专利名称：刺参糖胺聚糖在细胞水平抗乙肝病毒上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种刺参糖胺聚糖的新用途，具体的说是将刺参糖胺聚糖用于在细胞水平抗乙肝病毒。属于生物天然活性物质的应用领域。
背景技术：
慢性乙型肝炎是全球面临的一个严峻的健康问题，中国、东南亚及非洲是HBV感染的高发区，同时这些地区HBV相关性肝病如原发性肝癌的发生率也显著高于美洲中部和南部等HBV感染的低发区。慢性乙型肝炎治疗主要包括抗病毒、免疫调节、抗炎保肝、抗纤维化以及对症治疗，其中进行有效抗病毒治疗，持久抑制HBV DNA于PCR可检测范围以下是治疗的关键。硫酸多糖无论在体内还是在体外，都显示了不同程度的抗病毒、抗肿瘤和对免疫系统的调节作用。研究表明，硫酸多糖和其他聚阴离子物质可干扰反转录病毒及其他病毒的吸附和侵入，有些表现出对各种反转录病毒的逆转录酶的抑制活性。硫酸多糖的抗病毒活性首先源于其聚阴离子特性，聚阴离子特性则主要源于其分子中的硫酸基。
刺参(stichopus japonicus selenka)又称仿刺参，属棘皮动物门海参纲楯手目刺参科仿刺参属，具有较高的食用价值和养生保健作用，近年来，刺参的药用价值日益受到重视。刺参糖胺聚糖是从刺参体壁中提取的一种硫酸化多糖，是多糖大分子链中单糖分子上的某羟基被硫酸根所取代而形成的一类多功能生理活性物质。是一种由D-N-乙酰氨基半乳糖、D-葡萄糖醛酸和L-岩藻糖组成的分支杂多糖，其分子上含有丰富的硫酸酯基，属于酸性粘多糖；氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、硫酸酯基的分子比约为1∶1∶1∶4。对刺参糖胺聚糖活性的研究集中在抗肿瘤和抗血栓活性方面，对其抗病毒活性研究甚少。
目前慢性乙型肝炎尚缺乏理想的治疗手段，干扰素(interferon，IFN)是治疗慢性乙型肝炎的首选药物，但须每周皮下注射，副作用大，复发率高，且价格相对昂贵，限制了临床广泛应用。核苷(酸)类似物如拉米夫定(lamivudine)、阿德福韦(Adefovir)、恩替卡韦(Entecavir)、替比夫定(telbivudine)等疗程长，随着用药时间的延长患者发生病毒耐药变异的比例增高，且存在交叉耐药。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题是，提供一种刺参糖胺聚糖的用途，将刺参糖胺聚糖用于在细胞水平抗乙肝病毒，以便提供一种新的抗乙肝病毒活性物质。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是，将刺参糖胺聚糖用于在细胞水平抗乙肝病毒。
其具体方式为将刺参糖胺聚糖用于对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg表达以及HBV DNA复制的抑制；其包括下列内容 1、培养HepG2.2.15细胞作为体外HBV慢性感染模型。HepG2.2.15细胞系是由含两个头尾相连的adw型HBV全基因质粒转染人肝肿瘤细胞系(HepG2)构建而成，体外培养能转录、翻译HBV基因，持续较高水平表达HBsAg、HBeAg以及有生物活性的完整的Dane颗粒，其具有稳定性及类似于体内HBV复制过程等优点。
2、用不同浓度的刺参糖胺聚糖作用于HepG2.2.15细胞，用线粒体MTT转化法检测刺参糖胺聚糖的细胞毒性，绘制生长曲线。其为连续10天检测细胞生长状态，并以时间(天)为横坐标，吸光度值A为纵坐标，绘制生长曲线。该方法比较客观，操作简便，可间接反映活细胞的数量。药物对细胞的毒性越大，存活的细胞数就会越少，MTT被代谢旺盛的活细胞线粒体脱氢酶还原成的蓝紫色甲臜结晶就越少，甲臜被溶解后所测得的光密度值就越小，说明细胞存活率低。
3、根据细胞生长曲线，用线粒体MTT转化法检测刺参糖胺聚糖的细胞毒性，确定最大无毒浓度为1.0mg/ml，刺参糖胺聚糖在4mg/ml浓度以下，对HepG2.2.15细胞毒性较低，浓度为8mg/ml时对HepG2.2.15细胞的毒性较强。
