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专利名称：一种Ⅳ型胶原酶含量测定方法
技术领域：
本发明涉及一种测定人体血浆、血清中IV型胶原酶含量的测定方法。
背景技术：
IV型胶原酶是生物体内重要的基质金属蛋白酶，又称基底膜性胶原酶，在细胞迁移、创伤修复、恶性肿瘤的浸润与转移等过程中发挥重要的病理生理作用。目前研究表明， 血浆IV型胶原酶含量的异常增高常与心脏衰竭、肺气肿、自身免疫性疾病、肿瘤生长及肿瘤细胞的侵袭和转移等重大疾病密切相关。为了更广泛的研究IV型胶原酶的病理生理作用， 建立快捷、精确、低成本、高通量的检测方法具有重要意义。
目前检测血浆IV型胶原酶活性的方法主要有3种底物胶电泳酶谱法、ELISA和 HPLC。底物胶电泳酶谱法分析时间长达数天，分析步骤复杂。ELISA法虽具有特异性、灵敏度高的优势，但所需标记抗体成本高，试剂盒昂贵，测定出的酶含量不能表现出酶的生物学活性，同时分析速度慢。HPLC虽具有分析速度快，定量准确等优点，但方法特异性差，不能进行大样本同时检测，难以满足临床检测要求。

发明内容
本发明的目的是解决上述问题而提供了一种IV型胶原酶含量测定方法，利用该方法可以准确、快速的测定到人体血浆或血清中IV型胶原酶的含量。
本发明所采用的技术方案是
一种IV型胶原酶含量测定方法，包括以下步骤
a)分别准备空白管、标准管和待测样品管；首先向空白管、标准管和待测样品加入底物溶液，所述底物溶液为5mg/ml 10mg/ml琥珀酰明胶；接着向空白管中加入样品稀释液，向标准管中加入标准品，向待测样品管中加入待测样品，所述样品稀释液为体积百分比为 40mmol/l 60mmol/lTris 缓冲液、5mmol/l 15mmol/lCaCl2、10 μ mol/1 20ymol/ IZnCl2以及质量百分数为0. 05% 0. 1%月桂醇聚氧乙烯醚混合而成，所述标准品为已知浓度的IV型胶原酶；最后向标准管和待测样品管中加入样品稀释液，在35°C 45°C水浴反应 30 120分钟；
b)在空白管、标准管和待测样品管中加入终止液终止酶切反应，再加入检测溶液A和检测溶液B，最后加入检测稀释液，在35°C 45°C水浴下显色反应30 60分钟，使其显色反应充分进行，所述终止液为质量百分数为0. 05% 0. 2%HCL,检测溶液A为0. IM 0. 5MNaOH,检测溶液B为质量百分数为0. 01% 0. 05%三硝基苯磺酸，检测稀释液为双蒸水；
c)各管冷却至室温后，取各管溶液至酶标板中，用酶标仪测定吸光度；
d)以标准物的浓度为横坐标，测定出的吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线，根据待测样品的吸光度值在标准曲线上查出相应的待测样品的IV型胶原酶含量；或者用标准物的浓度与吸光度值算出标准曲线的方程，将待测样品的吸光度值代入方程，计算出待测样品的IV型胶原酶含量。
优选地，所述标准管的数量至少为六个。
进一步地，所述待测样品为血清或血浆。
优选地，所述酶标仪在400nm 440nm处测定吸光度。
本发明具有以下优点
本发明利用IV型胶原酶具有水解明胶的特异性结合位点，而血浆中存在的其它基质金属蛋白酶难以水解明胶，采用TNBS对明胶的水解产物进行显色，可以对人体血浆和血清中的IV型胶原酶进行特异性的定量分析。该测定方法以琥珀酰明胶作为酶切底物，采用TNBS 显色剂对酶切产生的末端氨基显色，TNBS与末端氨基结合的情况下颜色变黄，颜色的深浅和样品中的IV型胶原酶含量呈正相关。用酶标仪在特定波长下测定吸光度，计算样品浓度。 本方法可以快速、准确的测定出人体血浆或血清中IV型胶原酶的含量，且测量结果直接体现出血浆当中具有活性意义的IV型胶原酶含量，无需再进一步检测抑制物的含量。


图1为实施例1 IV型胶原酶的标准曲线； 图2为健康人血浆IV型胶原酶含量分布图。
具体实施例方式实施例1 本实施例来测定一个血清样本的IV型胶原酶含量。首先对待测血样进行处理，将全血标本2500转离心5分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20°c或-80°c保存，但应避免反复冻融。需要注意的是血清在检测前应稀释8倍再做检测，在置4°C保存应小于1周，-20 V或-80 V均应密封保存，-20 V或-80 V不应超过1个月，标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
接着开始对血清样本进行的IV型胶原酶含量进行测定，在测定前请提前配制好所有试剂。试剂或样品稀释时，均需混勻，混勻时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。 如样品浓度过高时，均应用样品稀释液进行稀释，以使样品符合测定方法的检测范围。
