专利名称：梅毒心磷脂和特异性抗体IgG免疫印迹试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种试剂盒，尤其是涉及一种梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG 抗体检测免疫印迹试剂盒。
背景技术：
梅毒(Syphilis)是一种由梅毒螺旋体(Tr印onema pallidum, TP)引起的性传播性疾�。洳≡迨敲范韭菪澹袈菪蹇啤Ｃ范韭菪逯饕ü越哟ァ⑹溲�、创口或者胎盘等途径传播。梅毒螺旋体从感染区附近的淋巴结进入血液，播散全身，使机体几乎所有的组织及器官受累，临床表现为全身性，可分为不同临床阶段，包括一期、二期、三期和潜伏期。世界卫生组织(WHO)曾乐观地预言“由于有高敏度检测方法和高效的治疗方案，梅毒是一种能够通过公共卫生措施得到成功控制的性传播性疾病”。遗憾的是，至今梅毒依然是世界范围的公共卫生问题，缺乏有效的行政控制措施，每年全球大约有1200万的患者，其中60万孕妇患者([1]林丽蓉，杨波，潘锡涛，等.潜在的血源传播患者梅毒血清学检测方法的选择.中华医院感染学杂志.2010,20(10) :1491-1494)。事实上，梅毒的感染现状可能要比想象中的更让人悲观。调查发现，梅毒感染者已经较广泛地存在于普通人群中。梅毒螺旋体尚不能进行体外培养，梅毒诊断与流行病学调查主要依赖于血清学试验，包括特异性抗体和反应素检测两大类型。梅毒特异性抗体IgM(TP-IgM)和IgG(TP-IgG) 抗体分别于2周和4周后产生，即使患者经过足够治疗，其仍能长期存在，甚至终身不消失([2]林丽蓉，但冰，付左根，等.潜在血源传播患者梅毒血清学TRUST/TPPA与IgM抗体联合检测.中国皮肤性病学杂志.2010，152 (0 =446-448)；而另一种抗体物质反应素产生较晚，一般在受感染后5 7周产生，而且晚期梅毒、梅毒治疗后期以及潜伏梅毒可能阴性，因此梅毒特异性抗体的阳性率、敏感性显著高于反应素。TP-IgM是梅毒感染后，机体最先出现的特异性抗体。只要有活的梅毒螺旋体存在，其TP-IgM将会维持在一定的水平。Martina H 等([3]Martina H, Daan W N, Mart Μ, et al. Comparison of a Treponema pallidum IgM immunoblot with a 19Sfluorescent treponemal antibody absorption test for the diagnosis of congenital syphilis[J]Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2007, 59 :61-66.)认为TP-IgM是梅毒早期感染并活动的一项血清学标志，李步荣等([4]李步荣，贺军涛，张毅，等.梅毒螺旋体IgM抗体检测的临床意义[J] 第四军医大学学报，2007，观(16) :1495-1497)认为TP-IgM与TP-DNA—样，代表着梅毒传染性指标。在排除近期抗梅毒治疗的前提下，TP-IgM若不转阴，提示体内可能残存梅毒螺旋体或治疗不彻底。TP-IgM阴转者随访时再转阳性，表明再次感染梅毒([5]RaWStr0n SA, Mehta S，Bromberg K，et al. Evaluation of a Treponema pallidum2specific IgM enzyme immunoassay and Treponema pallidum western blot antibody detection in the diagnosis ofmaternal and congenital syphilis[J]Sex Transm Dis，2004，31(2) 123-1 )。尽管TP-IgM阴性不能完全排除传染性，但TP-IgM阳性必定提示该患者具有传染
3性。TP-IgG的出现要迟于IgM，能长期存在，甚至终身不消失，因此，TP-IgG是梅毒诊断和流行病学调查的一项重要指标([6]Li-Rong Lin, Zuo-Gen Fu,Bing Dan，et al. Development of a colloidal gold-immunochromatography assay to detect Immunoglobulin G Antibodies to Treponema pallidum with TPNl7and TPN47. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2010，68 :193-200.)。早期的血清学方法使用完整梅毒螺旋体作为抗原，研究和诊断用的TP是以TP感染兔睾丸获得，这种方法存在花费大、获得的TP量少且不纯(混有宿主蛋白)、与其他病原体存在交叉反应等缺点，因此假阳性也时有发生。随着分子生物学技术的普及及梅毒螺旋体抗原的相继克�。刈榭乖τ糜诿范臼笛橐丫嚼丛蕉�。目前研究比较多的TP抗原有 TPNl7、TPN47、TPNl5、TPN44. 5、TPN36、TP0453、TP0684 及 TPr 家族。采用重组 DNA 技术制备的重组抗原可以克服完整TP抗原的缺点，能快速、经济地制备无限量特异重组TP抗原。梅毒特异性抗体检测方法包括梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA)、 酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光密螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)及免疫印迹技术 (Western-Blot)等，其特异性均较高。一般地，TPPA，ELISA作为临床初筛，当血清学阳性， 或临床诊断有困难时，需要采用FTA-ABS &Wfestern-bl0t作为确认试验。其中，FTA-ABS需要荧光显微镜，而且其结果判断需要训练有素和较丰富经验的专业人员才能完成，因此，其应用推广受到一定的限制。采用Western-blot方法制成的试剂盒，一般常规实验室均可完成，不需要特殊设备，判读也简单明了。现市售的ffestern-blot试剂均为进口试剂，价格昂