4、用酶联免疫吸附法(ELISA)检测刺参糖胺聚糖对HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用，确定刺参糖胺聚糖对HBsA g、HBeAg的分泌有明显的抑制作用的浓度为2mg/ml，并随时间和浓度增强呈现量效和时效反应关系。
5、用荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测刺参糖胺聚糖对HepG2.2.15细胞HBV DNA复制的抑制作用，确定在病毒复制水平抑制了HBVDNA的合成，且呈现量效和时效反应关系。
发明人用不同浓度的刺参糖胺聚糖作用于HepG2.2.15细胞进行动态研究，刺参糖胺聚糖在4mg/ml浓度以下，对HepG2.2.15细胞毒性较低；浓度为8mg/ml时对HepG2.2.15细胞的毒性较强；2mg/ml时对HBsAg、HBeAg的分泌已有明显的抑制作用，并随时间和浓度增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系；治疗指数TI＞2表明刺参糖胺聚糖可有效低毒的抗HBV。发明人采用实时荧光定量PCR法检测刺参糖胺聚糖在作用HepG2.2.15细胞72h和144h后上清液中HBV DNA的含量，结果表明，刺参糖胺聚糖对HBV DNA具有显著的抑制作用，即在病毒复制水平抑制了HBV的合成，且呈现一个明显的量效和时效反应关系。由于在最大无毒浓度下刺参糖胺聚糖可显著降低培养上清中的HBV DNA水平，说明药物的细胞毒性对细胞外HBV DNA水平的影响很�。瘟浦甘齌I＞2，表明刺参糖胺聚糖在体外具有明显地抗HBV作用，为有效低毒的抗HBV药物。
本发明提供了刺参糖胺聚糖的一种新用途，将刺参糖胺聚糖用于在细胞水平抗乙肝病毒，为人们提供了一种新的抗乙肝病毒活性物质。
本发明所涉及的材料中DMEM培养基为美国Gibco公司产品；胎牛血清为杭州四季青公司产品；青霉素、链霉素为华北制药厂产品；G418(genticin)为美国Gibco公司产品；胰蛋白酶，MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐]，二甲基亚砜(DMSO)均为北京中昊时代生物技术中心产品。
本发明所涉及的仪器中，HBsAg和HBeAg酶联免疫检测试剂盒为上�？苹锛际跤邢薰静罚灰倚透窝撞《竞怂崂┰鲇舛考觳馐约梁形猩酱笱О泊锘蚬煞萦邢薰静�。
下面结合附图及其具体的实施例对本发明进一步洋细说明。
图1是本发明实施例的HepG2.2.15细胞生长曲线。
具体实施例方式 下面是将刺参糖胺聚糖用于在细胞水平抗乙肝病毒的实施例。
实施例1 培养HepG2.2.15细胞作为体外HBV慢性感染模型。
用青岛大学医学院微生物学教研室提供的HepG2.2.15细胞系，采用含10％胎牛血清、青霉素100IU/ml及链霉素100μg/ml、G418380μg/ml的DMEM培养基，37℃、5％CO2条件下培养。
实施例2 绘制HepG2.2.15细胞生长曲线。
由培养的HepG2.2.15细胞制备1×104个/ml单细胞悬液，接种于96孔板，每孔150μl，37℃、5％CO2、95％湿度连续培养10天，每日定时用MTT法测3个孔的吸光度值。方法为每孔加入MTT 20μl，用铝箔包裹96孔板，37℃继续培养4h，吸去上清，每孔加DMSO 150μl裂解细胞，充分混匀后分别将待测孔溶液转移至另一96孔新板中，用酶标仪测定A值，检测波长570nm，参考波长630nm。以时间为横坐标，吸光度值A为纵坐标，绘制图1所示生长曲线。
如图1所示，细胞接种后1-3天处于传代后的生长潜伏期，其活力尚未恢复，不适于进行药物干预。3-9天细胞处于对数生长期，活力恢复，是进行药物干预的最佳时间段。因此，本实施例选择细胞接种后3天和6天分别进行一次药物干预。9-10天细胞生长进入平台期，镜下观察细胞贴壁面积约占孔底面积的95％。
实施例3 检测刺参糖胺聚糖的细胞毒性。
