专利名称：一种用于诊断或检测白血病的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，尤其涉及一种用于诊断或检 测白血病的试剂盒。
背景技术：
白血病是造血干细胞克隆性疾�。且蛔楦叨纫熘市缘亩裥匝翰�。白血病的发 生与环境污染、压力增大等因素有关，但根本原因还是基因的异常表达。基因诊断在白血病 的诊断、疗效观察、预后判断等方面发挥重要的作用，用于白血病基因诊断的方法主要有荧 光原位杂交(FISH)技术和常规RT-PCR技术，但是这两种方法都不够灵敏，定量不准确。白 血病需要尽早发现，及时治疗，且在白血病的治疗过程中，许多完全缓解后的白血病最终会 复发，原因是患者体内仍然存在不能用常规方法检测出来的低水平的肿瘤细胞，称为微小 残留病(MRD)。临床治疗需要检测MRD的方法的灵敏度达到IO5 IO6个细胞的水平，并且 能够定量、快速、价廉、易于标准化，更重要的是在不同实验室的检测结果能重复。实时荧光 定量PCR在全封闭的试管中进行，可以快速准确地定量基因表达，使患者在不同病期、不同 实验室进行检测的结果有了可比性，为白血病的基因诊断提供了技术保障，具有常规技术 无法比拟的优越性。Wnt5a是Wnt蛋白家族19个成员之一，其基因定位于染色体3p21 pl4，它主要激 活非经典Wnt通路，在发育的组织、骨髓基质细胞和造血细胞中有表达，可促进造血干/祖 细胞分化发育。近来Wnt5a与肿瘤研究逐见报道，不同肿瘤中，Wnt5a表达失调不一致。如 在人类胰腺癌、胃癌、肺癌、黑素瘤、牙源性瘤中过表达，在体外促进肿瘤细胞增殖和迁移， 表现出癌基因的活性。而在甲状腺癌、乳腺癌、子宫癌、结肠癌、前列腺癌和急性白血病中， Wnt5a表达下调或缺失，表现出抑癌基因的活性，在治疗缓解后表达恢复。Wnt5a与白血病发生的研究报道不多，发明人课题组曾以RT-PCR方法检测发现， Wnt5ai88.9% (24/27)的正常人骨髓中阳性表达，在100% (10/10)的CD34+细胞中表达， 在白血病细胞株中表达缺失，在髓细胞白血病患者骨髓标本中仅有13. 2% (9/68)阳性表 达，淋巴细胞白血病患者骨髓标本中为7. 7% (1/13)而在完全缓解的髓细胞白血病患者骨 髓标本中阳性表达率升高到65. 7% (23/35)，缓解的淋巴细胞白血病病例升高到71. 4%, 是白血病患者的5倍，提示Wnt5a表达缺失可能与白血病的发生及预后有关。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于诊断或检测白血病的试剂盒，其主要包含淋巴 细胞分离液、总RNA提取液、逆转录缓冲液、M-MLV逆转录酶、逆转录引物Oligo (dT) 18、RNA 酶抑制剂、DEPC水、定量PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs溶液、Wnt5a基因标准品、内对 照GAPDH基因标准品、检测Wnt5a基因的引物和荧光探针、检测内对照GAPDH基因的引物和 荧光探针。所述试剂盒包含的各组分的浓度为5X逆转录缓冲液、200U/ μ L M-MLV逆转录酶、500ng/y L逆转录引物01igo(dT)18、40U/y L RNA酶抑制剂、DEPC水、IOX定量PCR缓 冲液、IOU/ μ L Taq DNA聚合酶、IOmM dNTPs溶液、IO8拷贝/ μ Lffnt5a基因标准品、IO8拷贝 / μ L内对照GAPDH基因标准品。所述Wnt5a基因标准品为含有Wnt5a部分编码序列的重组pMD_19质粒，该Wnt5a 部分编码序列如SEQ ID N0:1所示。所述GAPDH基因标准品为含有GAPDH部分编码序列的重组pMD_19质粒，该GAPDH 部分编码序列如SEQ ID NO 2所示。所述检测Wnt5a基因的引物如SEQ ID NO :3_4所示、荧光探针如SEQ IDNO :5所不。所述检测GAPDH基因的引物如SEQ ID NO :6_7所示、荧光探针如SEQ IDNO :8所不。所述的试剂盒，还包含阳性对照和阴性对照。所述阳性对照为正常人骨髓细胞总RNA逆转录合成的cDNA。