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专利名称：利用亲和柱分析全蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质组技术领域的方法，具体是一种利用亲和柱分析全蛋白的
方法。
背景技术：
蛋白质是生物体内行使生物功能的分子载体。生物样品中全蛋白的分析鉴定对 阐明生物功能、生理状态和疾病的发生发展和治疗具有重要作用。生物样品�：�有数千种 蛋白，一般情况下，不超过二十种的高丰度蛋白占蛋白总量的99%，而数千种低丰度蛋白 占蛋白总量不到1%，高丰度蛋白与低丰度蛋白的丰度范围高达9个数量级。基于鸟枪法 (shot-g皿strategy)的生物质谱可简捷快速鉴定生物样品中多种蛋白。但由于质谱仪器本 身检测能力、检测灵敏度和检测蛋白丰度范围的限制，样品中高丰度蛋白易于掩盖低丰度 蛋白的检测信号，低丰度蛋白漏检率高。现有技术手段无法简单快捷地分析鉴定生物样品 中全蛋白，尤其是漏检低丰度蛋白。 经对现有技术的文献检索发现，在质谱鉴定之前进行预分离可以改善样品中低 丰度蛋白的检出几率，常用传统多维液相色谱、多维电泳预分离方法以及剔出高丰度蛋 白的予页处理方法(Gao等，Large scale depletion of the high-abundance proteins and analysisof middle—and low—abundance proteins in human liver proteome bymultidimensional liquid chromatography. Proteomics 8(2008) :939 947.)与质谱
联用改善了低丰度蛋白的检出几率。但在实际操作中，大规模剔除高丰度蛋白，传统多维液 相色谱和常用多维电泳预分离方法操作复杂，耗时费力，工作量大，不利于疏水蛋白、极大 和极小分子量蛋白、极高等电点和极低等电点蛋白以及膜蛋白的分析。而且大规模剔除高 丰度蛋白的操作需要首先分析鉴定高丰度蛋白，再制备相应蛋白抗体，操作时间长，工作量 大，操作繁琐。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用亲和柱分析全蛋白的方 法。本发明的方法可克服高丰度蛋白淹没低丰度蛋白信号的技术不足，提高极端性质蛋白 检出率。 本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤
步骤一，合成亲和分离材料，得到亲和分离材料库； 步骤二，提取生物样品全蛋白，从步骤一所得的亲和分离材料库中筛选出吸附蛋 白种类占全蛋白20 80%的亲和材料组合； 步骤三，从步骤二所得亲和材料组合中选择一种或多种分别填充亲和柱，之后利 用所得亲和柱，采用级联组合分析方法、串联组合分析方法、或者级联与串联混合的组合分 析方法分析生物样品全蛋白，得到多组蛋白复杂度简化的样品； 步骤四，对步骤三所得样品分别进行胰蛋白酶消化和LC-MS/MS分析，进而完成生物样品全蛋白的全蛋白分析。 步骤一中，所述亲和分离材料库具体为以如下组合中的氨基化合物为 配体，采用以环氧氯丙烷为骨架的单氨基化合物配体合成法合成相应的亲和分离 材料；以如下组合中的氨基化合物为配体，采用以三氯三氮嗪为骨架的双氨基化 合物配体合成法合成相应的亲和分离材料；所有合成的亲和分离材料构成亲和分 离材料库；所述氨基化合物的组合为3-amino-l-propanol、2-phenethylamine、 acrylamide、3， 5—dinitroaniline、3—methoxypropylamine、2_methy1—5—nitroaniline、 ethanolamine、2， 4一dichloroaniline、 ethylenediamine、2—aminobenzothiazole、 4_methyl_3_nitroaniline、3_methyl_o_phenylenediamine、 octylamine、2，
5- dichloroaniline、 propylamine、4， 4' -thiodiani 1 ine、 1， 4-phenylenediamine、 4，4-diaminodiphenylmethane、 o-toluidine、4，4' -oxydianiline、 p-toluidine、2，
6- dimethylaniline、2， 4， 6-trichloroaniline、4， 4-methylene-bis (2-chloroani1i ne) 、 m-toluidine、4-aminobipheny1、2， 3-dichloroaniline、4-aminobenzoic acid、 methyl 2-aminobenzoate、4， 4' _methylene_bis(2-methylani1ine)、 m-anisidine、 4—aminoazobenzene、 o-anisidine、 aniline、2，4_diamino_6_methylphenol、4_amino_2， 6—dinitrotoluene、l—naphthylamine、 isopropylamine、2，4—diaminotoluene、 benzidine、3' _aminoacetophenone、4_methyl_m_phenylenediamine、2， 4一dimethylaniline、4一isopropylaniline、2， 4一dinitroani1ine、 benzylamine、 