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发明内容本实用新型的目的是提供一种梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒，简称为梅毒心磷脂和特异性抗体IgG免疫印迹试剂盒。本实用新型设有载体板、硝酸纤维膜、梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线、对照线，梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线处包被梅毒特异性重组抗原和心磷脂抗原，在对照线处包被人IgG抗体；辣根过氧化物酶标记抗人γ链抗体。所述梅毒特异性重组抗原可为TPm5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、TPN47梅毒特异性重组抗原等。所述载体板可采用PVC板。本实用新型可采用以下方法制备1)制备梅毒特异性重组抗原采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒特异性重组抗原。2)制备心磷脂抗原猪心肌组织经低温速冻后风干，研磨成粉状后用甲醇和氯仿抽提，抽提液通过硅胶层析柱洗脱，提取纯度95%以上的心磷脂抗原，所述甲醇和氯仿，按体积比甲醇氯仿可为 2 1。
4[0016]3)硝酸纤维素膜的点样在硝酸纤维素膜总抗体检测线上包被梅毒特异性重组抗原和心磷脂抗原，在对照线处包被人IgG抗体，晾干，所述梅毒特异性重组抗原的浓度可为1 ％ig/mL ；点样量可为 1 μ L/cm，所述心磷脂抗原的浓度可为0. 003% 0. 03%，点样量可为1 μ L/cm。4)制备抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体以人IgG特异性片段γ链为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得稳定分泌抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株，采用ELISA的方法鉴定McAb效价在1 IO7 以上。5)抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记采用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记，所述辣根过氧化物酶的底物可由0.03% (W/V)的过氧化氢和0.07% (W/V)的二氨基联苯胺组成。6)制备免疫印迹试剂盒将硝酸纤维膜粘贴在载体板上表面，梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线处包被梅毒特异性重组抗原和心磷脂抗原，在对照线处包被人IgG抗体，用切条机切成条状，和酶标记的抗人IgG抗体及其底物共同组装成梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒。在步骤1)、3)、6)中，所述梅毒特异性重组抗原可为TPW5、TPW7、TPN37、 TPN44. 5、TPN47梅毒特异性重组抗原等。本实用新型提供了一种采用免疫印迹技术建立梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG 抗体检测试剂盒，可用于全血、血清、血浆及脑脊液等标本中梅毒特异性IgG抗体和心磷脂 IgG抗体的检测。该检测方法所需的标本量极�。恍枰厥庖瞧鳎庋壑苯优卸两峁壹觳饧虮憧焖伲匾煨郧浚槊舳雀撸既房煽浚杀镜停τ霉惴�。
图1为本实用新型实施例的结构组成示意图。图2为实验结果模式示意图。在图2中，J为使用前的示意图，I为无效试验(产品质量问题)，H为阴性结果，A F为梅毒特异性IgG抗体阳性结果；G为抗心磷脂IgG抗体阳性结果2为梅毒特异性TPN-15-IgG抗体检测线，3为梅毒特异性TPN_17_IgG抗体检测线，4为梅毒特异性TPN-37-IgG抗体检测线，5为梅毒特异性TPN-44. 5_IgG抗体检测线，6 为梅毒特异性TPN-47-IgG抗体检测线，7为心磷脂IgG抗体检测线，8为对照线。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本实用新型作进一步的说明。参见图1，本实用新型实施例设有载体板1、梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线2 7，对照线8和硝酸纤维膜(NC膜)9。硝酸纤维膜9粘贴在载体板1上表面，梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线2 7和对照线8依次设在硝酸纤维膜9上；在梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线处分别包被TPW5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、TPN47梅毒特异性重组抗原和心磷脂抗原，在对照线处包被人IgG抗体。所述载体板采用PVC板。所述梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒的制备方法，包括以下步骤1)制备 TPm5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、TPN47 梅毒特异性重组抗原采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得TPm5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、TPN47梅毒特异性重组抗原。2)制备心磷脂抗原猪心肌组织经低温速冻后风干，研磨成粉状后用甲醇和氯仿抽提，抽提液通过硅胶层析柱洗脱，提取纯度95%以上的心磷脂抗原。3)硝酸纤维素膜的点样在硝酸纤维素膜总抗体检测线上包被TPm5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、TPN47重组抗原和心磷脂抗原，在对照线处包被人IgG抗体，晾干。