专利名称：利用红细胞内含有的血红蛋白的本征色素沉着来确定血样的红细胞指数的方法及设备的制作方法
技术领域：
本发明总的来说涉及分析血样的设备及方法，具体地讲，涉及确定样本的红细 胞体积以及平均细胞体积的设备及方法。
背景技术：
内科医生、兽医和科学家检查人类和动物的生物流体(尤其是血液)，以确定组 分的微粒数量以及识别是否存在在健康的受试者中没有发现的异常微粒。通常被测量、 定量和识别的微粒包括红细胞(RBC)、白细胞(WBC)和血小板。RBC分析包括确定 RBC数目、大小、体积、形状、血红蛋白含量和浓度、以及血细胞比容(也被称为红细 胞压积)。RBC分析还可以包括确定红细胞(诸如DNA，RNA)内是否存在某些成分和 /或确定这些成分的浓度，包括检测RBC中是否存在和/或存在多少血液寄生虫(例如疟 原虫)或者检测WBC中是否存在和/或存在多少细胞外的或利什曼原虫组织的睡病虫， 以及检测是否存在和/或存在多少其他血液寄生虫。WBC分析可以包括确定WBC子类 型的族群(population)频率，通常称为分类WBC计数，以及通知任何在健康的受试者中 没有发现的异常细胞类型。血小板(或者在包括鸟、爬行动物和鱼的某些动物中为凝血 细胞(thrombocyte)，该凝血细胞在功能上类似于哺乳动物的血小板，但是比哺乳动物的 血小板大约10倍且是有核的)分析可以包括对血小板数目、大小、形状结构和体积的确 定，包括确定样本中是否存在血小板或凝血细胞的凝块。在诸如Wintrobe，s Clinical Hematology第12版的医学文献中详细描述的已知的
血液检查技术通常将检查方法分为手动、离心和阻抗型方法。用于细胞计数的手动方法 通常涉及产生精确确定的血液或流体样本的体积，该血液或流体样本被定量稀释并且在 计数室中被直观计数。手动检查方法包括检查其中通过目测确定微粒类型的相对量的外 周涂片。离心检查方法涉及对样本进行离心，使得根据组分的相对密度将样本分成多个 组分层。可以给组分层染色，以增强可见性或检测性。阻抗型方法涉及检查根据被测量 的颗粒而经过处理的血液的精确体积；例如溶解RBC来计数有核细胞以及在导电流体中 体积(volumetrically)稀释样本。该过程通常涉及监视施加给通过窄通道的样本的电流或 电压，以确定当微粒以单行通过时微粒对电流/电压的影响。其他技术涉及对通过光束 入射到以单行通过的微粒的光的强度和散射角的分析。还可以使用流式细胞测定法，该 方法涉及利用附着于针对细胞或微粒类型上存在的表面抗原决定簇的抗体的荧光基团给 悬浮中的感兴趣的微粒染色、用适当波长的光激发染色微粒、以及分析各个微粒/细胞的发光(emission)。除了 外周涂片或离心分离之外，上述所有方法都要求滴涂精确的样本体积。样 本体积的不精确将导致相关分析中同一数量的定量误差。除了离心方法之外，上述所有 方法还都要求样本与一种或多种液体试剂或稀释剂混合，并且为了获得精确的结果还要 求对仪器进行校准。在外周涂片的情况下，需要高度训练来正确地检查涂片。上述的许 多方法产生大量的污染物，而处理这些污染物是昂贵的。另外，上述方法不适于确定其 中红细胞和凝血细胞有核的鸟、爬行动物和鱼中的以及其中红细胞尺寸非常小并且可能 与血小板混淆的某些哺乳动物中的全血计数(CBC)。可以通过检查人类或动物的血液确定的信息量是巨大的。确定RBC指数尤其有 用；例如，单个细胞大小、单个细胞血红蛋白含量和浓度、以及样本内的RBC的族群统 计。如上述引用的Wintrobe的文献中的讨论所表明，对于上述参数中的每种参数的平均 和离差统计(例如，变异系数)还可以提供重要信息，这已经使得外科医生能够对RBC 紊乱进行更好地分类。
发明内容
根据本发明，提供了一种确定RBC指数的方法，RBC指数包括单个RBC的体 积、以及血红蛋白含量和浓度；以及RBC族群统计，包括样本中存在的RBC的总量，和 基本上未稀释的血液样本内的上述每个指数的平均值。根据本发明的一方面，提供了一种方法，其包括以下步骤1)提供基本上未稀 释的血液样本；2)将样本滴落在适于静止保持样本以进行分析的分析腔室中，该分析腔 室由第一平板的内表面和第二平板的内表面限定，其中两个平板都是透明的，并且该腔 室的高度在两个平板的内表面之间延伸，该高度使得样本内的至少一个红细胞与这两个 内表面都接触；3)对与内表面接触的所述至少一个红细胞成像；4)确定被成像的红细胞 上与两个内表面接触的部分的光密度；以及5)使用所确定的与在两个内表面之间延伸的 红细胞的所述部分光学对准的像素的光密度值，来确定与内表面接触的红细胞的血红蛋 白浓度。根据本发明的另一方面，提供了一种用于确定基本上未稀释的血液样本内的红 细胞的细胞体积的方法。该方法包括以下步骤1)提供基本上未稀释的血液样本；2)将 该样本滴落在适于静止保持样本以进行分析的分析腔室中，该腔室由第一平板的内表面 和第二平板的内表面限定，其中两个平板都是透明的，并且该腔室的高度在两个平板的 内表面之间延伸，该高度使得样本内的至少一个红细胞与两个内表面都接触；3)对与内 表面接触的所述至少一个红细胞进行成像，包括对红细胞上与两个内表面接触的部分进 行成像；4)确定红细胞上与两个内表面接触的部分的平均光密度；5)确定整个红细胞的 总的光密度；以及6)使用腔室的高度、为被成像的红细胞上与两个内表面接触的部分确 定的平均光密度、和为整个被成像的红细胞确定的光密度，来确定所述至少一个红细胞 的细胞体积。本发明的一个优点在于本发明可以用来利用极少的样本量来确定血液样本的特 性，该极少的样本量可以通过毛细管穿刺从病人直接获得，从而使得本发明对现场护理 应用更加有用，或者可以根据需要从静脉样本获得该极少的样本量。