4' -aminoacetophenone、4-methyl_o_phenylenediamine、2，6-dichloroaniline、 p_anisidine、2， 6-diethylaniline、 o_aminoazotoluene、4_amino_2_nitrophenol、 l_amino_2_naphthol_4_sulfonic acid、2， 6-dinitroaniline、2， 4一diaminoanisole、 2—aminophenol、 o-dianisidine、2_amino_3_nitrophenol、2—aminobenzimidazole、 2_aminopyridine、6_amino caproic acid、2—naphthylamine、2—furfurylamine、 2_methoxy_5_methylaniline、5_aminoisophthalic acid、2—nitroaniline、 4—phthalazinedione、3—aminopyridine、 cyclohexylamine、2_methy1—3—nitroaniline、 1—aminoanthraquinone、3_aminophenol、4—aminosalicy1ic acid、4_aminophenol、 arginine、2_methyl_4_nitroaniline、2_aminoterephthaiic acid、3_nitroaniline、 9-aminoacridine、4-nitroaniline、 tryptamine、2_methyl_6_nitroani1ine禾卩3， 3' -dichlorobenzidine。 步骤三中，所述亲和分离材料组合具体为分别以1，6-己二胺、色胺和6-氨基己 酸为配体，采用以环氧氯丙烷为骨架的单氨基化合物配体合成法合成的相应的亲和分析材 料；分别以丁胺和十一胺、乙二胺和L-精氨酸、苯胺和氨基醋酸、对氨基苯脒盐酸盐和L-脯 氨酸、苄胺和酪胺、以及间氨基酚和间苯二胺为配体，采用以三氯三氮嗪为骨架的双氨基化 合物配体合成法合成的相应的亲和分离材料；上述得到的9种亲和材料组成亲和分离材料 组合。 步骤三中，所述级联组合分析方法具体为取生物样品全蛋白，通过第一根亲和柱 吸附洗脱，得到流穿和洗脱两组样品；将流穿和洗脱两组样品分别通过第二根亲和柱，各自 再次得到流穿和洗脱两组样品，此时共有四组样品；依次类推，当通过第n根亲和柱后，共 得到2n组样品；所述n为> 2的自然数。
优选地，所述n为> 3的自然数。 步骤三中，所述串联组合分析方法具体为取生物样品全蛋白，通过第一根亲和柱 吸附洗脱，得到流穿和洗脱两组样品；流穿组样品通过第二根亲和柱吸附洗脱，得到流穿和 洗脱两组样品，共三组样品；依次类推，将每一次得到的流穿组样品再次通过亲和柱吸附洗 脱，得到与之相应的流穿和洗脱两组样品，在通过第m根亲和柱后，共得到m+l组样品；所述 m为^ 3的自然数。 优选地，所述m为> 5的自然数。 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明设计合成具有结构多样性 的亲和配体的分离材料库，利用亲和材料对不同类别蛋白吸附特异不同的性质，通过几种 亲和材料柱的串联组合和(或)级联组合进行生物样品中的复杂蛋白的简化分组；本发明 的方法流程简单，不需要大型仪器设备，易于自动化，只需要3 6小时就可以完成蛋白分 组，相比传统的SDS-PAGE、两维电泳、两维液相色谱法，时间大大縮短；亲和柱组合分组对 蛋白样品复杂度简化后，在LC-MS/MS分析对多肽的分离可以只采用一维C18反相分离，免 用了离子交换步骤，进而可节省几个小时；亲和柱组合分组后检出蛋白数量比分组前提高 60 150% ，检出蛋白对原始样检出蛋白覆盖率高达80 90%以上，比现有文献报道检出 的蛋白数提高很多。


图1亲和组合分组系统工作流程示意图。
具体实施例方式
以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前 提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的 条件。
本实施例中涉及到的实验，操作过程如下
(1)组织蛋白提取 用剪刀切碎样品组织(如是微生物细胞，则离心后收获菌体)，然后用pH为7. 0 含O. l丽aCl的磷酸盐缓冲液充分洗涤并滤干，然后按每克组织10ml比例加裂解缓冲液 (0. 5mol/L醋酸，10mmol/L EDTA， 1. 0mmol/L PMSF， pH2. 8)，机械组织匀桨机匀桨，4。C下用 5000g离心10min，收集上清，然后超声处理(400W，超3秒，停2秒，共800秒)，纱布过滤， 调PH到中性，再用17000g离心15min，收集上清液，分装好，-7(TC保存备用。
(2)蛋白样品的胰蛋白酶(trypsin)消化 分离后样品透析除盐并浓縮，制成冻干样品。10 50ii g冻干样品重溶于还原溶 液(6Mguanidine hydrochloride, 50mM Tris-HCl，3mM DTT， pH8，30ii 1)，于60。C培育1小 时；还原完后加入1. 5 iil的1M iodoacetamide，在暗处室温烷基化处理30分钟；然后加入 270ul的50mM ammonium bicarbonate buffer (pH 8. 5)将盐浓度降低，遂力口入O. 5 5 u g 的活化胰蛋白酶(trypsin) ，37t:过夜。胰蛋白酶(trypsin)消化后的肽混和物冻干保存。
(3) LC-MS/MS分析