4)制备抗人IgG特异性片段Y链单克隆抗体以人IgG特异性片段γ链为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得稳定分泌抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用ELISA的方法鉴定McAb效价在1 IO7 以上。5)抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记采用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。6)制备免疫印迹试剂盒将硝酸纤维膜粘贴在载体板上表面，梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线处包被TPm5、TPm7、TPN37、TPN44. 5、TPN47梅毒特异性重组抗原和心磷脂抗原，在对照线处包被人IgG抗体，用切条机切成条状，和酶标记的抗人IgG抗体及其底物共同组装成梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒。以下给出采用梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒检测患者的临床标本1)标本采用0. 01mol/L PBS缓冲液进行1 50稀释。2)封闭采用5%脱脂奶粉(0. Olmol/LPBST缓冲液配制)作为封闭液，于室温 (18 25°C )在摇摆摇床上温育30min。3)血清温育取出所需的膜条，将其放入温育槽内，并编号。在温育槽中分别加入 1. 5ml已稀释样本。于室温(18 25°C )在摇摆摇床上温育30min。4)清洗吸去槽内液体，在摇摆摇床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS缓冲液清洗膜条3 次，每次5min。5)加酶结合物在温育槽中加入1. 5ml已稀释的酶结合物(采用辣根过氧化物酶标记的抗人IgG特异性片段Y链单克隆抗体)，于室温(18 25°C)在摇摆摇床上温育 30mino6)清洗吸去槽内液体，在摇摆摇床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS缓冲液清洗膜条3 次，每次5min。
6[0052]7)底物温育在温育槽中分别加入1. 5ml底物液(DAB)，于室温(18 25V )在摇摆摇床上温育IOmin。8)终止吸去槽内液体，用蒸馏水清洗膜条3次，每次lmin。结果判断将检测膜条放置在结果判定模板中，风干后判断结果。任何蛋白靶标出现的特异性条带，均可判断为阳性，确诊为梅毒(见图2)。以下给出梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒的性能检定1)外观检查试剂盒无破损，包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝，胶带无开胶，无切斜现象。2)阳性标本符合率用TP-IgG抗体、TRUST阳性的不同滴度的阳性参比血清各50 份采用梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒检定，计算阳性符合率。阳性参比血清的确定采用FTA-ABS (德国欧蒙公司)法和TRUST (厦门英科新创)确定的临床标本。3)阴性标本符合率用50份阴性参比血清检定，计算阳性符合率。阴性参比血清的确定采用TPPA(日本富士株式会社)和TRUST(厦门英科新创)法确定的临床标本。4)批内差异同一批次梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒， 用特征性血清检测，要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。5)批间差异不同批次梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒， 用特征性血清检测，要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。6)干扰试验检测结果不受标本溶血(n = 50)、脂血(n = 50)和黄疸(n = 50) 的干扰。7)交叉反应采用本梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒，进行系统性红斑狼疮(n = 30)、类风湿病(n = 30)、免疫性肝炎(n = 30)等自身免疫系统疾病的检测，未发现交叉反应。8)稳定性检测应用Arrhenius法则，将梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒放置37°C 20天后检测，以上各项指标无显著变化，确保成品在室温干燥条件下保存，有效期为18个月。以下给出具体实施例。实施例1将硝酸纤维膜粘贴在载体板上表面，梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线处包被TPm5、TPm7、TPN37、TPN44. 5、TPN47梅毒特异性重组抗原和心磷脂抗原，在对照线处包被人IgG抗体，用切条机切成条状，和酶标记的抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体及其底物共同组装成梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒。1)标本采用0. 01mol/L PBS缓冲液进行1 50稀释。2)封闭采用5%脱脂奶粉(0. Olmol/LPBST缓冲液配制)作为封闭液，于室温 (18 25°C )在摇摆摇床上温育30min。3)血清温育取出所需的膜条，将其放入温育槽内，并编号。在温育槽中分别加入