所述阴性对照为灭菌双蒸水。本试剂盒中淋巴细胞分离液常温下保存，总RNA提取液置4°C保存，其它试剂应保 存于-20°C，尽量减少反复冻融。本发明还提供上述的试剂盒的使用方法，其操作简便快速、费用低廉且易于标准 化，其主要包括步骤a.从待测标本中分离有核细胞，提取细胞总RNA，测定RNA浓度，加入逆转录缓冲 液、M-MLV逆转录酶、逆转录引物Oligo (dT) 18、RNA酶抑制剂和dNTPs溶液，将RNA逆转录为 cDNA ；b.分别将已知拷贝数的Wnt5a和内对照GAPDH基因标准品倍比稀释至108、107、 106、105、104、103、IO2UO1 个拷贝数 / μ L ；c.分别以步骤a所得待测cDNA及步骤b所得倍比稀释的Wnt5a和GAPDH基因标 准品为模板，加入检测Wnt5a基因的上、下游引物和荧光探针，检测内对照GAPDH基因的上、 下游引物和荧光探针，定量PCR反应液以及Taq DNA聚合酶，进行荧光定量PCR ；d.模板的循环阈值与该模板的初始拷贝数的对数存在线性关系，根据倍比稀释 的Wnt5a和内对照GAPDH基因标准品的循环阈值与初始拷贝数分别绘制Wnt5a和内对照 GAPDH基因标准曲线，再根据待测cDNA的循环阈值对其含有的Wnt5a和内对照GAPDH基因 的初始拷贝数进行定量。e.所述步骤c的PCR扩增条件为95°C预变性2分钟，然后95°C变性10秒、58°C 退火40秒，共40个循环。本发明提供的用于诊断或检测白血病的试剂盒，制备简单、检测方便、快速灵敏、 定量准确、重复性好、特异性高，适于临床应用。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 并配合附图，作详细说明如下。
现结合附图对本发明作进一步详细说明。
图Ia为将本发明试剂盒Wnt5a基因标准品模板按10倍梯度稀释后，实施荧光定 量PCR获得的荧光反应曲线，纵坐标代表相对荧光强度，横坐标代表循环数，图中平行于横 坐标的直线代表循环阈值。图Ib为将本发明试剂盒Wnt5a基因标准品模板按10倍梯度稀释后，实施荧光定 量PCR获得的标准曲线，其横坐标代表起始模板浓度的对数，纵坐标代表循环数。图2a为将本发明试剂盒内对照GAPDH基因标准品模板按10倍梯度稀释后，实施 荧光定量PCR获得的荧光反应曲线，纵坐标代表相对荧光强度，横坐标代表循环数，图中平 行于横坐标的直线代表循环阈值。图2b为将本发明试剂盒内对照GAPDH基因标准品模板按10倍梯度稀释后，实施 荧光定量PCR获得的标准曲线，其横坐标代表起始模板浓度的对数，纵坐标代表循环数。
具体实施例方式为了更加清楚的说明本发明的目的、技术方案及使用方法等，下面结合实施例对 本发明进一步详细描述。实施例lWnt5a基因mRNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒的配制本试剂盒包括如下组成部分a.淋巴细胞分离液、Trizol总RNA提取液、5 X逆转录缓冲液、200U/ μ LM-MLV逆 转录酶、500ng/y L逆转录引物01igo(dT)18、40U/y L RNA酶抑制剂、DEPC-H2OUOx定量 PCR缓冲液、IOU/μ L Taq DNA聚合酶、IOmM dNTPs溶液。(淋巴细胞分离液购自天津TBD 公司、Trizol总RNA提取液购自Invitrogen公司)b. Wnt5a基因标准品含有Wnt5a部分编码序列的重组pMD_19质粒，其浓度为IO8 拷贝/ μ L，所含Wnt5a核苷酸序列为5 ’ -AGTTCTTCCTAGTGGCTTTGGCCATATTTTTCTCCTTCGCCCAGGTTGTAATTGAAGCCAATTCTT GGTGGTCGCTAGGTATGAATAACCCTGTTCAGATGTCAGAAGTATATATTATAGGAGCACAGCCTCTCTGCAGCCAA CTGGCAGGACTTTCTCAAGGACAGAAGAAACTGTGCCACTTGTATCAGGACCACATGCAGTACATCGGAGAAGGCGC GAAGACAGGCATCAAAG-3，(SEQ ID NO 1)c. GAPDH基因标准品含有GAPDH部分编码序列的重组pMD_19质粒，其浓度为IO8 拷贝/ μ L,所含GAPDH核苷酸序列为5 ’ -ACCCACTCCTCCACCTTTGACGCTGGGGCTGGCATTGCCCTCAACGACCACTTTGTCAAGCTCATT TCCTGGTATGACAACGAATTTGGCTACAGCAACAGGGTG-3，(SEQ ID NO 2)d.