专利名称：一种赭曲霉毒素a荧光检测试纸条及其应用的制作方法
技术领域：
一种赭曲霉毒素A荧光检测试纸条及其应用，涉及一种量子点标记的适配体的荧 光试纸条检测赭曲霉毒素A的方法，属于荧光检测技术领域。
背景技术：
赭曲霉毒素A，英文名称=OchratOXinA(OTA)是曲霉属和青霉属的某些菌种产生 的二次代谢产物，直接�：θ死嘟】�。该毒素多发生在30°C以下潮湿地区，体内和体外 试验显示OTA具有遗传毒性，引起DNA的损伤，大鼠和小鼠试验能穿透胎盘引起致突变作 用。上泌尿管肿瘤的患者，其血液中OTA的水平高于其他人群，因此暂定的每周耐受摄入量 (PTffI) 100ng/kgo考虑到小麦、大麦和黑麦是摄入OTA主要的食物品种，决定制定这些食物 中OTA的限量标准。我国制定标准时参照CAC的指标值，规定赭曲霉毒素A在谷类、豆类中 ^ 5 μ g/kg，以保护人民健康和调控进出口粮食。目前检测OTA的主要方法是薄层色谱分析(TLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)、高效 液相色谱法(HPLC)，但这些仪器分析方法不仅需要昂贵的仪器设备，对检材的要求也比较 高，需要经过复杂的样品前处理才能进行。而荧光试纸条的检测方法具有快速、灵敏度高、 操作简单等优点。本发明用量子点与适量的适配体偶联制备荧光试纸条。
发明内容
本发明的目的是提供量子点标记的适配体的荧光试纸条用于检测赭曲霉毒素A， 该方法具有快速、灵敏度高、操作简单等优点。本发明的技术方案Aptamer ①3-NH2_GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CATCGG ACA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAptamer ②5-Biotin-TTT TTT TTT TTT TTT TTTAptamer ③5-Biotin_CTA GCC CAC ACC CAC CGC ATT TCC CTC GTAGCC TGT streptavidin 与 biotin-Aptamer ②反应生成 streptavidin-biotin-Aptamer (2), streptavidin 与 biotin-Aptamer ③反应生成 streptavidin-biotin-Aptamer ③， Ap tamer ①、Aptamer ②、Aptamer (3) ^ streptavidin-biotin-Aptamer ②、 str印tavidin-biotin-Aptamer③，均购自上海生工生物工程有限公司。Streptavidin 阿拉丁试剂公司购买赭曲霉毒素A荧光检测试纸条，由下吸水垫(1)，量子点偶联Aptamer①(2)， streptavidin-biotin-Aptamer (2) (3), streptavidin-biotin-Aptamer (3) (4)，上吸水塾 (5)，硝酸纤维素膜(6)和底板(7)所组成；硝酸纤维素膜(6)固定于底板(7)上，硝酸纤维素膜(6) —端与上吸水垫(5)相 联；另一端或者与下吸水垫(1)相联，或者通过固定于硝酸纤维素膜(6)这一端的量子点偶联Aptamer①(2)与下吸水垫(1)相连。量子点偶联 Aptamer ①(2)、str印tavidin-biotin—Aptamer ②(3)、 str印tavidin-biotin-Aptamer③(4)间隔地顺序与硝酸纤维素膜(6)形成复合层；其中，以str印tavidin-biotin-Aptamer ②(3)作为检测带，以 streptavidin-biotin-Aptamer ③(4)作为参照带。试纸条宽度不低于3. 5mm，且外观平整，材料附着牢固，液体移行速度不低于5mm/