按实施例2的方法接种HepG2.2.15细胞，根据图1所示细胞生长曲线，分别于接种后3天和6天用刺参糖胺聚糖进行一次药物干预。药物浓度分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、4.0mg/ml和8.0mg/ml，每浓度3个复孔，以等量的完全培养液为空白对照。每3天换新鲜含药培养液，共2次，并观察细胞形态，原细胞培养上清液分装于0.5ml EP管中，保存于-20℃，用于药物对HBsAg、HBeAg分泌抑制的检测。第9天换不含药物的培养液，用MTT法测各孔的吸光度值，定期观察细胞状态。检测结果以细胞抑制百分率表示，使浓度-效应关系标准化，用于计算刺参糖胺聚糖的半数有毒浓度CC50。其中 细胞抑制百分率＝[(细胞对照A值-药物作用组A值)/细胞对照A值]×100％； CC50＝Antilog[B+(50-＜50％抑制百分率)÷(＞50％抑制百分率-＜50％抑制百分率)×C]， 式中C＝A-B，A＝log(＞50％药物浓度)，B＝log(＜50％药物浓度)； 一般用治疗指数TI评价药物的临床应用前景， 治疗指数TI＝半数有毒浓度CC50/半数抑制浓度IC50， IC50为药物对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg分泌的半数抑制浓度； TI＞2为有效低毒，1＜TI＜2为低效低毒，TI＜1为毒性作用。
刺参糖胺聚糖的细胞毒性实验结果见表1。如表1所示，不同浓度的刺参糖胺聚糖对HepG 2.2.15细胞均有毒性作用，随着药物浓度增高及作用时间延长，毒性作用逐渐增强，呈现明显的量效和时效反应关系。刺参糖胺聚糖作用6天后对HepG2.2.15细胞的CC50为4.97mg/ml。1.0mg/ml组与对照组A值无统计学差异，确定1.0mg/ml为最大无毒浓度。
表1刺参糖胺聚糖对HepG2.2.15细胞的细胞毒性(n＝3)
其中与细胞对照组比较，aP＜0.01，bP＞0.05。
实施例4 刺参糖胺聚糖对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响。
采用酶联免疫吸附法(ELI SA)检测刺参糖胺聚糖细胞毒性试验中所收集样本中的HBsAg和HBeAg。同时设HBsAg、HBeAg阳性、阴性对照组和空白对照。严格按照试剂盒说明书进行操作，检测波长450nm，参考波长490nm。检测结果以吸光度值表示，并计算药物对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeA分泌的半数抑制浓度IC50，方法同CC50。结果见表2和表3。
表2刺参糖胺聚糖对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制效果(n＝3)
其中与细胞对照组比较，aP＜0.01。
从表2和3可见，刺参糖胺聚糖对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的表达分泌均有抑制作用，并且随着药物浓度增加，抑制率逐渐增高；随着药物作用时间的延长，抑制率也逐渐增高。作用6天时IC50分别为1.69、1.85mg/ml，治疗指数分别为2.94、2.69。
表3刺参糖胺聚糖对HepG2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制效果(n＝3)
其中与细胞对照组比较，aP＜0.01。
实施例5 刺参糖胺聚糖对HepG2.2.15细胞HBV DNA复制的抑制作用。
用荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测HBV DNA。将2×104/ml的单细胞悬液加入24孔细胞培养板，每孔1ml，37℃、5％CO2条件下置CO2培养箱中培养72h后，吸除全部培养液。根据细胞毒性试验结果，将刺参糖胺聚糖溶液2倍系列稀释成2.0、1.0、0.5、0.25和0.125mg/ml5个终浓度，每个浓度设3个复孔，以等量的完全培养液作为空白对照。连续培养72h后，分别吸出上清液于1.5ml灭菌EP管中，-20℃保存。再次加入上述含不同浓度药物的培养液继续培养72h后，分别吸出上清液于1.5ml灭菌EP管中，-20℃保存。
按照乙型肝炎病毒HBV核酸扩增PCR荧光定量检测试剂盒使用说明书提取培养上清液中的HBV DNA，将各反应管放入荧光定量PCR仪，按以下条件进行扩增93℃预变性2min；93℃变性5s；57℃退火、延伸45s，共反应40个循环。扩增过程及荧光信号检查、数据的储存和分析均由仪器及自带的软件自动完成。结果见表4。
