的载体和如下组中的至少一个成员(a)活的本发明的呼肠病毒；(b)修饰的活的本发明的呼肠病毒；(c)减毒的活的本发明的呼肠病毒；和(d)灭活的本发明的呼肠病毒。
优选地，所述疫苗还含有佐剂。该佐剂可以是本领域已知的任何佐剂。
修饰的灭活病毒疫苗、亚单位疫苗的制备是本领域技术人员熟知的。
如白油佐剂灭活疫苗的制备按文献(曾群辉，张冰，陈明勇，等。牦牛ETEC灭活疫苗的研制及免疫效力试验[J]。中国预防兽医学报，2001，23(3)197-199.)的方法制备油相；水相(即病毒液部分)的制备方法将BYD1和BLD1毒株分别在Hep-2上细胞培养72h，收集培养物，进行3次冻融，56℃灭活30min，超声破碎3min，并以9000rpm/min离心30min，收集上清。在上清液中加入甲醛溶液，使其浓度达4ml/L，放入37℃摇床灭活48h。将油相和水相按1∶1放入匀浆机中匀浆，乳化5-10min，即成油佐剂疫苗。
蜂胶佐剂灭活疫苗的制备按文献(曾群辉，张冰，陈明勇，等。牦牛ETEC灭活疫苗的研制及免疫效力试验[J].中国预防兽医学报，2001，23(3)197-199.)制备蜂胶乙醇浸液；水相部分按上述方法制备。取1份蜂胶佐剂加入1份水相灭活的BYD1和BLD1种毒株人工感染敏感动物组织悬液中，摇匀，4℃作用24h，即成蜂胶佐剂疫苗。
疫苗检验按常规方法检查其物理性状，并进行菌检和安全性检验。
免疫接种接种白油佐剂灭活疫苗和蜂胶佐剂灭活疫苗0.5-1ml(敏感动物)，每只颈部皮下注射灭菌生理盐水0.5-1ml，每隔7d耳静脉采血，检测抗体效价。
本发明还涉及保护哺乳动物免受呼肠病毒引起的病毒感染或SARS侵袭的方法，包括给有此需要的动物接种免疫有效量的本发明疫苗；优选地，所述接种途径是皮下、鼻内、口服、皮内、肌内、或肠胃外途径。
诊断和治疗SARS和相关疾病的方法本发明还涉及在动物中检测呼肠病毒感染或诊断SARS的方法，包括将本发明的抗体或呼肠病毒与来自所述动物的生物样品接触，并检测或观察抗原-抗体复合物的存在。
上述检测可以利用已知的任何方法，包括，但不限于，ELISA、免疫荧光技术、放射免疫技术等。
本发明还涉及治疗呼肠病毒引起的病毒感染或SARS的方法，包括给动物施用治疗有效量的中和性抗体或本发明的疫苗。
中和性抗体可以采用本领域已知的任何方法制备。
本发明的工业用途本发明病毒用途之一该病毒可用于免疫学诊断试剂的开发。
本发明病毒用途之二该病毒可用于制备诊断和治疗性抗体的开发。
本发明病毒用途之三该病毒可用于减毒活疫苗和灭活疫苗的开发与研制。
本发明病毒用途之四该病毒可用于抗病毒药物筛选的毒株和药效考核的标准毒株。
本发明病毒用途之五该病毒可用于研究和开发基因诊断及基因治疗等方法。
以下通过非限制性的实施例对本发明进行举例说明。
图1(A-F)电镜(EM)观察呼肠病毒在Hep-2细胞的胞浆中聚集的情况。电子显微镜证实该病毒为直径60-80nm的呼肠病毒颗粒。图1A-E显示病毒BYD1在Hep-2细胞的胞浆中聚集的情况，可以观察到呼肠病毒不同成熟阶段和两种类型的病毒粒子有致密核心的成熟粒子和有透明核心的空心粒子。这两种类型的病毒粒子都有一个大约14nm厚的衣壳。大多数病毒颗粒都是成群分布的，呈晶格状排列(图1C-E)。用同样方法从该患者母亲的标本中也分离出病毒BLD1，电镜观察结果类似(图1F)图2-1L3(320bp)PCR产物琼脂糖电泳结果(EB染色)。各泳道自上而下分别是BYD1株、BLD1株、DL2000分子量标准。
图2-2S2(488bp)PCR产物琼脂糖电泳结果(EB染色)。各泳道自上而下分别是BYD1株、BLD1株、DL2000分子量标准。
图3病毒接种Balb/c小鼠后的肺组织切片照片。可见肺间质增宽，肺泡融合(间质性肺炎)。
实施例实验材料1.标本、细胞与培养基标本来源于2003年3月13日收到北京SARS患者痰漱液和咽拭子标本。分离用的细胞为Hep-2，由中国人民解放军微生物检验研究中心细胞库保存。培养基RPIM 1640为Gibco/BRL公司产品；青霉素、链霉素为华北制药厂产品；2％小牛血清为美国HyClone公司产品。