本发明的另一个优点在于其可用于利用血红蛋白的本征色素沉着来确定血液样 本的特性，因此不需要添加任何染料或着色剂。血红蛋白的高摩尔消光系数使得能够精 确地确定其在小到几微米的非常小的光路距离内的相对或绝对浓度。本发明的另一个优点在于可以确定一个特定细胞上的单个RBC指数，从而可以 识别指数之间的相关性。本发明的方法的另一个优点在于其对于外部和内部流体都适用，并且与重力和 方位无关，因此该方法适于用在手持式设备中和微重力条件下。本发明的方法的另一个优点在于与阻抗计数器不同，本发明的设备不需要在每 次使用时都进行校准。本发明的设备不易受诸如细胞流经阻抗型细胞计数器量孔以进行 测量时的细胞形状、细胞方位之类的扰动，或者不易受到阻抗计数所需的稀释液体的渗 透压影响。通过下面提供的包括附图的详细描述，本发明的方法及与其有关的优点将更加 显然。
图1至图4是可用在本发明的方法中的分析腔室的截面示意图。图5是具有多个分析腔室的条带的示意平面图。图6是具有分析腔室的一次性容器的示意平面图。图7是具有分析腔室的一次性容器的示意截面图。图8是可与本发明的方法一起使用的分析设备的示意图。图9是图1所示的分析腔室的一部分的放大示图。图10是示出根据本发明的一个方面的用于确定红细胞内的血红蛋白浓度和多个 红细胞内的平均血红蛋白浓度的方法步骤的框图。图11是示出根据本发明的一个方面的用于确定红细胞的细胞体积和红细胞族群 的平均细胞体积的方法步骤的框图。图12是示出根据本发明的一个方面的用于确定红细胞的血红蛋白含量和红细胞 族群的平均血红蛋白含量的方法步骤的框图。
具体实施例方式本发明的用于分析基本上未稀释的全血样本的方法及设备能够确定红细胞 (RBC)细胞体积(CV)、平均细胞体积(MCV)、细胞血红蛋白浓度(CHC)、平均细胞血 红蛋白浓度(MCHC)、和平均细胞血红蛋白含量(MCH)，以及它们的族群统计，而不需 要添加任何染料、试剂(除了一些实施例中的抗凝血剂之外)或者对样本进行稀释的稀释 液。本发明的方法利用了分析腔室，该分析腔室可用于静止地保持基本上未稀释的 抗凝全血样本以进行分析。该腔室的典型大小可以保持大约0.2至1.0 μ 1的样本，但是 该腔室不限于任何特定的体积容量，该容量可以为适 应分析应用而改变。在此使用的术 语“基本上未稀释的”表示根本未被稀释的血液样本或者未被故意稀释的血液样本，但 是为了进行分析，可以对血液样本添加一些试剂。如果添加有试剂的话，就该试剂添加对样本稀释的程度来说，在临床上这种稀释对所进行的分析没有显著的影响。通常，将 在执行本发明的方法过程中使用的试剂只有抗凝血剂(例如，EDTA、肝素)，在一些实 例中为等容球状试剂(isovolumetric sphering agent)。这些试剂通常以干粉形式来添加， 其目的是不稀释样本。在某些情况下(例如，非�？焖俚姆治�)，不必添加抗凝血剂，但 是在大多数情况下优选的是添加抗凝血剂以确保样本处于分析可接受的形式。术语“静 止”用来描述样本被滴落在腔室内以进行分析，并且在分析过程中该样本不会相对于腔 室故意移动；即，样本静止地处于腔室内。就血液样本内存在运动的程度来说，血液样 本的形成组分的布朗运动占主导，该运动不会破坏本发明的设备的使用。 现在参照图1，分析腔室10由具有内表面14的第一平板12和具有内表面18的第 二平板16限定。平板12、16都是足够透明的，以使得能够有足以执行如下所述的光密度 分析的预定波长的光的量通过。平板12、16的至少一部分是彼此平行的，在该部分内， 内表面14和内表面18彼此间隔开高度20，使得样本内的至少一些单个RBC 22均单独地 接触两个内表面14、18，和/或样本内的一个或多个RBC聚合体23均接触腔室平板12、 16的内表面14、18，以及静止样本内的一个或多个无RBC的区域(例如，腔隙)24在所 述内表面之间延伸，如下将更详细地说明。本发明的方法可以利用具有上述特性的各种 不同的分析腔室类型，因此不限于任何特定类型的分析腔室。具有平行的平板12、16的 分析腔室简化了该分析，因此是优选的，但是并不是本发明所必需的；例如，可以使用 这样一种腔室，即，该腔室的一个平板相对于另一个平板成已知的非平行角度布置。现在参照图2至图5，示出了一个可接受的腔室10的示例，该腔室10包括第一 平板12、第二平板16、以及至少三个布置在平板12和平板16之间的隔离物26。隔离 物26可以是可布置在平板12和平板16之间的用于将平板12和平板16彼此分隔的任何 结构。在平板12和平板16之间延伸的隔离物26的尺寸28在此被称为隔离物26的高度 28。隔离物26的高度28通常不精确地彼此相等(例如，存在制造公差)，但是处于商业 上可接受的用于类似分析设备中的分隔装置的公差内。