如表4所示，HepG2.2.15细胞经不同浓度刺参糖胺聚糖作用72h和144h后，用实时荧光定量PCR法检测培养上清液中HBV DNA的含量。与空白对照组相比较，刺参糖胺聚糖在0.125mg/ml至最大无毒浓度1.0mg/ml作用72h和144h后，对HepG2.2.15细胞HBV DNA具有显著的抑制作用，均可使HepG2.2.15细胞上清液中HBV DNA的拷贝数降低，且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系。刺参糖胺聚糖在最大无毒浓度1.0mg/ml时抑制率分别为59.34％，63.64％。按作用144h后的抑制率计算刺参糖胺聚糖的半数有效浓度EC50为0.32mg/ml，治疗指数为15.53。
表4刺参糖胺聚糖对HepG2.2.15细胞上清液中HBV DNA的抑制作用(x±s×105，n＝3)
其中与空白对照组比较aP＜0.05，bP＜0.01。
由以上各实施例的结果可知，用不同浓度的刺参糖胺聚糖作用于HepG2.2.15细胞，刺参糖胺聚糖在4mg/ml浓度以下，对HepG2.2.15细胞毒性较低；浓度为8mg/ml时对HepG2.2.15细胞的毒性较强；2mg/ml时对HBsAg、HBeAg的分泌已有明显的抑制作用，并随时间和浓度增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系；治疗指数TI＞2，提示刺参糖胺聚糖可作为一种有效低毒的抗HBV新药。用实时荧光定量PCR法检测刺参糖胺聚糖在作用HepG2.2.15细胞72h和144后上清液中HBV DNA的含量，结果表明，刺参糖胺聚糖对HBV DNA具有显著的抑制作用，即在病毒复制水平抑制了HBV的合成，且呈现一个明显的量效和时效反应关系。由于在最大无毒浓度下刺参糖胺聚糖可显著降低培养上清中的HBV DNA水平，说明药物的细胞毒性对细胞外HBV DNA水平的影响很�。瘟浦甘齌I＞2，提示刺参糖胺聚糖在体外具有明显地抗HBV作用，为有效低毒的抗HBV药物。
权利要求
1.刺参糖胺聚糖在细胞水平抗乙肝病毒上的应用。
2.刺参糖胺聚糖用于在病毒复制水平抑制HBVDNA的合成。
3.刺参糖胺聚糖在细胞水平抗乙肝病毒上的应用的具体方式为将刺参糖胺聚糖用于对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg表达以及HBV DNA复制的抑制；其包括下列内容
a、培养HepG2.2.15细胞作为体外HBV慢性感染模型；
b、用不同浓度的刺参糖胺聚糖作用于HepG2.2.15细胞，用线粒体MTT转化法检测刺参糖胺聚糖的细胞毒性，绘制细胞生长曲线；
c、根据细胞生长曲线，用线粒体MTT转化法检测刺参糖胺聚糖的细胞毒性，确定最大无毒浓度为1.0mg/ml，刺参糖胺聚糖在4mg/ml浓度以下，对HepG2.2.15细胞毒性较低，浓度为8mg/ml时对HepG2.2.15细胞的毒性较强；
d、用酶联免疫吸附法检测刺参糖胺聚糖对HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用，确定刺参糖胺聚糖对HBsAg、HBeAg的分泌有明显的抑制作用的浓度为2mg/ml，并随时间和浓度增强呈现量效和时效反应关系；
e、用荧光定量PCR法检测刺参糖胺聚糖对HepG2.2.15细胞HBV DNA复制的抑制作用，确定在病毒复制水平抑制HBVDNA的合成，且呈现量效和时效反应关系。
全文摘要
本发明公开了刺参糖胺聚糖在细胞水平抗乙肝病毒上的应用，应用的具体方式为将刺参糖胺聚糖用于对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg表达以及HBV DNA复制的抑制。本发明提供了刺参糖胺聚糖的一种新用途，将刺参糖胺聚糖用于在细胞水平抗乙肝病毒，为人们提供了一种新的抗乙肝病毒活性物质。
文档编号G01N33/576GK101816676SQ20101011284
公开日2010年9月1日 申请日期2010年2月12日 优先权日2010年2月12日
发明者宣世英, 辛永宁, 战淑慧 申请人:青岛市市立医院
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