6
5 10 ii g重溶的胰蛋白酶消化肽混和物首先上样到Zorbax 300 SB-C18 p印tidetraps (Agilent Technologies, Wilmington, DE)脱盐；然后对肽混禾口物 在Zorbax300SB-C18反相毛细管层析柱(100践inner diameter X 15cm， Agilent Technologies)上进行反向层析分离，流速设定为500nl/min，先用4 50% B的直线梯度 (A :0.1% (v/v)formic acid ;B :84% (v/v)acetonitrile and 0.1% (v/v)formic acid) 洗50分钟，接着一个50 100% B梯度洗4分，100% B梯度维持10分。自动收集的峰在 线上样到Fi皿iganLTQ离子阱质谱仪(single li固r quadrupole ion tr即)进行肽鉴定。 收集一级和二级质谱数据，自动形成肽质谱文件。LC-MS/MS完成每个样品的肽质谱原始文 件，利用Sequest软件设定条件针对组织蛋白所属来源的蛋白数据库进行搜库，跟已知蛋 白序列理论多肽序列比对分析进行匹配，从而找出样品内可能具有的非冗余可信蛋白。为 了避免错误匹配，采用ISB/SPC Proteomics Tools-TPP V4. 2过滤错误匹配，肽的p值设定 为大于等于0. 9，蛋白置信度设定为95%以上。
(4)比较分析分组前后检出的蛋白数量 将亲和柱组合分组的所有组分检出的蛋白合并，并剔出掉重复部分，可以统计出 总共检出的蛋白数，并可以找出只在某一个组分里出现的蛋白。跟未分组的原始样品相比， 分组后检出蛋白数可以提高60 150%，分组后检出蛋白对原始样检出蛋白覆盖率高达 80 90%以上。只在特定组分出现的蛋白在总蛋白中占比40 80%。
实施例1 以环氧氯丙烷为骨架的亲和材料合成 取S印harose CL-4B (100克)用10倍体积的去离子水洗涤，抽干成湿饼状；然后 悬浮于50ml活化缓冲液(1M Na0H， 2. 5g硼氢化钠，10ml环氧氯丙烷)，在搅拌下6(TC恒温 反应2小时，等pH接近7. 0时停止反应，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽滤下用10倍体积 的蒸馏水洗涤，环氧氯丙烷活化的S印harose 4B分装于可密封的玻璃瓶中(20g/瓶)。
取各种氨基化合物0. 5g(见表1)溶解于25mL 0. 1M氢氧化钠/L 二氧六环中，分 别加入到盛有活化的S印harose 4B的瓶中，贴好标签，在搅拌下于6(TC反应24h。加入lmL 巯基乙醇，继续反应2小时，10倍体积的蒸馏水充分洗涤至pH中性，体积分数为20%的乙 醇中保存待用。这种方法用于合成单氨基化合物配体，按不同氨基化合物数字编号命名为 Am， m为氨基化合物数字编号。如，A6、 A84分别为用1， 6-己二胺和6-氨基己酸连接到活 化的S印harose 4B上构建而成的两种单氨基亲和配体。
表l亲和配体合成中使用的氨基化合物
氨基化合物 氨基化合物 3_amino_l_propanol acryl咖ide 3-methoxypropyl咖ine ethanol咖ine ethylenediamine 4_methyl_3_nitro￡iniline octylamine propylamine 1， 4-phenylenedi咖ine o—toluidine
2， 5-dichloroaniline 4， 4' 一thiodianiline
2， 4一dichloroaniline 2—aminobenzothiazole
4， 4一di咖inodiphenylmethane 4， 4' 一oxydianiline
p-toluidine2， 6-dimethylaniline2， 4， 6-trichloroaniline4， 4_methylene_bis(2-chloroaniline)m—toluidine4一aminobiphenyl2， 3-dichloroaniline4一aminobenzoic acidmethyl 2-aminobenzoate4， 4' -methylene-bis(2-methylaniline)m—anisidine4一膽ino3zobenzeneo-anisidine肌iline2， 4_diamino_6_methylphenol4_amino_2， 6-dinitrotoluenel一n即hthyl咖ineisopropylamine2， 4一di咖inotoluenebenzidine3'-咖inoacetophenone4_methyl_m_phenylenediamine2， 4-dimethylaniline4_i sopropylani1ine2， 4-dinitroanilinebenzylamine4'-咖inoacetophenone4_methyl_o_phenylenediamine2， 6-dichloroanilinep-anisidine2， 6-diethylanilineo—aminoazotoluene4一咖ino-2-nitropheno1l一膽ino-2-n即hthol-4一sulfonic acid2， 6-dinitroaniline2， 4_diaminoanisole2-aminopheno1o-dianisidine2-咖ino-3-nitropheno12-aminobenzimidazole2-咖inopyridine6-amino c即roic acid2-n即hthyl咖ine2-furfurylamine2_methoxy_5_methylani1ine5-aminoisophthalic acid2-nitroaniline4一phthalazinedione3-咖inopyridinecyclohexylamine2-methyl-3-nitroani1inel—aminoanthraquinone3-aminopheno14一aminosalicylic acid4一咖inopheno1arginine2-methyl-4一nitroani1ine2-aminoter印hthalic acid