球状珠是可接受隔离物26的一个 示例，并且商业上可从例如 Bangs Laboratories of Fishers，Indiana, U.S.A.获得。在图3所示的腔室实施例中，隔离物26由弹性大于第一平板12和第二平板16 中的一个或者两个的材料组成。从图3可以看出，较大的隔离物26被压缩到大多数隔 离物26接触平板12、16的内表面14、18的程度，从而使得腔室高度仅仅稍微小于平 均的隔离物26的直径。在图4所示的腔室实施例中，隔离物26由弹性小于第一平板 12和第二平板16中的一个或两个的材料组成。在图4中，第一平板12由比球状隔离 物26和第二平板16更有弹性的材料形成，并且将以帐篷式(tent-like)的方式覆盖隔离 物26。在该实施例中，虽然腔室10的小局部区域可能偏离期望的腔室高度20，但是腔 室10的平均高度20将非常接近平均的隔离物26的直径高度。分析显示使用该实施例可 以将平均腔室高度20控制为小于4微米的腔室高度的上下或更好。除了受到上述的 弹性特性(以及诸如隔离物的分布密度之类的其他因素)的限制，隔离物26和平板12、 16可以由各种材料制备，只要平板12、16足够透明。由丙烯酸(acrylic)或者聚苯乙烯 (polystyrene)组成的透明塑料薄膜是可接受的平板12、16的示例，并且由聚苯乙烯、聚 碳酸酯(polycarbonate)、硅酮(silicone)等制成的球状珠是可接受的隔离物26。可接受 的隔离物的特定示例是由聚苯乙烯制成的球体，在商业上可以从例如Thermo Scientific ofFremont, California, U.S.A.目录编号为4204A获得4微米(4 μ m)直径的这种球体。参
照图5，垂直布置在另一个平板上方的平板12包括多个以规则的间隔布置的口 30(例如， 用作气孔)，并且平板12和平板16在多个点处结合在一起。在一些实施例中，结合材 料32形成了可用于将样本34横向地包含在分析腔室10内的外腔室壁。这个可接受的分 析腔室的示例在美国专利申请公开No.2007/0243117、2007/0087442、以及2008年4月2 日提交的美国临时专利申请No.61/041,783和2008年10月31日提交的美国临时专利申请 No.61/110,341中详细地进行了描述，这些文献在此以引用方式整体并入本文。另一个可接受的腔室10的示例布置在如图6和图7所示的一次性容器36中。腔室10形成在第一平板12和第二平板16之间。第一平板12和第二平板16都是透明的， 以允许光穿过腔室10。第一平板12和第二平板16的至少一部分彼此平行，在该部分内， 内表面14和内表面18彼此间隔开高度20。该腔室10的实施例在美国专利No.6,723,290 中更详地进行了描述，该专利以引用方式整体并入本文。图2至图7所示的分析腔室表 示可接受的用于本发明方法的腔室。然而，本发明的方法不限于这些特定实施例。可接受的腔室高度是这样的一个高度，S卩，其中样本内的至少一些RBC单独地 接触腔室平板的两个内表面，和/或一个或多个RBC聚合体接触腔室平板的两个内表 面，和静止样本内的一个或多个无RBC区域(例如，腔隙)在所述内表面之间延伸。由 于血液样本内的RBC 22的大小是被分析(例如人类、猴子、马、山羊、鱼、鸟等)的血 液样本类型的函数，因此可接受的腔室高度将根据被测试对象而改变。基于典型的RBC 大小和RBC在一定程度上可以变形(例如，上述的被部分压缩的球体)的事实，对于大 多数动物品种来说，大约2至6微米(2-6 μ m)的腔室高度对于单个RBC是可接受的。可 以分别在分别具有较大或较小腔室高度的腔室中执行其RBC基本上大于或小于人类RBC 的动物品种的血细胞比容(hematocrit)分析。另外，利用RBC聚合体的红细胞压积分析 的腔室高度可以由RBC聚合体的高度决定。在不利用隔离物26的那些腔室的实施例中，腔室10的高度20可以作为腔室的 制造工艺的一部分来确定并且提供给腔室。作为选择，可以使用包括利用已知的可感觉 的着色剂量、或者利用布置在腔室内的几何特征的各种技术来确定腔室10的高度20， 其中布置在腔室内的几何特征可以用来确定已知领域的样本的体积，从而确定腔室的高 度。在美国专利No.6,723,290和No.6,929,953中描述了这些技术和其他技术。然而，本 发明不限于这些技术。在一些应用中，在至少一部分样本中掺合等容球状试剂(例如，两性离子去污 剂或者类似功能的试剂)，以使至少一些RBC呈现基本上为球状的几何形状。自然形式 的RBC 22通常是双凹圆盘状38 (见图1)，而不是球状40。因此，没有等容球状试剂的 影响，很大一部分圆盘状22将不会与两个腔室平板12、16都接触。增大具有基本上为 球状的几何形状的RBC 22数量将会增大与两个平板12、16都接触的RBC 22的数量，这 其中包括被腔室平板限制的可以用其他不同方法成为球状的一些细胞42。等容球状试剂 (例如，通过滴落在内表面的特定部分上)可以布置在腔室10的分立区域中。在腔室10 内没有样本混合时，该试剂将仅与靠近该试剂的样本部分掺合，从而留下未被球状试剂 处理的其他样本部分。这种有选择地使一部分RBC 22免受等容球状处理的步骤容许(如 下将要描述的)通过图像分析来检查RBC 22的定性形态以及容许将图像呈现给内科医生来检查诸如其圆度、形状和细胞上存在突起之类的特征。