2.血清收集正常人血清为本中心保存；SARS病人血清采自北京佑安医院、309医院及302医院SARS初期及康复期患者。
3.RT-PCR和扩增产物纯化试剂病毒RNA提取试剂盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit)购自QIAGEN公司；反转录酶(SuperScriptII)和Taq DNA聚合酶购自宝生物公司；核酸凝胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)购自QIAGEN公司。
4.仪器设备荧光显微镜OLYMPUS IX70日本产，PCR仪GENE AMP2400美国产，生物安全柜440-44E美国产，紫外分光光度计BACKMAN公司美国产，高速离心机BACKMAN公司美国产。
5.引物设计由军事医学科学院生物工程研究所合成以下两对引物S2基因488+GTT GGA TTT GGT GGT CTG C(SEQ ID NO1)488-CCA CTC CAC ATA TCC TCG(SEQ ID NO2)L3基因320+CAG TCG ACA TTG TGG TC(SEQ ID NO3)320-GCG TAC TGA CGT GGA TCA TA(SEQ ID NO4)以上两对引物分别位于呼肠病毒L3基因及S2基因区段内。
实施例1新病毒的分离和形态学表征本实施例采用如下方法分离本发明的新病毒。
细胞培养法将处理好的标本接种于长成单层细胞的Hep-2细胞培养瓶中，每份标本接种两瓶，37℃吸附1h，吸出标本液、加含有2％小牛血清的1640细胞维持液，置37℃培养。每天观察细胞病变(PEC)。
细胞超薄切片电镜观察单层细胞感染病毒后48h，取CPE(++)以上刮取细胞，800rpm离心5min，常规固定、脱水、包埋、超薄切片，染色后在Philip CM120透射电镜下观察并拍照。取未接种病毒的对照细胞，同步观察。
结果用Hep-2传代细胞接种北京SARS患者痰漱液和咽拭子标本处理液2份。提供含有所述病毒样本的两位SARS患者为母女关系，女儿患病后传染给母亲。从女儿和母亲的标本中分离获得2株病毒，分别称为BYD1和BLD1。接种24小时后Hep-2细胞出现明显的细胞病变，并且能够稳定传11代。将分离的第11代毒株接种于Hep-2细胞培养液中，经负染观察。
电镜观察所分离的病毒在第11代Hep-2细胞的胞质中聚集的情况，电子显微镜证实该病毒为直径60-80nm的病毒颗粒。图1A-E显示BYD1株病毒在Hep-2细胞的胞浆中聚集的情况，可以观察到病毒不同成熟阶段和两种类型的病毒粒子有致密核心的成熟粒子和有透明核心的不完全装配的病毒粒子。这两种类型的病毒粒子都有一个大约14nm厚的衣壳。大多数病毒颗粒都是成群分布的，呈晶格状排列(图1C-E)。用同样方法从该患者母亲的标本中也分离出病毒BLD1，电镜观察结果类似(图1F)。
但是从这2例患者的咽拭子中未能分离出SARS相关的冠状病毒(SCV)。这可能是因为从咽拭子中分离SCV的几率比痰中要少得多，因此不适合于SCV的分离。
令人感兴趣的是，在感染SCV BJ01株的Vero-E6细胞中发现的典型冠状病毒粒子其粒子直径为80-120nm，具有一个黑的中心核衣壳和包膜。更重要的是，BJ01感染的Vero-E6细胞中同时观察到位于内质网内的冠状病毒和分布在胞质中的呼肠病毒，而在作为对照的Vero-E6细胞中两种病毒均未被发现。
由上述病毒形态学表征显示，所分离的病毒是一种呼肠病毒科病毒。
实施例2新呼肠病毒分纯及理化性质表征为了纯化病毒仅保存呼肠病毒(为无包膜病毒)去除有膜冠状病毒，采用乙醚处理病毒液的方法，连续处理三次，传三代，每次处理后进行十倍递增稀释，并接种细胞培养，待出现明显CPE后收获10-3以上病毒稀释度再进行下次处理。对处理1次和第3次后传1代的病毒液，收获后冻化一次，低速离心取上清液进行核酸型，耐酸(pH5.0和3.0)和耐热(56℃30min)试验，同时设病毒对照。