3-nitroaniline9一aminoacridine
4一nitroanilinetryptamine
2-methyl-6-nitroani1ine3，3' -dichlorobenzidine实施例2以三氯三氮嗪为骨架的仿生配基的合成
100克环氧氯丙烷活化的S印harose CL 4B介质悬浮于350ml去离子水，然后加入150ml35% (v/v)氨水，在搅拌(200r/min)下30。C恒温12小时。NH厂S印haroseCL-4 B悬 浮在350ml50% (v/v)冰浴丙酮溶液中，随后将8g三氯三氮嗪溶于80ml _201:预冷丙酮， 快速加入介质悬浮液，用饱和NaHC03维持pH在6. 5 8. 0之间，O 4t:继续搅拌2小时 停止反应。
用3倍介质体积的丙酮，丙酮去离子水(体积比i : i)，去离子水，顺序洗涤反
应，得二氯三氮嗪_氨基-S印harose CL 4B ;称取20g 二氯三氮嗪-氨基-S印harose CL 4B，与溶解于一定量的蒸馏水中(20 50mL)5倍摩尔过量的氨基化合物(Rl)混匀，5(TC水 浴振荡24小时，反应过程中，用饱和NaHC03和lmol/L醋酸使溶液pH保持在7 7. 5之间， 10倍体积蒸馏水充分洗涤，抽干。然后与溶解于一定量蒸馏水(20 50mL)中的R2氨基 化合物(5倍摩尔过量)混合，95t:反应24小时，反应过程中，用饱和NaHC03和lmol/L醋酸使溶液PH保持在6 7之间。最后10倍体积的蒸馏水充分洗涤三次，抽干，体积分数为
20%的乙醇中保存待用。这种方法用于合成双氨基化合物配体，按不同氨基化合物数字编
号命名为Am-n， m、 n为氨基化合物Rl和R2的数字编号，如A7_56， All-70，和A29_32。各
化合物编号分别为7 (乙二胺)、56 (L-精氨酸)11 (对氨基苯脒盐酸盐)、70 (L-脯氨酸)、
29(间氨基酚)、32(间苯二胺)。 实施例3 蛋白吸附性能评价与挑选 对亲和分离材料库吸附蛋白性能进行评价，选择吸附蛋白种类占全蛋白20至 80%的亲和柱。 首先，将合成好的配体介质取1ml分别装填到层析柱中，写好标签，用15ml平衡缓 冲液(pH7. O，含0. 1M NaCl的lOmM磷酸盐缓冲液)充分洗涤平衡；然后取1 4mg组织蛋 白上样，柱上结合30分钟，用10 20ml平衡缓冲液洗去未结合蛋白(通过蛋白紫外检测仪 监控，直到基线平)；最后用3ml洗脱缓冲液(pH12，10mM Glycine-NaOH缓冲液)洗脱柱上 结合蛋白，立即调节pH中性。收集的各个配体结合的蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳分析，通 过电泳胶考马斯亮蓝染色的图谱比对分析，从条带分布就可以找出差异大的配体介质。通 过每个亲和介质吸附蛋白后的洗脱样品的LC-MS/MS质谱分析可以确定每个亲和介质吸附 的具体蛋白种类，从而比较这些亲和介质的蛋白吸附差异。
符合吸附蛋白种类占全蛋白20至80%的亲和柱有 A6， A84， A15分别为用环氧化学把编号化合物连接到层析基质的亲和分离材料；
Al-4， A7-56, A8_54， All_70， A25-35和A29-32,分别为两种编号的化合物通过三 氯三氮嗪骨架连接到层析基质的亲和分离材料。各化合物编号分别为1(丁胺)、4(十一 胺)、6(1,6-己二胺)、7(乙二胺)、8(苯胺)、11(对氨基苯脒盐酸盐)、15(色胺)、25(苄 胺)、29 (间氨基酚)、32 (间苯二胺)、35 (酪胺)、54 (氨基醋酸)、56 (L-精氨酸)、70 (L-脯 氨酸)、84(6-氨基己酸)； lmg人血清蛋白过Al-4、A6、A7-56、A8-54、All-70、A15、A25-35、A29-32和A84九根 亲和材料后，按上述条件得到的9份柱上结合蛋白样品分别trypsin消化，LC-MS/MS分析， Sequest搜库过滤鉴定的非冗余可信蛋白。Al-4、 A6、 A7_56、 A8_54、 All_70、 A15、 A25_35、 A29-32和A84九份柱上结合蛋白样品中鉴定的非冗余可信蛋白组数量分别为19、46、10、 25、41、27、17、38和44种，其中各柱专一吸附(不与其它重复)的蛋白数量分别为1、7、1、 1、12、1、2、6和6种，主要是低丰度蛋白。 2mg小鼠睾丸组织蛋白过Al-4、A6、A7-56、A8-54、All-70、A15、A25-35、A29-32和 A84九根亲和材料后，按上述条件得到的9份柱上结合蛋白样品分别trypsin消化，LC-MS/ MS分析，Sequest搜库过滤鉴定的非冗余可信蛋白。Al_4、 A6、 A7_56、 A8_54、 All_70、 A15、 A25-35、A29-32和A84九份柱上结合小鼠睾丸蛋白样品中鉴定的非冗余可信蛋白组数量分 别为111、173、120、196、93、151、287、106和86种，其中各柱专一吸附(不与其它重复)的 蛋白数量分别为H、34、23、30、16、20、78、12和17种，差异吸附效应明显。9柱总共鉴定的 535个非冗余小鼠睾丸可信蛋白中，各柱专一吸附蛋白数量为242(45.2%)，在2、3、4、5、6、 7、8和9柱中重复出现的蛋白数量分别为105、59、44、30、33、12、4和6种。