mirio所述下吸水垫(1)、量子点偶联Aptamer①⑵及上吸水垫(5)表面有不干胶纸。本发明检测原理是利用吸水垫形成的毛细管虹吸效应，使被检测物质首先与量子 点偶联Aptamer①发生竞争形式的结合，其后果是，当量子点偶联Aptamer①过量时，多余 的适配体漂移到检测带，与str印tavidin-biotin-Aptamer②结合并显色；而与检测物结 合的量子点偶联Aptamer①，其V区结合位点被检测物质占据，只能跨越检测带漂移到参照 带以C区位点与str印tavidin-biotin-Aptamer③非特异性结合，同检测带进行比色而得 到检测结果。本发明的有益效果本发明应用层析式一步竞争法原理，试纸条上下带比色来半 定量检测样品中赭曲霉毒素A残留量，在15min内，快速准确地检测出样品是否含有赭曲霉 毒素A，以确定赭曲霉毒素A是否超标，能够满足食品安全对赭曲霉毒素A残留量检测需求， 适用于饲料、屠宰企业及政府检测机构。本发明与现有技术相比，其效果不言而喻，即具有使用方便、经济快捷、制作容易、 成本低廉的特点。
图1赭曲霉毒素A荧光检测试纸条的侧视图。1、下吸水垫，2、量子点偶联 Aptamer ①，3>streptavidin-biotin-Aptamer ②，4>streptavidin-biotin-Aptamer ③，5> 上吸水垫，6、硝酸纤维素膜，7、底板。
具体实施例方式以下结合附图做进一步说明。1、赭曲霉毒素A荧光检测试纸条，包括1、下吸水垫，2、量子点偶联Aptamer①，3、 streptavidin-biotin-Aptamer ②，4、streptavidin-biotin-Aptamer ③，5、上吸水塾，6、 硝酸纤维素膜，7、底板。其中，以streptavidin-biotin-Aptamer ②作为检测带，以 streptavidin-biotin-Aptamer ③作为参照带。膜条宽度不低于3. 5mm，且外观平整，材料附着牢固，液体移行速度不低于5mm/
mirio2、赭曲霉毒素A荧光检测试纸条的制备(l)biotin 修饰的适配体 Aptamer ②、Aptamer ③分另Ij 与 str印tavidin 按摩尔比1 4在常温下反应1小时，生成str印tavidin-biotin-Aptamer②及 streptavidin-biotin-Aptamer ③。
(2)量子点与氨基修饰的Aptamer①按摩尔比1 20在常温下反应3小时，生成 量子点偶联Aptamer①。m streptavidin-biotin-Aptamer (2) (3)、streptavidin-biotin-Aptamer (3) (4) 间隔3-5mm顺序敷于底板(7)中部的的硝酸纤维素膜(6)上，与硝酸纤维素膜(6)表面形
成复合层。3、试纸条要求(1)阴性参考品符合率用磷酸盐缓冲液(PBS 0. 01mol/L,pH 7. 4)配制浓度为lOOng/mL的呕吐毒素标准 品溶液进行10次平行检测，以正常或矫正目力观察结果，反应时间在IOmin时观察结果，应 为阴性。用磷酸盐缓冲液(PBS 0. Olmol/Ι,ρΗ 7. 4)配制浓度为lOOng/mL的伏马毒素标准 品溶液进行10次平行检测，以正常或矫正目力观察结果，反应时间在IOmin时观察结果，应 为阴性。(2)阳性参考品符合率用磷酸盐缓冲液(PBS 0. 01mol/L,pH 7. 4)配制浓度为1、5、10、15ng/mL的赭曲霉 毒素A标准品进行平行检测，各浓度进行10次平行实验，反应时间在IOmin时观察结果，不 得出现阴性。(3)最低检出量用磷酸盐缓冲液(PBS 0. 01mol/L, pH 7. 4)分别配制浓度为0、1、5、10、15、20、 100ng/mL的赭曲霉毒素A标准品溶液，各浓度进行10次平行实验，反应时间在IOmin时，以 正常或矫正目力观察结果，最低检出量不高于lOng/mL。(4)再现性用磷酸盐缓冲液(PBS 0. 01mol/L, pH 7. 4)分别配制浓度为50ng/mL的氯硝西泮 标准品溶液，进行10次平行实验，反应时间在IOmin时，以正常或矫正目力观察结果，结果 一致，显色度均一。(5)稳定性测试37°C放置10天后，各项指标应符合以上要求。4、试纸使用方法(1)样品制备血清抽取待检动物血液，离心或静置后取透明上清液使用；若血清有过度溶血 现象，应将血清用蒸馏水稀释一倍后再进行实验，否则试纸条红色太深，影响测试结果。尿液用尿液直接进行测试，如浑浊，先离心取上清液或用蒸馏水1 1稀释。(2)操作将试纸条箭头端浸泡在待测样本中，不要超过下吸水垫1。浸入30sec取出放平， IOmin读取结果。(3)检测结果阴性两条带都显色，且检测带颜色深于参照带颜色，说明检测样品中不含赭曲霉毒素 A。