耐乙醚试验——取病毒液0.8ml于管底，加入0.2ml(20％)乙醚，充分摇匀后置4℃冰箱过夜，次日倒于无菌平皿中待乙醚挥发后，用细胞生长液作十倍递增稀释，微量测定病毒的TCID50。
核酸型试验——取0.1ml病毒液用含100μg/ml，5-IUDR(市售阿洛昔韦)细胞生长液作十倍稀释，微量滴定TCID50，加入微量板时2滴(0.025ml/滴)病毒液加2滴细胞悬液。
耐酸试验—取病毒液0.3ml加到管底用0.1N HCl调pH3.0，取另一支病毒液0.3ml调pH至5.0，37℃水浴1h后用7.5％NaHCO3调回pH至7.0，同上稀释并滴定病毒TCID50。
耐热试验——取0.3ml病毒液于管底置56℃水浴灭活30min，取出后同上稀释滴定TCID50。
病毒对照取取同样的病毒液0.1ml，同上稀释滴定TCID50.
表1BYD1株病毒液的理化试验鉴定结果试验组乙醚处理1次后滴度*乙醚处理3次后滴度*核酸型 6.57.5耐乙醚 6.57.5耐酸pH 5.0 6.5----pH 3.0 1.0＜1.0耐热(56℃，30min)＜1.0 ＜1.0病毒对照组 6.57.5*-滴度以TCID50/0.05ml表示从表中的结果看，BYD1株病毒通过第一次乙醚处理与第三次乙醚处理后的病毒理化性质结果完成相同。该病毒为RNA病毒，无包膜，在pH5.0的环境下保持稳定，对pH3.0时病毒滴度有很大下降，但仍保存了活性。对56℃，30min病毒迅速灭活。病毒经过连传三代后病毒滴度有所提高，CPE出现也提早1天。该病毒通过乙醚处理1次后已完全纯化。
从理化性质看，并结合电镜形态学观察，病毒的大小60-80nm，BYD1株属呼肠病毒科呼吸病毒属的成员。
实施例3新呼肠病毒部分基因的克隆及序列测定为进一步确证分离株(BYD1和BLD1)是否是呼肠病毒，我们针对呼肠病毒核酸序列中的保守区域设计了引物1)488+5’-GTTGGA TTT GGT GGT CTG C-3’；2)488-5’-CCA CTC CAC ATATCC TCG-3’，并用RT-PCR的方法扩增出一条488bp的核酸片段。3)320+CAG TCG ACA TTG TGG TC；4)320-GCG TAC TGA CGTGGA TCA TA，并用RT-PCR的方法扩增出一条320bp的核酸片段。大小与我们目的基因片段的理论值相等，见图2。另外，用同样方法我们也得到了其他几个与预期结果相符的核酸片段。进一步DNA序列分析，获得部分序列测定结果。
RT-PCR及PCR产物测序从细胞培养上清中按QIAamp Viral RNA Mini Kit说明书提取病毒RNA。首先进行反转录，在管中加入5ul总RNA，1μL SuperscriptII反转录酶(200u)，1ul随机引物，4ul 5×反应缓冲液，1ul RNA酶抑制剂和1ul 10mM dNTP以及2ul 0.1M DTT，最后用不含RNase的水补足体积至20ul。于42℃反应60min后，95℃灭活5min。然后进行PCR扩增，反应系统包括5ul 10×PCR反应缓冲液，1ul10mMdNTP，2ul 25mM MgCl2，1ul TaqDNA聚合酶(2.5u)，上下游引物各1ul(10μM)，用水补足至50ul。分别扩增40个循环。反应完毕，将产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。
PCR产物切胶回收纯化后由中国科学院北京基因组研究所及军事医学科学院生物工程研究所测序。所测序列如下(两个病毒株BYD1和BLD1所测结果相同)。