实施例4
串联分组1采用5种亲和配体介质A7-56，A84，A11-70，A6，和A29-32串联组合分析大鼠肝组 织细胞溶质部分(rat liver cytosol)全蛋白。串联分组工作流程如图IA所示。
步骤一，亲和层析柱的串联平衡 A7-56, A84， All_70， A6，和A29-32五根亲和配体介质各装填1ml到层析柱(低端 和顶端封好垫片)，5个层析柱首尾依次串联连接好。串联层析柱首先用30ml平衡缓冲液 (pH7. O，含0. 1M NaCl的lOmM磷酸盐缓冲液)充分洗涤平衡。 步骤二，柱上结合取4mg大鼠肝细胞溶质组织匀浆Fraction O，上样到串联柱， 柱上结合60分钟，用40ml平衡缓冲液洗去未结合蛋白，通过蛋白紫外检测仪监控直到基线 平，并接收流穿蛋白，定义为Fraction 6。 步骤三，洗脱把五根串联的层析介质柱分开，每根柱子单独用3ml洗脱缓冲液 (pH12，10mM Glycine-NaOH缓冲液)洗脱柱上结合蛋白，立即调节pH中性，5根柱子的洗脱 接收液分别定义为Fractionl-Fraction5。 步骤四，胰蛋白酶(trypsin)消化按标准实验程序分别消化原样和串联分配的 Fractionl-Fraction 6各组分。 步骤五，LC-MS/MS分析10 ii g重溶的原样(Fraction 0)和串联分配的六个组分 (Fraction 1 Fraction 6)肽混和物按标准实验程序肽分离、LC-MS/MS分析、搜库过滤分 析。 步骤六，比较分析分组前后检出的蛋白数量 将串联分组的6个组分检出的蛋白合并，并剔出掉重复部分，总共鉴定出665个大 鼠肝蛋白，而分组前的原始样品中只检出370个蛋白，分组后检出的蛋白数提高了80%，分 组后检出蛋白对原始样检出蛋白覆盖率高达80% (291个)。665个鉴定的大鼠肝蛋白中， 有430个蛋白只在特定组分出现而不与其它组分重复，在总蛋白中占比64. 7 % ，亲和配体 特异性得到充分展示。串联工作流程简单，不需要大型仪器设备，易于自动化，只需要2 3小时就可以完成串联分组工作，比传统的SDS-PAGE、两维电泳、两维液相色谱需要的时间 大大縮短丄C-MS/MS分析时，因为串联亲和柱组合分组对组织蛋白样品的简化，对多肽的分 离也只需要采用一维的C18反相分离。
实施例5
串联分组2 采用的组织材料为假单胞菌M18培养细胞蛋白提取液。采用的5个串联配体介质为A7-56，A84，All-70，A6，和A29-32。不同数字代表的
氨基化合物为7 (乙二胺)、56 (L-精氨酸)、84 (6-氨基己酸)、11 (对氨基苯脒盐酸盐)、
70 (L-脯氨酸)、6(1,6-己二胺)、29 (间氨基酚)、32 (间苯二胺)。 全蛋白分析的步骤 步骤一，亲和层析柱的串联平衡 A7-56, A84， All_70， A6，和A29-32五根亲和配体介质各装填lml到层析柱(低端 和顶端封好垫片)，5个层析柱首尾依次串联连接好。串联层析柱首先用30ml平衡缓冲液 (pH7. 0，含0. 1M NaCl的lOmM磷酸盐缓冲液)充分洗涤平衡。 步骤二，柱上结合取8mg假单胞菌M18培养细胞蛋白提取液，上样到亲和串联柱，
10柱上结合60分钟，用40ml平衡缓冲液洗去未结合蛋白(通过蛋白紫外检测仪监控，直到基 线平)，接收流穿蛋白，定义为Fraction 6。 步骤三，洗脱把五根串联的层析介质柱分开，每根柱子单独用3ml洗脱缓冲液 (pH12，10mM Glycine-NaOH缓冲液)洗脱柱上结合蛋白，立即调节pH中性，5根柱子的洗脱 接收液分别定义为Fractionl-Fraction 5。 步骤四，胰蛋白酶(trypsin)消化按标准实验程序分别消化原样和串联分配的 Fractionl-Fraction 6个组分。
步骤五，LC-MS/MS分析 10 g重溶的上步各组分trypsin消化产物分别按标准实验程序进行肽分离、 LC-MS/MS分析、搜库过滤分析。 步骤六，比较分析分组前后检出的蛋白数量 将假单胞菌M18培养细胞蛋白提取液串联分组的6个组分检出的蛋白合并，并剔 出掉重复部分，总共检出611个的假单胞菌蛋白，而未分组的原始样品只检出298个蛋白， 分组后检出蛋白数提高了 105%。只在特定组分出现的蛋白数为450(即组分之间不重复的 蛋白)，在总蛋白中占比73.6%，亲和配体特异性得到充分展示。
实施例6
级联分组l 采用的组织材料为大鼠肝组织细胞溶质部分(rat liver cytosol)，采用三层级 联组合方式进行亲和柱组合分组，然后胰蛋白酶消化、LC-MS/MS分析。采用的3个级联组 合的配体介质为A15， A8-54和All-70。不同数字代表的氨基化合物为15(色胺)、8(苯 胺)、54 (甘氨酸)、11 (对氨基苯脒盐酸盐)、70 (L-脯氨酸)；级联分组的工作流程如图1B。
全蛋白分析的步骤
步骤一，亲和层析柱的平衡 A15， A8-54和A11-70亲和配体介质各装填0. 4ml到层析柱(低端和顶端封好垫 片，A15装填1根，A8-54平行装填2根，All-70平行装填4根。每个层析柱首先用10ml平 衡缓冲液(PH 7. O，含0. 1M NaCl的lOmM磷酸盐缓冲液)充分洗涤平衡。