该等容球状处理不会干扰任何 的RBC 22的定量分析。使用分析设备来执行对静止地置于腔室10内的样本的分析，该分析设备可用于 对至少一部分样本进行成像并且对该图像进行分析。以容许基于基本单位来确定样本的 光密度的方式产生该图像。术语“基本单位”或者“图像单位”是指所定义的能够分辨 样本图像的增量单位。通常被定义为在特定成像系统内能够单独处理的最小图元的像素 是图像单位的一个示例，并且图像单位还可以包括集合单位形式的少量像素。还可以以 线性项(例如，在焦平面上每像素几微米)来描述成像设备的放大倍数，其中线性 维度沿 着应用于图像的正交网格的一个特定轴。在焦平面上被传感器像素(或者其他图像单位) 捕获的实际样本面积因此是成像设备所应用的放大系数的函数。因此，成像设备的放大 倍数应当已知或者应当能够确定。与该像素有关的体积因此是每个像素的图像的面积与 已知的腔室高度的乘积，这是因为腔室中被感测的点是RBC延伸贯穿整个腔室的点。例 如，如果放大倍数为每像素0.5微米，则占据200个像素的图像将具有50平方微米的面 积，而体积则为50平方微米与腔室高度的乘积。现在参照图8，适于用于本发明方法的分析设备44的示例包括样本照明器46、 析像器48、以及可编程分析器50。样本照明器46包括光源，并且通常包括用于控制光 的光学器件，该光源选择性地产生整个波长范围内的光，该波长范围宽到足以用于进行 红细胞压积分析(例如，大概400-670nm ；鉴于在大约413nm和大约540nm波长时血红 蛋白内出现的高光吸收度(这在大约413nm和大约540nm波长时的高摩尔消光系数(O 中得到反映)，因此，在确定人类血液样本内的RBC的光密度方面，大约413nm和大约 540nm的光尤其有效)。样本照明器46利用透光度来产生图像。例如可以通过将光源 定位在停留于腔室10内的样本的一侧、引导光通过静止布置在腔室平板之间的样本、然 后使用析像器捕获光来测量样本的透光特性。可接受的析像器48的示例是电耦合器件 (CCD)类型的图像传感器，其将穿过样本的光的图像转换成为电子数据形式。互补金属 氧化物半导体(“CMOS” )类型的图像传感器是另一种可以使用的图像传感器的示例， 然而本发明不限于这些示例中的任意一个。可编程分析器50包括中央处理单元(CPU)并 且连接至样本照明器46和析像器48。CPU适于(即，被编程为)选择性地执行进行本 发明方法所必需的功能。应当注意，可以使用硬件、软件、固件或者其结合来实现可编 程分析器50的功能。所属领域的技术人员将能够对处理单元进行编程以执行在此所述的 功能，而不需要进行过度的实验。题目为“ApparatusforAnalyzing Biologic Fluids”且于 2005年3月15日发布的美国专利No.6,866,823公开了这种分析设备44，该美国专利内容 以引文方式整体并入本文。分析设备44适于针对被成像的样本部分基于每个图像单位来确定与检测到的光 信号相关的OD值。RBC 22的OD由细胞内的血红蛋白浓度、在给定波长的血红蛋白的 摩尔消光系数(也被称为摩尔吸收率)、以及传播通过血红蛋白的光路的距离来确定，并 且可由以下关系来表示OD = ε cL其中ε =血红蛋白摩尔消光系数，C=血红蛋白浓度，以及L=传播通过RBC 22(即，细胞内的血红蛋白)的距离。摩尔消光系数是血红蛋白的固有特性，可以由实验方法或者通过当前可获得的经验数据导出。在利用具有误差容限的光源(例如，具有设定的额定波长加上或减去某一数量的波长的LED)的分析设备的实施例中，为了精确的目 的，初始校正设备并且确定血红蛋白摩尔消光系数是有用的，然后该摩尔消光系数可与 该特定设备结合使用，直到该光源被替换为止，此时可以重新校准该设备。所检测到的光信号(即，OD值)可被边缘检测算法(edge finding algorithm)用 来识别RBC的位置和边界。与腔室10的两个内表面都接触的RBC 22的OD分布类似于 被部分压缩的球体的OD分布。与表面14、18不接触的细胞22的横向边缘的OD(相对 而言)可以认为趋近于O。所确定的OD的值如下1)在朝向RBC 22的中心的方向上行 进时(即，随着通过细胞的光传输路径增大)增大；2)在RBC与平板内表面14、18接 触时(即，当通过RBC的光传输路径恒定时)，达到最大值并且基本上保持恒定；以及 3)在远离RBC 22的中心的方向上行进时(即，随着通过细胞的光传输路径减小)减小。 RBC的OD分布的这种表征对于球状的RBC来说尤其一致，并且不限于与两个内表面都 接触的那些RBC。在一些实施例中，分析设备44还适于确定与两个内表面都接触的一组RBC 22 和/或RBC聚合体23的平均最大OD值。可以基于每个样本分析来确定与所述内表面 接触的可接受组大小的一组RBC和/或RBC聚合体的构成，或者可以针对同一类型(例 如，人类血液样本)的“η”个样本分析周期性地进行这种确定。例如，可以对被识别为 与两个内表面14、18都接触的一组RBC 22进行比较估计，以确定该组内的平均最大OD 和OD的统计偏差。希望确定平均最大0D，这是因为细胞22内的血红蛋白的OD即使在 一个特定样本内也会根据细胞而发生变化。