检测Wnt5a基因所用上下游引物及荧光探针分别为Wnt5a-检测上游引物5，-CCCAGGTTGTAATTGAAG-3，(SEQ ID NO 3),Wnt5a-检测下游引物5，-ATATACTTCTGACATCTGAAC-3，(SEQ IDNO 4)，Wnt5a-荧光探针5，-FAM-CATACCTAGCGACCACCAAGAA-TAMRA-3，(SEQ ID NO :5)。e.检测GAPDH基因所用上下游引物及荧光探针分别为GAPDH-检测上游引物5，-CACTCCTCCACCTTTGAC-3，(SEQ ID NO 6),GAPDH-检测下游引物5，-CACCCTGTTGCTGTAGCC-3，(SEQ IDNO 7)，GAPDH-荧光探针5，-FAM-TGCCCTCAACGACCACTTTGTC-TAMRA-3，(SEQ ID NO :8)。
检测Wnt5a和内对照GAPDH基因的上下游引物和荧光探针浓度均为10 μ mol/L。f.阳性对照为正常人骨髓细胞总RNA逆转录合成的cDNA，阴性对照品为灭菌双蒸 水。其中Wnt5a和GAPDH基因标准品的制备方法如下细胞总RNA提取培养表达Wnt5a基因的Jurkat细胞(李招权等，“Wnt5a基因在 血液病及白血病细胞株中的表达”，中国实验血液学杂志，2007，15 (5) 927-930)，IOOOrpm 离心5分钟收集约IO7个Jurkat细胞，转移至1. 5mL EP管中，按实施例2中步骤②的方 法提取Jurkat细胞总RNA。cDNA的合成根据RNA定量结果，取1 μ g RNA，按实施例2中步骤③的方法逆 转录合成cDNA。PCR扩增取逆转录cDNA 1 μ L，5 X PCR缓冲液5 μ L、浓度为10 μ mol/L的标准品 引物各1 μ L、浓度为IOmM的dNTP溶液1 μ L，浓度为IOU/ μ L的Taq DNA聚合酶0. 2 μ L， 最后双蒸水补足25 μ L ；PCR条件为94°C预变性3分钟，然后94°C变性30秒、57°C退火45 秒、72 °C延伸1分钟，共30个循环，最后72°C延伸5分钟，4°C保存。标准品的克隆PCR产物电泳检测后，切胶回收目的基因条带，定量之后与pMD-19 载体连接，转化到DH5ci菌中，培养后进行蓝白筛选，提取阳性克隆质粒测序鉴定。鉴定后 的阳性质粒即为标准品，紫外分光光度法测质粒浓度并换算成拷贝数/体积。经测序确定 设计的标准品与预期序列相符。此外，本试剂盒中的淋巴细胞分离液、Trizol总RNA提取液、逆转录缓冲液、M-MLV 逆转录酶、逆转录引物Olig0 (dT) 18、RNA酶抑制剂、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs溶 液均为RT-PCR的常规试剂，使用者可以自行制备或购买，故本试剂盒也可以不包括上述试 剂。实施例2Wnt5a基因mRNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒的检测本试剂盒每次检测均设立阳性对照和阴性对照，其检测方法包括以下步骤①骨髓或外周血有核细胞的分离将新鲜抗凝骨髓加入等体积生理盐水稀释，充 分混勻；离心管中先加入1/2体积(指稀释后骨髓体积)的淋巴细胞分离液，将稀释后骨髓 小心加入到分离液面上，保持清晰的界面，2000rpm离心15min ；小心吸取有核细胞层于离 心管中，用生理盐水洗两次，每次500rpm离心5min。