步骤二，第一级亲和分组取4mg大鼠肝组织细胞溶质组织提取液FO上样到A15 亲和柱，柱上结合30分钟，用10ml平衡缓冲液洗去未结合蛋白(通过蛋白紫外检测仪监 控，直到基线平)，接收流穿蛋白，流穿组份定义为F卜lt)然后用2ml洗脱缓冲液(pH12， 10mMGlycine-NaOH缓冲液)洗脱柱上结合蛋白，立即调节pH中性，洗脱组份定义为F卜2。此 步骤将原始样品一分二到两个不同的亚组份。 步骤三，第二级亲和分组第一层亲和柱组合分组的两个组份巳—^F卜2分别上样到 两根平衡好的A8-54亲和层析柱，柱上结合30分钟，用10ml平衡缓冲液洗去未结合蛋白 (通过蛋白紫外检测仪监控，直到基线平)，接收流穿蛋白，两个流穿组份分别定义为F2—工和 F2—3。然后用2ml洗脱缓冲液(pH12，10mM Glycine-NaOH缓冲液)洗脱柱上结合蛋白，立即 调节PH中性，两个洗脱组份分别定义为F2—2和F2—4。此步骤将上步样品二分四。
步骤四，第三级亲和分组第二层亲和柱组合分组的四个组份F2—pF2—2、F2—3、F2—4分 别上样到四根平衡好的All-70亲和层析柱，柱上结合30分钟，用10ml平衡缓冲液洗去未 结合蛋白(通过蛋白紫外检测仪监控，直到基线平)，接收流穿蛋白，四个流穿组份分别定义为F3—p F3—3、 F3—5、 F3—7。然后用2ml洗脱缓冲液(pH12， 10mM Glycine-NaOH缓冲液)洗脱 柱上结合蛋白，立即调节pH中性，四个洗脱组份分别定义为F3—2、F3—4、F3—6和F3—8。此步骤将 上步样品四分八。 步骤五，胰蛋白酶(trypsin)消化FO、 F卜!、 F!—2、 F2—!、 F2—2、 F2—3、 F2—4、 F3—!、 F3—2、 F3—3、 F3-4、 F3—5、 F3—6、 F3—7和F3—8 —共15个样品，通过透析除盐并浓縮处理，制成冻干样品。各取 50微克冻干样品重溶于还原溶液(6M guanidine hydrochloride, 50mMTris_HCl， 3mM DTT， pH8， 30 ill)，按标准实验程序分别消化。
步骤六，LC-MS/MS分析 上步消化好的F0、p F卜2、 F2—p F2—2、 F2—3、 F2—4、 F3—" F3—2、 F3—3、 F3—4、 F3—5、 F3—6、 F3—7和 F3—8 —共15个组分按标准实验程序肽分离、LC-MS/MS分析、搜库过滤分析。
步骤七，通过检出的蛋白数量的比较分析级联分组的效果 未分组的原始大鼠肝组织细胞溶质部分(rat liver cytosol) F0中，鉴定得到391 个非冗余的可信大鼠肝蛋白。第一级亲和层析得到的2个组分F卜工和F卜2中检出的蛋白合 并，并剔出掉重复部分，总共检出的蛋白数为499个，检出的蛋白数提高了 27.6%。第二级 亲和层析得到的的4个组分F2—p F2—2、 F2—3和F2—4中检出的蛋白合并，并剔出掉重复部分，总 共检出616个可信蛋白，跟未分组的FO相比提高了 57. 5% 。第三级亲和层析得到的的8个 组分F3—p F3—2、 F3—3、 F3—4、 F3—5、 F3—6、 F3—7和F3—8中检出的蛋白合并，并剔出掉重复部分，总共检 出的738个可信蛋白，跟未分组的FO相比提高了提高了 88. 75% 。通过逐级分配，鉴定的蛋 白逐渐增加，级联分组的效果是非常明显。最终通过三级联亲和分组共检出859个非冗余 的可信大鼠肝蛋白(蛋白组)，检出的蛋白数提高了 119.6%，也比现有文献报道的数量提 高1倍以上。未分组样品中检出的蛋白有93. 1% (364个)在级联分组后重现，一共检出 495个新蛋白。该方法利用不同配体的级联组合来分组大鼠肝组织细胞溶质部分组织蛋白 样品，工作流程简单，不需要大型仪器设备，易于自动化，只需要3 4小时就可以完成级联 分组工作，
实施例7
级联分组2 采用的组织材料为小鼠睾丸组织提取液，采用三层级联的组合方式进行亲和柱组
合分组，然后胰蛋白酶消化、LTQ-MS/MS分析。采用的3个级联组合的配体介质为A15， A8-54
和All-70。不同数字代表的氨基化合物为15 (色胺)、8 (苯胺)、54 (甘氨酸)、11 (对氨基
苯脒盐酸盐)、70(L-脯氨酸)。 全蛋白分析的步骤 步骤一，亲和层析柱的平衡 A15， A8-54和A11-70亲和配体介质各装填0. 4ml到层析柱(低端和顶端封好垫 片，A15装填1根，A8-54平行装填2根，All-70平行装填4根。每个层析柱首先用10ml平 衡缓冲液(PH 7. O，含0. 1M NaCl的lOmM磷酸盐缓冲液)充分洗涤平衡。
步骤二，第一级亲和分组取4mg小鼠睾丸组织提取液M0上样到A15亲和柱， 柱上结合30分钟，用10ml平衡缓冲液洗去未结合蛋白(通过蛋白紫外检测仪监控，直 到基线平)，接收流穿蛋白，流穿组份定义为M1-1。然后用2ml洗脱缓冲液(pH12，10mM Glycine-NaOH缓冲液)洗脱柱上结合蛋白，立即调节pH中性，洗脱组份定义为M卜2。此步
12骤将原始样品一分二到两个不同的亚组份。 步骤三，第二级亲和分组第一级亲和分组的两个组份M^p 2，分别上样到两根 平衡好的A8-54亲和层析柱，柱上结合30分钟，用10ml平衡缓冲液洗去未结合蛋白(通过 蛋白紫外检测仪监控，直到基线平)，接收流穿蛋白，两个流穿组份分别定义为M2—工和M2—3。 然后用2ml洗脱缓冲液(pH12，10mM Glycine-NaOH缓冲液)洗脱柱上结合蛋白，立即调节 pH中性，两个洗脱组份分别定义为M2—2和M2—4。此步骤将上步样品二分四。