如果标准偏差大于预定阈值，则可以选择与 两个平板12、16都接触的新的一组RBC 22，或者可以扩大现有的组，直到上述分析建立 了这样一组RBC 22，S卩，该组RBC 22的平均最大OD具有可接受的标准偏差。例如， 一组内的RBC 22的平均最大0D，如果大约为加上或减去该样本内与两个表面14、18都 接触的所有RBC的平均最大OD的百分之一(1%)，则处于可接受的标准偏差值内。然 而，可以根据当前的应用和正在使用的特定统计分析(例如，标准误差等)来改变可接受 的标准偏差值的构成。可以获得与RBC 22的OD相关的现有统计数据并且可以将其用 于确定可接受的OD统计值。对一个特定组内的RBC的平均最大OD是否处于临床上可 接受的标准偏差内的确定也是适应性的，这是由于，如上所述，公知的是个体内的RBC 族群通常在血红蛋白浓度上的变化很�。⑶铱梢允褂酶媒峁牧�(raiming)标准偏差 来确定在获得可接受准确性的平均值之前必须检查多少细胞；例如，对于来自具有正常 血液特征的对象的样本，可接受的组大小可以仅仅为100个RBC，而来自具有异常血液 特征的对象的样本可能需要分析1000个或更多个RBC。用于确立可接受的平均最大OD 的、与两个内表面都接触的特定数目的RBC 22和/或RBC聚合体23不限于样本内的任 何具体数目或者百分比的RBC 22和/或RBC聚合体23，并且可以包括与两个表面14、 18都接触的所有(例如，成千上万个)RBC 22和/或RBC聚合体23。现在参照图9和10，分析设备44还适于通过检查与腔室10的两个内表面14、 18都接触的RBC 22的一部分25来确定RBC 22的血红蛋白浓度(“CHC” )。血红蛋 白浓度在任何给定的RBC 22内都是一致的。基于每个像素(或者其他图像单位)来确定 OD值。每个像素的OD信号表示可归因于与该像素“对准”的腔室部分的高度“L”的OD信号。在确定CHC的过程中，感测0D、已知或者可以确定腔室的高度，以及已 知血红蛋白摩尔消光系数(O。因此，使用光密度(OD)、血红蛋白消光系数(O、以 及通过血红蛋白的路径长度(L)之间的关系来确定CHC，其中，对于与腔室的内表面接 触的RBC 22的一部分25来说，通过血红蛋白的路径长度(L)等于腔室的高度OD = ε cL, C = OD/ ε L。使用以下步骤来确定RBC 22的平均细 胞血红蛋白浓度(“MCHC”)使用上 述用于确定单个RBC的CHC的同样方法，针对与腔室的两个内表面都接触的一些RBC 重复该方法，使用这些结果来确定平均值和可接受的标准偏差。现在参照图9和11，分析设备44还适于通过整合(integrating)作为RBC内血红 蛋白的OD的函数的RBC体积来确定与腔室10的两个内表面都接触的单个RBC 22的细 胞体积(“CV”)。可以通过使用各种分析技术来执行体积的整合。例如，根据第一 技术，可以使用腔室高度20、为被成像的RBC 22上与两个内表面14、18接触的部分25 确定的平均最大光密度、以及为整个被成像的RBC 22确定的光密度来确定与两个内表面 14、18都接触的单个RBC 22的细胞体积。被成像的RBC的总的光密度除以平均最大光 密度，并且针对腔室高度来校正该结果。根据另一个技术，通过将单个RBC 22划分成 不同的部分来确定细胞体积与两个表面接触的部分25( “区域I”)，以及不与内表面 14、18中的任何一个接触的部分27( “区域II”)。通过感测部分25(S卩，区域I)的OD 来确定细胞上与内表面14、18接触的部分25的体积。该OD是基于每个像素(或者其 他图像单位)来进行感测和定义的。如上所述，通过作为仪器放大系数的函数的每个像 素的图像大小来确定由该像素表示的腔室面积。因此，与该像素相关的体积是每个像素 的图像面积与已知腔室高度的乘积，这是因为腔室中被感测的点是RBC 22延伸贯穿整个 腔室高度20的点。通过对与两个表面接触面积内的每个像素相关的体积求和来确定与两 个表面14、18接触的RBC部分25 (S卩，区域I)的体积。以类似的方式确定RBC 22上 不与两个表面14、18接触的部分27(即，区域II)的体积。对为两个表面接触面积确定 的OD值和为不与两个表面14、18接触的RBC 22的部分27 (即，区域II)内的每个像素 确定的OD值进行比较。由于血红蛋白摩尔消光系数(ε )是线性函数，则区域II内的每 个像素的相对OD值也表示与该像素相关的RBC 22的高度；例如，如果该像素的OD是 区域I中的OD的50%，则该点处的RBC 22的高度就是区域I中的RBC高度(即，腔室 高度20)的50%。如上所述，基于每个像素来确定与区域II中的每个像素相关的体积并 且将所确定的体积进行求和以确定RBC 22的区域II中的体积。RBC 22的体积是区域I 和II的和。减小每个像素上的图像面积(即，增大分辨率)可以提高细胞体积确定的准 确性。提供这些技术作为可使用技术的示例，然而本发明不限于这些技术。用于确定细胞体积的上述技术可用于确定为获得OD而感测的特定RBC 22的体 积。由于RBC 22内的血红蛋白的OD即使在一个特定样本内也会根据RBC的不同而不 同，因此，使用针对特定细胞感测到的OD来确定细胞22的体积可以提高体积确定的准 确性。然而，大量RBC 22不与腔室10的两个内表面14、18都接触。对于不与两个表面 都接触的那些RBC 22，可以使用先前获得的与两个表面14、18都接触的RBC 22的平均 最大光密度来确定细胞体积。如所述获得的平均最大光密度的准确性足以提供那些其他 细胞22的准确体积。作为进一步的选择，对于本发明的那些利用等容球状试剂的实施例来说，还可以通过假定上述的RBC片段或RBC是球状的来确定与两个内表面14、18不 接触的RBC片段或RBC 22的细胞体积。如果可以使用上述剖析技术(profiling technique) 来确定RBC 22的周长，则可以使用该圆形面积来确定球体的大�。佣范≧BC 22的 体积。