1、L3区段部分基因序列(268bp)5’-TTIATGCGGATTCGCAATTCTCCCCTCTTGATCACGCATCGAACTGTTGATTAAAGTATCGTGTGTTCATTTGCCAAAGTGCCAGTGGGAAAATCCAATTTCCTTCAAAAGGCACCATCATCCCAGTCTCATCTCTAATCATTGGCGCGGCGCCATTCATTCCAAACGAIATACGGCAATCTCGTCCGAATATGTGAACGCCAGGAGTATCACGATCAAACACCAAGTCAGGTGGAGGAGCCAGAGGCGACCACAAATGTGTCGACTG-3’(SEQ ID NO5)2.S2区段部分基因序列(483bp)5’-CCACTCCACATATCCTCGTCCACCCGAACGTACGAAATTGGACCGAACCCCGTTAAGTTGAGTAAACGTTACGGCACTCAATTGCTGGTACACTCGGTGCTTAAATCTTGGATCACGTGCTAAGAATGGGTAATCGTCGCAATCATACACTCGATCTGCTTGCGCCTGCAAAGCGGGCTGTGCCAGAACTTGTGGTGGGGCTACAACTAAACCATCAAGCGTAGGAGCTGACCACACTAGGCGCAGGAACCTGATATCTCCCCATCGGTGGTTAGGCCGAAATGGTATCTGAAGAGTACCACTTAAAAGGCAACTCATTTGATAATATCTTGAACCAGCGGTTGGAACGAGAGCCGATGTAGCTAGACCTCGCCCTAGACTTATCCAATCCAGAAATTGAGTCAGCTGCCATGGTGAATTACCCGCTCGAAGAAGATGTGAAGACAACTCATCGTTAATTGGCACATTTTGCAGACCACCAAA-3’(SEQ ID NO6)经BLAST比对，483bp片段与呼肠病毒科的正呼肠病毒属S2基因片段的同源性为87％，268bp片段与呼肠病毒科的正呼肠病毒属L3基因同源性为93％，提示分离获得2株病毒(BYD1和BLD1)是一种呼肠病毒科正呼肠病毒属病毒(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)。
实施例4新病毒的血清学检验培养的病毒(BYD1)上清冻融三次，56℃60min灭活，10,000rpm30min，上清用PEG6000 4℃沉淀过夜，12,000rpm 30min，沉淀用病毒裂解液(2％SDS PBS 0.01M Ph7.2)裂解，测定蛋白含量。
用250μg/ml病毒纯化液包被酶联板，100μl/孔包被酶联板。37℃60min，PBS 0.01M pH7.2(2％BSA) 封闭30min，血清1∶10稀释37℃水浴40min，加抗人酶标抗体(中国人民解放军微生物检验研究中心制备)后按常规ELISA方法检测。
ELISA结果如下
A1/ASARS患者OD值/正常人OD值ELISA法检测的上述血清学结果，显示该病毒与SARS发病相关。
实施例5间接免疫荧光染色分离物感染细胞片的制备将培养成单层的Hep-2细胞用Hank’s液洗一次，然后接种分离物(BYD1和BLD1)细胞培养悬液，放37℃孵箱中吸附1h，加入细胞维持液，1mL/瓶，放37℃继续培养。待细胞刚刚出现病变时，取感染细胞滴片，将滴好的玻片放37℃ CO2孵箱中继续培养8h使细胞贴壁。取出玻片，放入0.005M pH7.2 PBS中漂洗，除去未贴壁的悬浮细胞，凉干。放入冷丙酮内，-30℃过夜固定，凉干，-20℃密封保存备用。
间接免疫荧光抗体染色方法将病人血清标本1∶10稀释后，56℃作用30min，然后再适当稀释后分别滴加到细胞抗原片上，置37℃湿盒中作用30min(若检测IgM抗体则作用90min)，冲洗，PBS振荡洗3次，凉干。然后加羊抗人FITC(Sigma公司产品)标记荧光抗体，置37℃湿盒中作用30min，冲洗同前，凉干，在荧光显微镜下观察染色结果。
间接免疫荧光染色法检测36份SARS患者和正常人血清，前者阳性检测结果为36/36，后者阳性检测结果为1/36。表明该病毒与SARS发病相关。