步骤四，第三级亲和分组第二级亲和分组的四个组份M^pM2—2、M2—3和M^4，分别上 样到四根平衡好的All-70亲和层析柱，柱上结合30分钟，用10ml平衡缓冲液洗去未结合 蛋白(通过蛋白紫外检测仪监控，直到基线平)，接收流穿蛋白，四个流穿组份分别定义为 Mh、 M3—3、 M3—5、 M3—7。然后用2ml洗脱缓冲液(pH12， 10mM Glycine-NaOH缓冲液)洗脱柱上 结合蛋白，立即调节pH中性，四个洗脱组份分别定义为M3—2、M3—4、M3—6和M3—8。 MO最终通过三 级联分配成M3—p M3—2、 M3—3、 M3—4、 M3—5、 M3—6、 M3—7和M3—8八个亚分配组分。 步骤五，胰蛋白酶(trypsin)消化收集样品MO、 M3—^ M3—2、 M3—3、 M3—4、 M3—5、 M3—6、 M3—7 和M3—8按标准实验程序消化。
步骤六，LC-MS/MS分析 上步消化处理好的MO、 M3—p M3—2、 M3—3、 M3—4、 M3—5、 M3—6、 M3—7和M3—8各10 ii g按标准实
验程序肽分离、LC-MS/MS分析、搜库过滤分析。 步骤七，通过检出的蛋白数量的比较分析级联分组的效果 未分组的原始小鼠睾丸组织M0中鉴定到526个非冗余的可信蛋白。M3—"M^2、M3—3、 M3—4、M3—5、M3—6、M3—7和M3—8八个组分检出的蛋白合并，并剔出掉重复部分，总共检出1378个非 冗余的小鼠睾丸蛋白，跟MO相比提高了 162%，比以前文献报道的最大检出数量也提高将 近173. 4%。 步骤八，本实施例建立的小鼠睾丸组织蛋白数据库特性分析 采用三层级联亲和分组与质谱基于的蛋白组学分析建立了目前为止，最大的小 鼠睾丸蛋白数据库(1378个蛋白)。在该数据库中，鉴定的尺寸最小蛋白只有817Da，而 鉴定的最大分子量蛋白高达630. 35kDa，有12个(0. 87 % )鉴定蛋白分子量< 10kDa， 169(12. 26% )个鉴定蛋白分子量> lOOkDa，这都超出了现有小鼠睾丸蛋白组学研究中获 得极端尺寸蛋白的极限。同时也鉴定得到38个蛋白(2.76%)的pl <4.5，51个蛋白 (3. 7% )的pl > 10，突破传统2D-PAGE方法的极限。没有通过特别的富集和处理方法，在小 鼠睾丸级联亲和分配组分中还鉴定到93个(6. 82% )疏水蛋白(GRAVY value > 0)，鉴定到 81个蛋白(5.88%)有1个或多个预测的TM domains。鉴定的小鼠睾丸组织蛋白有707个 集中分布于细胞溶质、线粒体、细胞核和细胞膜四个主要的亚细胞器，占比66. 2%。级联亲 和分配鉴定的1378个小鼠睾丸蛋白中，有1157个蛋白(83.96%)在Uniprot数据库有GO 分子功能分类定义，其中481个蛋白(41. 57% )为各种催化活性的酶或酶亚基(包括氧化 还原酶、转化酶、脂酶、水解酶、多聚酶、裂解酶、异构酶等)，占比最大。其它功能蛋白包括分 子伴侣、核糖体蛋白、翻译和转录因子、电子载体、核酸结合蛋白、金属离子结合蛋白、酶调 节活性蛋白、发育蛋白、运输蛋白、马达蛋白和结构分子蛋白等。由于睾丸是生精的组织和 场所，我们对级联亲和分配中鉴定的1378个小鼠睾丸蛋白的功能分析找出了与生精及精 子发育相关的蛋白(IPI00118122， IPI00118783， IPI00118851， IPI00121394， IPI00123400，IPI00125705, IPI00127379, IPI00127431, IPI00131034, IPI00133708, IPI00227900, IPI00380504, IPI00406492, IPI00461359,IPI00138866, IPI00223935)。
权利要求
一种利用亲和柱分析全蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，合成亲和分离材料，得到亲和分离材料库；步骤二，提取生物样品全蛋白，从步骤一所得的亲和分离材料库中筛选出吸附蛋白种类占全蛋白20～80％的亲和材料组合；步骤三，从步骤二所得亲和材料组合中选择一种或多种分别填充亲和柱，之后利用所得亲和柱，采用级联组合分析方法、串联组合分析方法、或者级联与串联混合的组合分析方法分析生物样品全蛋白，得到多组蛋白复杂度简化的样品；步骤四，对步骤三所得样品分别进行胰蛋白酶消化和LC-MS/MS分析，进而完成生物样品全蛋白的全蛋白分析。
2. 根据权利要求l所述的利用亲和柱分析全蛋白的方法，其特征是，步骤一中，所述 亲和分离材料库具体为以如下组合中的氨基化合物为配体，采用以环氧氯丙烷为骨架的 单氨基化合物配体合成法合成相应的亲和分离材料；以如下组合中的氨基化合物为配体， 采用以三氯三氮嗪为骨架的双氨基化合物配体合成法合成相应的亲和分离材料；所有合成 的亲和分离材料构成亲和分离材料库；所述氨基化合物的组合为3-amino-l-propano1、 2—phenethylamine、 acrylamide、3， 5—dinitroaniline、3—methoxypropylamine、 2_methyl_5_nitroaniline、 ethanolamine、 2， 4一dichloroaniline、 ethylenediamine、 2_aminobenzothiazole、4_methyl_3_nitroaniline、3_methyl_o_phenylenediamine、 octylamine、2，5-dichloroaniline、 propyl amine、4，4' -thiodianiline、1， 4-phenylenediamine、4， 4-diaminodiphenylmethane、 