分析设备44还适于使用以下步骤来确定样本内的RBC 22的平均细胞体积 (“MCV” )使用上述的同样方法，针对一些RBC重复该方法，使用这些结果来确定 平均值以及该平均值的准确性或置信度的度量(例如，可接受的平均值的标准误差)。确 定具有可接受的准确性度量的MCV所需要的RBC数目取决于所分析的RBC族群，该数 目范围可以为从大约几百个到几千个RBC 22。用于确定已经确定了其细胞体积的RBC 数目是否是为了确定MCV而可接受的族群的一种方法是迭代地确定该族群内的样本平均 细胞体积并且确定这些平均值的标准误差(即，平均值的标准偏差)。一旦准确性度量 (例如，标准误差)处于预定的可接受范围内，则接受该MCV。现在参照图9和12，分析设备44还适于通过对所确定的单个RBC 22占据的体 积上的血红蛋白浓度进行积分来确定RBC 22的细胞血红蛋白含量(“CH”)。对于与 腔室10的两个内表面14、18都接触的那些RBC 22来说，使用如上所述的针对特定RBC 22确定的浓度(CHC)和体积(CV)来确定CH。如果基于单个RBC 22来确定CH，则可 以使用为该特定RBC 22确定的CHC而不使用平均CHC(MCHC)来确定CH，从而提高 精确度。对于不与腔室10的两个内表面14、18接触的那些RBC22，通过使用平均最大 光密度确定针对该特定RBC 22的浓度和体积来确定CH。分析设备44还适于通过以下步骤来确定样本内RBC 22的平均细胞血红蛋白含 量(“MCH”)使用上述的同样方法，针对一些RBC 22重复该方法，使用这些结果来 确定平均值以及可接受的准确性度量(例如，平均值的标准误差)。确定具有可接受的准 确性度量的MCH所需要的RBC数目取决于所分析的RBC族群，该数目范围可以从大约 几百个RBC 22到几千个RBC 22。一旦准确性度量(例如，标准误差)处于可接受的范 围内，则接受该MCH。用于确定CHC、MCHC> CV> MCV> CH和MCH的上述方法是本发明如何使
用所述腔室和分析设备来确定基本上未稀释的血液样本的这些特征的示例。本发明不限 于这些特定示例。根据本发明的方法，如上所述，基本上未稀释的全血样本被置于腔室10中。在 将样本引入腔室之前或者在将样本引入腔室时，将抗凝血剂(在一些实例中为等容球状 试剂和/或凝聚剂)与样本混合。以干粉或半干粉形式(例如通过表面涂覆)添加的试 剂尤其易于使用。但是，本发明不限于干粉形式的试剂，例如可以使用不会有意图地稀 释样本的液态试剂。样本静止地停留在腔室中。在某些情况下(例如，非�？焖俚姆� 析)，可以不必添加抗凝血剂，但是在大多数情况下，添加抗凝血剂是优选的，以确保样 本处于分析可接受的形式。在某些分析(例如，提供有关单个RBC的信息)中，可能优 选的是不包括凝聚剂。使用分析设备44，通过使光透射穿过样本并且检测透射光，来对静止停留在腔 室10内的样本的至少一部分成像。虽然不要求对停留在腔室10内的整个样本进行成像， 但是这是优选的，因为这么做通常会提供对样本(以及其所有组分)的更全面的分析并且伴随着准确性的提 高，这是因为对于基本上未稀释的全血样本来说，腔室内的RBC 22和 没有RBC的区域24的分布通常是不均勻的。通过分析设备44，使用样本部分的图像来确定与腔室10的内表面12、16相接触 的一组RBC 22。取决于被请求的血液样本的特征，分析设备44将确定一个或多个特征 值来得出被请求的特征值。本发明的优点是不必使样本内的所有RBC 22都与每个腔室平板接触。可以仅使 用与腔室10的两个内表面14、18都接触的一些RBC22来执行该方法。不使用较小的RBC 22和RBC片段来校准该分析，但是测量 它们对红细胞压积的贡献。另外，根据本发明，可以确定样本的CHC、MCHC> CV、 MCV、CH和MCH，而不需要知晓腔室10内的样本的总面积或体积。根据本发明识别和分析的RBC 22包括网状细胞(未成熟的红细胞)，该细胞在 骨髓中生长成为有核细胞。在网状细胞释放到循环之前，剥去它们的核。网状细胞在失 去它们的网状染色(为细胞质RNC和细胞核DNA的染色残留部分的功能)之前在血流中 循环大约一天并且生长为基本上只包含血红蛋白的成熟RBC 22。血液样本内的网状细胞 的相对数目是各种状态的重要指标。例如，网状细胞数目是骨髓红细胞生产活动的良好 指标，这是因为它代表最近的生产。异常低的绝对网状细胞数目表示再生障碍性贫血、 恶性贫血、骨髓肿瘤、红细胞生成素生产问题、各种维生素或者矿物质缺乏症(B9、 B12、以及铁)等。异常高的绝对网状细胞数量可以表示由于身体对出血或溶血所引起的 失血进行补充所导致的快速生产。因此，能够检测和计数网状细胞有重要的价值。根据 本发明，网状细胞被识别为RBC 22，这是因为它们包含有血红蛋白，并且因为可以对它 们进行染色以识别剩余的RNA和DNA。还可以通过将样本与诸如体外活体染料(如吖啶橙、astrozone orange等)之类的