②总RNA的提取加1. OmL Trizol于分离的细胞中，充分混勻，室温静置5min ；力口 入200 μ L的氯仿，用力振荡15秒，室温静置2 3min，在4°C 12000rpm离心15min ；将上 层无色水相转移入另一干净Ep管，加等体积的异丙醇，混勻，室温放lOmin，在4°C 12000rpm 离心15min ；小心弃上清，加1. OmLDEPC水配制的75% (V/V)乙醇，在4°C 7500rpm离心 5min。小心吸去大部分上清液，开盖，室温干燥IOmin ；沉淀用25 μ L DEPC水溶解，并吸出部 分溶液，用紫外分光光度计测定OD26tl和0D·。根据RNA在260nm波长处有最大的吸收峰， OD260值为1相当于大约40 μ g/mL的单链RNA，乘以稀释倍数，即可得RNA浓度。③cDNA的合成根据RNA定量结果，取1 μ g RNA,加入Oligo (dT) 181· 0 μ L，再用 DEPC水补足体积至13 μ L，混勻，离心5s后，70°C预热5min，立即冰浴lmin，再依次加入5 X 逆转录缓冲液 4. 0 μ L，IOmM dNTPs 1. 0 μ 1、200U/μ L 逆转录酶 M-MLV 1. 0 μ L、40U/μ L 的 RNA酶抑制剂l.OyL,最后总体积为20 μ L。混勻，离心5s后，42°C温浴Ih, 95V 5min,产物置-20°C保存。④分别将已知浓度的Wnt5a和GAPDH基因标准品倍比稀释至108、IO7, ΙΟ6、ΙΟ5、104、 IO3UO2UO1 个拷贝数/μ L。⑤分别以步骤③所得的cDNA及步骤④所得的倍比稀释的Wnt5a和GAPDH基因标 准品为模板，进行荧光定量PCR ；PCR体系为10 X定量PCR缓冲液2. 5 μ L、浓度为10 μ mol/ L的Wnt5a和GAPDH基因上下游检测引物各1 μ L、浓度为10 μ mol/L的各基因荧光探针各 1. 2 μ L、浓度为IOmM的dNTP溶液1 μ L，浓度为IOU/ μ L的Taq DNA聚合酶0. 2 μ L、浓度为 IOOng/ μ L的待测cDNA或倍比稀释的Wnt5a和GAPDH基因标准品1 μ L、双蒸水补足25 μ L ； PCR条件为95°C预变性2分钟，然后95°C变性10秒、58°C退火、延伸45秒，共40个循环 (PCR条件可根据不同的荧光定量PCR仪略作调整)；每个循环结束时在波长为525nm进行 荧光检测。⑥模板的循环阈值与该模板的初始拷贝数的对数存在线性关系，根据倍比稀释 的Wnt5a和内对照GAPDH基因标准品的循环阈值与初始拷贝数分别绘制Wnt5a和内对照 GAPDH基因标准曲线，再根据待测cDNA的循环阈值对其含有的Wnt5a和内对照GAPDH基因 的初始拷贝数进行定量。 实施例3试剂盒性能评价为了检测Wnt5a基因mRNA实时荧光定量PCR方法的可重复性和灵敏度，本发明采 用重复性实验和灵敏度实验进行评价。1.标准曲线制备及线性范围取梯度稀释的Wnt5a和GAPDH基因质粒标准品(IO8-IO1c0Pies/ μ L)进行荧光定 量PCR反应。反应条件95 °C预变性2分钟，然后95 °C变性10秒、58 °C退火、延伸45秒，共40 个循环，于退火温度下收集荧光信号。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理(Bio-rad 公司iQ5 定量PCR仪自带)获得标准曲线，并计算相关系数(R)，得出线性范围，见图la、 Ib 和图 2a、2b。结果为在IO8-IO1拷贝/ μ L Wnt5a和GAPDH基因均有有良好的线性关系，标准 曲线的相关性很好。其中根据标准曲线求得Wnt5a的回归方程为y = -3. 333x+35. 406, R2 =0. 996 ；GAPDH 的回归方程为:y = -3. 236x+32. 379，R2 = 0. 999。其相关系数分别为R2wnt5a = 0. 996，R2gapdh = 0. 999。2.灵敏度将Wnt5a和GAPDH基因标准品质粒以10倍梯度稀释至浓度极限10拷贝/ μ L，用 去离子水做阴性对照，进行荧光定量反应，能区别于阴性对照的最低质粒浓度即为该法的 灵敏度。检测结果显示所建方法最低能检测IO1拷贝/ μ L的重组质粒。3.重复性试验以浓度分别为ΙΟ8、107、IO6、105、IO4、103、IO2UO1 拷贝 / μ L 的 Wnt5a 和 GAPDH 基因 标准品做标准曲线，取IO7个Jurkat细胞，按本试剂盒使用方法所述步骤提取RNA，逆转录， 进行定量PCR反应。对同一批稀释制备的质粒模板同时进行10次批内重复性检测；对不同 天稀释制备的质粒模板进行10天天间重复性检测，结果见表1。表1 批内、天间重复性检测结果