第一步分别准备空白管一个、标准管六个和待测样品管一个，向空白管、标准管和待测样品加入15 μ 1底物溶液，底物溶液为8mg/ml的琥珀酰明胶；向空白管中加入 185ul样品稀释液，向标准管中加入20ul标准品，向待测样品管中加入20ul待测样品；样品稀释液为体积百分比为50mmol/lTris缓冲液、10mmol/lCaCl2、100 μ mol/lZnCl2以及质量百分数为0. 05%月桂醇聚氧乙烯醚混合而成，标准品为已知浓度的IV型胶原酶，临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为 10mg/ml，做系列稀释后，分别稀释成 1. 5mg/L、3mg/L、5mg/L、7mg/L、8. 5mg/L、10mg/L，样品稀释液直接作为标准浓度，临用前15分钟内配制；向标准管和待测样品管中加入165ul 样品稀释液，在37°C水浴反应30分钟；为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。第二步在空白管、标准管和待测样品管中加入20 μ 1终止液终止酶切反应，再加入20 μ 1检测溶液A和20 μ 1检测溶液B，最后加入140 μ 1检测稀释液，在40°C水浴下显色反应30分钟，使其显色反应充分进行；终止液为质量百分数为0. 1%HCL,检测溶液A为 0. 2MNa0H，检测溶液B为质量百分数为0. 025%三硝基苯磺酸，检测稀释液为双蒸水。第三步各管冷却至室温后，取各管溶液取150μ 1至酶标板中，用酶标仪在405nm处测定吸光度。第四步以标准物的浓度为横坐标(X坐标)，测定出的吸光度值为纵坐标(Y坐标)，绘制出标准曲线，其标准曲线见图1。待测样品的吸光度值为0. 563，根据待测样品的吸光度值在标准曲线上查出相应的值5. 707，再乘以稀释倍数8即为待测样品的IV型胶原酶含量为 45. 656mg/L。
或者用标准物的浓度与吸光度值算出标准曲线的回归方程，该回归方程为 Y=O. 0898X+0. 0507，R2=O. 9993，Ρ<0· 01，线性范围 1. 5 10. Omg/L,将待测样品的吸光度值代入方程，0. 563=0. 0898X+0. 0507，X=5. 707计算出待测样品的IV型胶原酶含量 8XX=8X5. 707=45. 656mg/L。
实施例2 利用本发明的方法，本实施例测定112名健康人血浆IV型胶原酶含量， 其含量范围31. 51 49. 99mg/L，平均值41. 59mg/L，标准差4. 19mg/L。统计分析证实健康人血浆IV型胶原酶含量服从正态分布，因此由—χ 士 1. 965得出双侧95%的界限值为33. 38
49. 80mg/L。该112名健康人血浆IV型胶原酶含量分布图如图2所示。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.一种IV型胶原酶含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤a)分别准备空白管、标准管和待测样品管；首先向空白管、标准管和待测样品加入底 物溶液，所述底物溶液为5mg/ml 10mg/ml琥珀酰明胶；接着向空白管中加入样品稀释 液，向标准管中加入标准品，向待测样品管中加入待测样品，所述样品稀释液为体积百分比 为 40mmol/l 60mmol/lTris 缓冲液、5mmol/l 15mmol/lCaCl2、10 μ mol/1 20ymol/ IZnCl2以及质量百分数为0. 05% 0. 1%月桂醇聚氧乙烯醚混合而成，所述标准品为已知浓 度的IV型胶原酶；最后向标准管和待测样品管中加入样品稀释液，在35°C 45°C水浴反应 30 120分钟； b)在空白管、标准管和待测样品管中加入终止液终止酶切反应，再加入检测溶液A和 检测溶液B，最后加入检测稀释液，在35°C 45°C水浴下显色反应30 60分钟，使其显 色反应充分进行，所述终止液为质量百分数为0. 05% 0. 2%HCL,检测溶液A为0. IM 0. 5MNaOH,检测溶液B为质量百分数为0. 01% 0. 05%三硝基苯磺酸，检测稀释液为双蒸 水；c)各管冷却至室温后，取各管溶液至酶标板中，用酶标仪测定吸光度；d)以标准物的浓度为横坐标，测定出的吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线，根据待测 样品的吸光度值在标准曲线上查出相应的待测样品的IV型胶原酶含量；或者用标准物的浓 度与吸光度值算出标准曲线的方程，将待测样品的吸光度值代入方程，计算出待测样品的 IV型胶原酶含量。
2.根据权利要求1所述的IV型胶原酶含量测定方法，其特征在于，所述标准管的数量 至少为六个。
3.根据权利要求1所述的IV型胶原酶含量测定方法，其特征在于，所述待测样品为血 清或血浆。
4.根据权利要求1至3任意一项所述的IV型胶原酶含量测定方法，其特征在于，所述酶 标仪在400nm 440nm处测定吸光度。
全文摘要
本发明公开了一种Ⅳ型胶原酶含量测定方法，涉及一种测定人体血浆、血清中Ⅳ型胶原酶含量的测定方法。该方法利用Ⅳ型胶原酶具有水解明胶的特异性结合位点，而血浆中存在的其它基质金属蛋白酶难以水解明胶，采用TNBS对明胶的水解产物进行显色，可以对人体血浆活血清中的Ⅳ型胶原酶进行特异性的定量分析。本发明能够准确、快速的测定到人体血浆或血清中Ⅳ型胶原酶的含量。
文档编号G01N21/78GK101846632SQ20101020154
公开日2010年9月29日 申请日期2010年6月17日 优先权日2010年6月17日
发明者凌青, 余谨, 赵云斌 申请人:华中科技大学