着色剂掺合来将网状细胞与其他RBC 22区分开并且对网状细胞进行计数。该染料使自 然存在于网状细胞内的网状蛋白在被约470nm的紫光激发时发出荧光。通过由于所有网 状细胞中包含的血红蛋白引起的并且根据样本图像来确定的RBC光密度，可以确定RBC 22在静止样本内的位置。可以通过在与体外活体染料相关的一个或多个被选波长(例 如470nm)下对样本成像并且在荧光下对样本进行检查来将网状细胞与不包含网状蛋白的 RBC 22和白细胞区分开。对于通过血红蛋白的存在和网状蛋白的荧光而被识别为网状细 胞的那些RBC，可以使用用于确定细胞体积、细胞血红蛋白含量、以及细胞血红蛋白浓 度的上述方法来确定各个网状细胞的这些特征。另外，可以确定统计信息(例如，平均 值和准确性度量)。还可以通过荧光信号的强度来确定每个网状细胞内的网状细胞的相对 量，该相对量与网状细胞的成熟度成反比。因此，可以确定与单个网状细胞以及网状细 胞的族群有关的甚至更加具体的信息。可以使用荧光面积或荧光强度来确定单个网状细 胞中的网状蛋白的相对量，并且可以作为单个网状细胞的体积的函数来计算该相对量。使用本发明，还可以在包含或排除网状细胞的情况下确定RBC指数。例如，可 以在包括和不包括网状细胞贡献的体积的两种情况下都绘制样本的MCV。在没有网状细 胞的情况下确定MCV可以揭示受大尺寸网状细胞影响的族群小红细胞症。可以确定RBC 和网状细胞之间的多种其他数学关系。如上所述，根据本发明，可以为不与两个平板内表面14、18接触的RBC 22确定各个指数。可以以同样的方式分析RBC片段，从而使得能够将RBC片段与血液样本 内发现的其他组分(例如，血小板、血小板凝块、白细胞片段、剩余物等)区分开。使 用本发明检测RBC片段的能力尤其有用，这是因为RBC片段可以表示诸如微血管病性溶 血性贫血、重度炎症、以及弥散性恶性肿瘤之类的状态。没有经过等容球状试剂处理的 血液样本内的RBC片段的分析例如可以包括形态分析以确定未被改变的形态特征，例如 大小确定、与圆度的偏差、周长与面积之比等。使用本发明产生的OD图像能够确定每 个RBC片段的诸如圆度、椭圆度、突出度等之类的特征，这些特征有助于上述的形态分 析。另外，通过测量红细胞片段的直径或周长并且用这些尺寸计算球体的体积，可以确 定红细胞片段的体积。 虽然已经通过本发明的具体实施例示出和描述了本发明，但是所属领域的技术人员应当理解在不脱离本发明的思想和范围的情况下可以在形式上或细节上进行各种变 化。
权利要求
1.一种用于确定血液样本内的红细胞血红蛋白浓度的方法，包括以下步骤将样本滴落在适于静止保持样本以进行分析的分析腔室中，所述腔室由第一平板的 内表面和第二平板的内表面限定，其中两个平板都是透明的，并且所述腔室具有在两个 平板的内表面之间延伸的已知高度或者可确定的高度，该高度使得样本内的至少一个红 细胞与两个内表面都接触；对与两个内表面都接触的所述至少一个红细胞成像； 确定被成像的红细胞上与两个内表面接触的至少一部分的光密度；以及 使用所确定的光密度来确定与内表面接触的红细胞的血红蛋白浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述光密度是基于每个图像单位来确定的。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述图像单位是像素。
4.如权利要求1所述的方法，进一步包括以下步骤确定与内表面接触的多个红细胞的血红蛋白浓度；以及使用为所述多个红细胞中的每一个红细胞确定的血红蛋白浓度来确定平均血红蛋白 浓度。
5.如权利要求4所述的方法，其中对整个样本成像。
6.如权利要求1所述的方法，进一步包括在至少一部分样本中掺合等容球状试剂的步骤。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述等容球状试剂是两性离子去污剂。
8.如权利要求7所述的方法，其中两个平板的内表面实质上是平行的，并且在确定血 红蛋白浓度之前已知腔室高度。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述腔室高度处在大约2微米到6微米之间的范围内。
10.如权利要求1所述的方法，进一步包括以下步骤对多个红细胞成像，每个这种红细胞的至少一部分与内表面接触； 确定每个这种红细胞上与两个内表面接触的这部分的光密度； 使用为所述多个红细胞中的至少一些确定的光密度来确定平均最大光密度；以及 使用所确定的平均最大光密度，来确定样本内不与两个内表面都接触的一个或多个 红细胞的血红蛋白浓度。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述样本具有掺合有等容球状试剂的第一部分和 没有掺合等容球状试剂的第二部分。