71. 5ml已稀释样本。于室温(18 25°C )在摇摆摇床上温育30min。4)清洗吸去槽内液体，在摇摆摇床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS缓冲液清洗膜条3 次，每次5min。5)加酶结合物在温育槽中加入1. 5ml已稀释的酶结合物(采用辣根过氧化物酶标记的抗人IgG特异性片段Y链单克隆抗体)，于室温(18 25°C)在摇摆摇床上温育 30mino6)清洗吸去槽内液体，在摇摆摇床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS缓冲液清洗膜条3 次，每次5min。7)底物温育在温育槽中分别加入1. 5ml底物液(DAB)，于室温(18 25V )在摇摆摇床上温育IOmin。8)终止吸去槽内液体，用蒸馏水清洗膜条3次，每次lmin。结果判断将检测膜条放置在结果判定模板中，风干后判断结果。任何蛋白靶标出现的特异性条带，均可判断为阳性，确诊为梅毒(见图2)。实施例2与实施例1相似，其区别在于硝酸纤维膜仅由TPW5、TPW7、TPN37、TPN44. 5梅毒特异性重组抗原和心磷脂抗原组成，不含有TPN47梅毒特异性重组抗原。结果判断与实施例1相同。实施例3与实施例1相似，其区别在于硝酸纤维膜仅由TPW5、TPW7、TPN37、TPN47梅毒特异性重组抗原和心磷脂抗原组成，不含有TPN44. 5梅毒特异性重组抗原。结果判断与实施例1相同。实施例4与实施例1相似，其区别在于硝酸纤维膜仅由TPm5、TPm7、TPN44. 5、TPN47梅毒特异性重组抗原和心磷脂抗原组成，不含有TPN37梅毒特异性重组抗原。结果判断与实施例1相同。实施例5与实施例1相似，其区别在于硝酸纤维膜仅由TPW5、TPN37、TPN44. 5、TPN47梅毒特异性重组抗原和心磷脂抗原组成，不含有TPm7梅毒特异性重组抗原。结果判断与实施例ι相同。实施例6与实施例1相似，其区别在于硝酸纤维膜仅由TPW7、TPN37、TPN44. 5、TPN47梅毒特异性重组抗原和心磷脂抗原组成，不含有TPm5梅毒特异性重组抗原。结果判断与实施例ι相同。实施例7与实施例1相似，其区别在于待检标本为脑脊液标本，结果判断与实施例1相同。实施例8性能验证试验按实施例1的方案制备梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒，然后进行性能验证。1)外观检查试剂盒无破损，包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝，胶带无
8开胶，无切斜现象。2)阳性标本符合率用TP-IgG抗体阳性和TRUST阳性的不同滴度的阳性参比血清各50份采用梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒检定，计算阳性符合率。阳性参比血清的确定采用FTA-ABS(德国欧蒙公司)法和TRUST(厦门英科新创)确定的临床标本。3)阴性标本符合率用50份阴性参比血清检定，计算阳性符合率。阴性参比血清的确定采用TPPA(日本富士株式会社)法确定的临床标本。4)批内差异同一批次梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒， 用特征性血清检测，要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。5)批间差异不同批次梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒， 用特征性血清检测，要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。6)干扰试验检测结果不受标本溶血(n = 50)、脂血(n = 50)和黄疸(n = 50) 的干扰。7)交叉反应采用本梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒，进行系统性红斑狼疮(n = 30)、类风湿病(n = 30)、免疫性肝炎(n = 30)等自身免疫系统疾病的检测，未发现交叉反应。8)稳定性检测应用Arrhenius法则，将梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒放置37°C 20天后检测，以上各项指标无显著变化，确保成品在室温干燥条件下保存，有效期为18个月。
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权利要求1.梅毒心磷脂和特异性抗体IgG免疫印迹试剂盒，其特征在于设有载体板、硝酸纤维膜、梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线、对照线，梅毒特异性IgG抗体和心磷脂 IgG抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线处包被梅毒特异性重组抗原和心磷脂抗原，在对照线处包被人IgG抗体；辣根过氧化物酶标记抗人Y链抗体。
2.如权利要求1所述的梅毒心磷脂和特异性抗体IgG免疫印迹试剂盒，其特征在于所述梅毒特异性重组抗原为TPW5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、TPN47梅毒特异性重组抗原。
3.如权利要求1所述的梅毒心磷脂和特异性抗体IgG免疫印迹试剂盒，其特征在于所述载体板采用PVC板。
专利摘要梅毒心磷脂和特异性抗体IgG免疫印迹试剂盒，涉及一种试剂盒。试剂盒设载体板、硝酸纤维膜、梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线、对照线，检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线处包被梅毒特异性重组抗原和心磷脂抗原，在对照线处包被人IgG抗体；辣根过氧化物酶标记抗人γ链抗体。所述梅毒特异性重组抗原可为TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5、TPN47梅毒特异性重组抗原等。可用于全血、血清、血浆及脑脊液等标本中梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体的检测。所需标本量极�。恍杼厥庖瞧鳎觳饧虮憧焖伲匾煨郧浚槊舳雀撸既房煽浚杀镜汀�
文档编号G01N33/571GK201926663SQ20112002563
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月25日 优先权日2011年1月25日
发明者刘莉莉, 张忠英, 杨天赐, 林丽蓉 申请人:厦门大学附属中山医院
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