实施例6动物实验Balb/c鼠接种法选择健康的4周、雌性BALB/c鼠，在无菌条件下，腹腔内接种0.5ml/只病毒液(BYD1或BLD1)，每种样品分别接种6只。每日观测小鼠的发病情况，体温变化情况。发现小鼠频死前剖杀，将鼠解剖取肺组织，用戊二醛固定后进行电镜观察。
感染呼肠病毒的肺组织切片中，肺泡中隔显著增厚，肺泡腔内有大量单核细胞和少数多形核白细胞浸入(图3)。在感染肺组织的电镜切片中，发现纤维组织明显增生。正常Balb/C小鼠肺组织切片观察显示肺泡结构正常。
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病学研究所<120>与SARS相关的新呼肠病毒、其抗体、疫苗及它们的用途<130>not yet<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>DNA<213>引物<400>1gttggatttg gtggtctgc 19<210>2<211>18<212>DNA<213>引物
<400>2ccactccaca tatcctcg18<210>3<211>17<212>DNA<213>引物<400>3cagtcgacat tgtggtc 17<210>4<211>20<212>DNA<213>引物<400>4gcgtactgac gtggatcata 20<210>5<211>268<212>DNA<213>呼肠病毒
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1.一种分离的呼肠病毒，其选自保藏号为CGMCC No.0950的病毒；或保藏号为CGMCC No.0951的病毒。
2.特异结合权利要求1的呼肠病毒或其蛋白的分离的多克隆抗体或单克隆抗体。
3.免疫原性组合物，含有生理可接受的载体和权利要求1的呼肠病毒。
4.一种用于保护哺乳动物免受呼肠病毒引起的病毒感染或SARS侵袭的疫苗，其含有生理可接受的载体和下组中的至少一个成员(a)活的权利要求1的呼肠病毒；(b)修饰的活的权利要求1的呼肠病毒；(c)减毒的活的权利要求1的呼肠病毒；和(d)灭活的权利要求1的呼肠病毒；优选地，所述疫苗还含有佐剂。
5.在动物中检测呼肠病毒感染或诊断SARS的方法，包括将权利要求2的抗体或权利要求1的呼肠病毒与来自所述动物的生物样品接触，并检测或观察抗原-抗体复合物的存在。
6.保护哺乳动物免受呼肠病毒引起的病毒感染或SARS侵袭的方法，包括给有此需要的动物接种免疫有效量的权利要求4的疫苗；优选地，所述接种途径是皮下、鼻内、口服、皮内、肌内、或肠胃外途径。
7.一种单克隆抗体或多克隆抗体，其能中和权利要求1的病毒。
8.治疗呼肠病毒引起的病毒感染或SARS的方法，包括给动物施用权利要求7的抗体或权利要求4的疫苗。
9.抗病毒药物的筛选方法，包括将候选药物与权利要求1的病毒接触，并测定所述病毒的活力。
10.权利要求1的病毒在制备权利要求2的抗体、权利要求3的免疫原性组合物、权利要求4的疫苗、或权利要求7的抗体中的用途。
11.权利要求1的呼肠病毒在开发用于诊断、预防或治疗SARS的试剂中的用途。
全文摘要
本发明公开了与SARS相关的新呼肠病毒，特异结合或中和该病毒的抗体，用该病毒制备的疫苗，预防、诊断、和治疗动物呼肠病毒感染或SARS的方法等。
文档编号G01N33/569GK1566334SQ03146590
公开日2005年1月19日 申请日期2003年7月8日 优先权日2003年7月8日
发明者端青, 朱虹, 何君, 檀华, 张浩杰, 宋立华, 周育森, 甘永华, 左庭婷 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
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