权利要求
一种用于诊断或检测白血病的试剂盒，其特征在于，其包含淋巴细胞分离液、总RNA提取液、逆转录缓冲液、M MLV逆转录酶、逆转录引物Oligo(dT)18、RNA酶抑制剂、DEPC水、定量PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs溶液、Wnt5a基因标准品、内对照GAPDH基因标准品、检测Wnt5a基因的引物和荧光探针、检测内对照GAPDH基因的引物和荧光探针。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含的各组分的浓度为 5X逆转录缓冲液、200U/ii L ] -]\0^逆转录酶、500叫/111^逆转录引物01180((11018、4(^/111^ RNA酶抑制剂、DEPC水、10 X定量PCR缓冲液、10U/ u LTaq DNA聚合酶、10mM dNTPs溶液、 108拷贝/ y L Wnt5a基因标准品、108拷贝/ y L内对照GAPDH基因标准品。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述Wnt5a基因标准品为含有 Wnt5a部分编码序列的重组pMD-19质粒，该Wnt5a部分编码序列如SEQ ID NO 1所示。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述GAPDH基因标准品为含有 GAPDH部分编码序列的重组pMD-19质粒，该GAPDH部分编码序列如SEQ ID NO 2所示。
5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测Wnt5a基因的引物如SEQ ID NO 3-4所示、荧光探针如SEQ ID NO 5所示。
6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测GAPDH基因的引物如SEQ ID NO 6-7所示、荧光探针如SEQ ID NO 8所示。
7.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，还包含阳性对照和阴性对照。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为正常人骨髓细胞总RNA 逆转录合成的cDNA。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为灭菌双蒸水。
全文摘要
本发明涉及一种用于诊断或检测白血病的试剂盒，其包含淋巴细胞分离液、总RNA提取液、逆转录缓冲液、M-MLV逆转录酶、逆转录引物Oligo(dT)18、RNA酶抑制剂、DEPC水、定量PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs溶液、Wnt5a基因标准品、内对照GAPDH基因标准品、检测Wnt5a基因的引物和荧光探针、检测内对照GAPDH基因的引物和荧光探针。本发明提供的用于诊断或检测白血病的试剂盒，制备简单，检测方便、快速灵敏、定量准确、重复性好、特异性高，适于临床应用。
文档编号G01N21/64GK101942519SQ20101029498
公开日2011年1月12日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者司维柯, 李军, 李招权, 杨宗林, 潘静, 赵宸 申请人:中国人民解放军第三军医大学
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