o-toluidine、4， 4' -oxydianiline、 p-toluidine、2， 6-dimethylaniline、2， 4， 6_trichloroaniline、4， 4_methylene_bis (2_c hloroaniline) 、 m_toluidine、4_aminobiphenyl、2， 3_dichloroaniline、4_aminobenzoic acid、 methyl 2—aminobenzoate4， 4' -methylene-bis (2-methylani 1 ine) 、 m_anisidine、4_aminoazobenzene、 o-anisidine、 aniline、2， 4_diamino_6_methylphenol、4_amino_2， 6_dinitrotoluene、l_naphthylamine、 isopropylamine、2，4—diaminotoluene、 benzidine、3' _aminoacetophenone、4_methyl_m_phenylenediamine、2， 4_dimethylaniline、4_isopropylaniline、2， 4一dinitroani1ine、 benzylamine、 4' -aminoacetophenone、4_methyl_o_phenylenediamine、2，6_dichloroaniline、 p_anisidine、2， 6_diethylaniline、 o_aminoazotoluene、4_amino_2_nitrophenol、 l_amino_2_naphthol_4_sulfonic acid、2， 6-dinitroaniline、2， 4一diaminoanisole、 2_aminophenol、 o_dianisidine、2_amino_3_nitrophenol、2_aminobenzimidazole、 2-aminopyridine、6—amino caproic acid、2_naphthylamine、2_furfurylamine、2_methoxy_5_methylani1ine 、 5_aminoi sophthaiic acid、2_nitroaniline、 4_phthalazinedione、3_aminopyridine、 cyclohexylamine、2_methyl_3_nitroaniline、l_aminoanthraquinone、3_aminophenol、 4一aminosalicylic acid、4_aminophenol、 arginine、2_methyl_4_nitroaniline、2_aminoterephthalic acid、3—nitroaniline、 9_aminoacridine、4_nitroaniline、 tryptamine、2_methyl_6_nitroaniline禾卩3，3' -dichlorobenzidine。
3. 根据权利要求2所述的利用亲和柱分析全蛋白的方法，其特征是，步骤三中，所述亲和分离材料组合具体为分别以1，6-己二胺、色胺和6-氨基己酸为配体，采用以环氧氯丙烷为骨架的单氨基化合物配体合成法合成的相应的亲和分析材料；分别以丁胺和十一胺、乙二胺和L-精氨酸、苯胺和氨基醋酸、对氨基苯脒盐酸盐和L-脯氨酸、苄胺和酪胺、以及间氨基酚和间苯二胺为配体，采用以三氯三氮嗪为骨架的双氨基化合物配体合成法合成的相应的亲和分离材料；上述得到的9种亲和材料组成亲和分离材料组合。
4. 根据权利要求1所述的利用亲和柱分析全蛋白的方法，其特征是，步骤三中，所述级联组合分析方法具体为取生物样品全蛋白，通过第一根亲和柱吸附洗脱，得到流穿和洗脱两组样品；将流穿和洗脱两组样品分别通过第二根亲和柱，各自再次得到流穿和洗脱两组样品，此时共有四组样品；依次类推，当通过第n根亲和柱后，共得到2n组样品；所述n为> 2的自然数。
5. 根据权利要求4所述的利用亲和柱分析全蛋白的方法，其特征是，所述n为> 3的自然数。
6. 根据权利要求l所述的利用亲和柱分析全蛋白的方法，其特征是，步骤三中，所述串联组合分析方法具体为取生物样品全蛋白，通过第一根亲和柱吸附洗脱，得到流穿和洗脱两组样品；流穿组样品通过第二根亲和柱吸附洗脱，得到流穿和洗脱两组样品，共三组样品；依次类推，将每一次得到的流穿组样品再次通过亲和柱吸附洗脱，得到与之相应的流穿和洗脱两组样品，在通过第m根亲和柱后，共得到m+l组样品；所述m为> 3的自然数。
7. 根据权利要求6所述的利用亲和柱分析全蛋白的方法，其特征是，所述m为> 5的自然数。
全文摘要
一种蛋白质组技术领域的利用亲和柱分析全蛋白的方法，包括如下步骤合成亲和分离材料，得到亲和分离材料库；提取生物样品全蛋白，从步骤一所得的亲和分离材料库中筛选出吸附蛋白种类占全蛋白20～80％的亲和材料组合；从步骤二所得亲和材料组合中选择一种或多种分别填充亲和柱，之后利用所得亲和柱，采用级联组合分析方法、串联组合分析方法、或者级联与串联混合的组合分析方法分析生物样品全蛋白，得到多组蛋白复杂度简化的样品；对步骤三所得样品分别进行胰蛋白酶消化和LC-MS/MS分析，进而完成生物样品全蛋白的全蛋白分析。本发明的方法可克服高丰度蛋白淹没低丰度蛋白信号的技术不足，提高极端性质蛋白检出率。
文档编号G01N30/00GK101694485SQ20091030779
公开日2010年4月14日 申请日期2009年9月27日 优先权日2009年9月27日
发明者李荣秀, 谭青乔 申请人:上海交通大学;