两条带都显色，且检测带颜色与参照带颜色相同或接近，说明检测样品中赭曲霉 毒素A含量低于5ppb (5ng/mL)。阳性两条带都显色，但检测带颜色浅于参照带颜色，说明检测样品中赭曲霉毒素A含 量超过 5ppb (5ng/mL)。检测带不显色，参照带显色，说明检测样品中的赭曲霉毒素A含量高于 20ppb(20ng/mL)。
权利要求
一种赭曲霉毒素A荧光检测试纸条，其特征在于由下吸水垫(1)，量子点偶联Aptamer①(2)，streptavidin biotin Aptamer②(3)，streptavidin biotin Aptamer③(4)，上吸水垫(5)，硝酸纤维素膜(6)和底板(7)所组成；硝酸纤维素膜(6)固定于底板(7)上，硝酸纤维素膜(6)一端与上吸水垫(5)相联；另一端或者与下吸水垫(1)相联，或者与通过固定于硝酸纤维素膜(6)这一端的量子点偶联Aptamer①(2)与下吸水垫(1)相连；量子点偶联Aptamer①(2)、streptavidin biotin Aptamer②(3)、streptavidin biotin Aptamer③(4)间隔地顺序与硝酸纤维素膜(6)形成复合层；其中，以streptavidin biotin Aptamer②(3)作为检测带，以streptavidin biotin Aptamer③(4)作为参照带；试纸条宽度不低于3.5mm，且外观平整，材料附着牢固，液体移行速度不低于5mm/min；所述量子点偶联物的核苷酸为Aptamer①3 NH2 GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGGACA AAA AAA AAA AAA AAA AAA，Aptamer②5 Biotin TTT TTT TTT TTT TTT TTT，Aptamer③5 Biotin CTA GCC CAC ACC CAC CGC ATT TCC CTC GTA GCCTGT。
2.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A荧光检测试纸条，其特征在于下吸水垫(1)、 量子点偶联Aptamer①(2)及上吸水垫(5)表面有不干胶纸。
全文摘要
一种赭曲霉毒素A荧光检测试纸条及其应用，涉及一种量子点标记的适配体的荧光试纸条检测赭曲霉毒素A的方法，属于荧光检测技术领域。本发明试纸条，由下吸水垫(1)，量子点偶联Aptamer①(2)，streptavidin-biotin-Aptamer②(3)，streptavidin-biotin-Aptamer③(4)，上吸水垫(5)，硝酸纤维素膜(6)和底板(7)所组成。本发明应用层析式一步竞争法原理，试纸条的上下比色带来半定量检测样品中赭曲霉毒素A残留量，在15min内，快速准确地检测出样品是否含有赭曲霉毒素A，以确定赭曲霉毒素A是否超标，能够满足食品安全对赭曲霉毒素A残留量检测需求，适用于饲料、屠宰企业及政府检测机构；本发明与现有技术相比，具有使用方便、经济快捷、制作容易、成本低廉的特点。
文档编号G01N33/52GK101915830SQ201010234498
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月19日 优先权日2010年7月19日
发明者刘丽强, 匡华, 彭池方, 王利兵, 胡拥明, 胥传来, 陈伟, 马文蔚 申请人:江南大学
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