12.如权利要求11所述的方法，其中不与两个内表面都接触的一个或多个红细胞中的 至少一些存在于样本的第二部分内，并且该方法进一步包括确定处于第二部分内的不与 两个内表面都接触的一些红细胞的未改变的形态的步骤。
13.如权利要求1所述的方法，进一步包括在样本中掺合体外活体染料的步骤，该 染料用于使样本内的网状细胞内的网状蛋白在被一个或多个预定波长的光激发时发出荧 光。
14.如权利要求13所述的方法，进一步包括利用荧光面积或者荧光强度来确定一个或 多个发出荧光的网状细胞内的网状蛋白的相对量的步骤。
15.如权利要求13所述的方法，进一步包括以下步骤对多个红细胞进行成像，每个这种红细胞的至少一部分与内表面接触，其中使用至 少一个或多个预定波长的光执行该成像，所述至少一个或多个预定波长的光被红细胞内 的血红蛋白吸收；以用于使得网状细胞内的网状蛋白发出荧光的预定波长对所述多个红细胞进行成像；确定每个这种红细胞上与两个内表面接触的部分的光密度；使用所确定的光密度值，来确定所述多个红细胞中除了发出荧光的那些红细胞之外 的每个红细胞的血红蛋白浓度；以及使用为所述多个红细胞中除了发出荧光的那些红细胞之外的每个红细胞所确定的血 红蛋白浓度，来确定平均血红蛋白浓度。
16.如权利要求1所述的方法，其中在一个或多个预定波长下执行成像步骤，并且血 红蛋白浓度的确定利用了针对所述一个或多个预定波长的血红蛋白的摩尔消光系数。
17.如权利要求16所述的方法，其中使用分析设备执行成像步骤，该分析设备被校准 以确定针对该分析设备的经过校准的血红蛋白摩尔消光系数值。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述血液样本实质上是未稀释的。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述血液样本是全血。
20.一种用于确定血液样本内的红细胞的细胞体积的方法，包括以下步骤将样本滴落在适于静止地保持样本以进行分析的分析腔室中，该腔室由第一平板的 内表面和第二平板的内表面限定，其中两个平板都是透明的，并且所述腔室具有在两个 平板的内表面之间延伸的已知高度或可确定的高度，该高度使得样本内的至少一个红细 胞与两个内表面都接触；对与两个内表面都接触的所述至少一个红细胞成像，并且产生图像信号； 基于每个图像单位来确定该红细胞上与两个内表面接触的部分的平均光密度以及该 红细胞的总的光密度；以及使用细胞上与内表面接触的部分的平均光密度、总的光密度和所述腔室的高度，来 确定被成像的红细胞的体积。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述血液样本实质上是未稀释的。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述血液样本是全血。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述图像单位是像素。
24.一种用于确定血液样本内的红细胞的细胞体积的方法，包括以下步骤将血液样本滴落在适于静止地保持样本以进行分析的分析腔室中，该腔室由第一平 板的内表面和第二平板的内表面限定，其中两个平板都是透明的，并且所述腔室具有在 两个平板的内表面之间延伸的已知高度或可确定的高度，该高度使得样本内的至少一个 红细胞与两个内表面都接触；对与两个内表面都接触的所述至少一个红细胞成像，所述至少一个红细胞包括该红 细胞上与两个表面接触的部分和不与两个内表面接触的部分；基于每个图像单位，来确定红细胞上与两个内表面接触的部分的光密度，以及不与 两个内表面接触的部分的光密度；使用为被成像的红细胞上与两个内表面接触的部分确定的每个图像单位的光密度，来确定该部分的体积；使用为被成像的红细胞上不与两个内表面接触的部分确定的每个图像单位的光密度 和为与两个内表面接触的部分确定的每个图像单位的光密度，来确定被成像的红细胞上 不与两个内表面接触的部分的体积；以及使用为被成像的红细胞上与两个内表面接触的部分确定的体积和为被成像的红细胞 上不与两个内表面接触的部分确定的体积，来确定所述至少一个红细胞的细胞体积。
25.如权利要求M所述的方法，包括以下步骤确定与两个内表面都接触的多个红细胞的细胞体积；以及 使用为所述多个红细胞中的每个红细胞确定的细胞体积，来确定平均细胞体积。
26.如权利要求M所述的方法，其中对整个样本进行成像。
27.如权利要求M所述的方法，进一步包括在至少一部分样本中掺合等容球状试剂的步骤。
28.如权利要求27所述的方法，所述等容球状试剂是两性离子去污剂。
29.如权利要求M所述的方法，其中两个平板的内表面实质上是平行的，并且在确定 血红蛋白浓度之前已知腔室高度。
30.如权利要求四所述的方法，其中所述腔室高度处于大约2微米到6微米的范围内。
31.如权利要求M所述的方法，进一步包括以下步骤对样本内的多个红细胞成像，每个红细胞的一部分与两个内表面接触； 基于每个图像单位，为每个红细胞确定该红细胞上与两个内表面接触的部分的光密 度；以及使用为所述多个红细胞中的每个红细胞上与两个内表面接触的部分确定的光密度， 来确定平均最大光密度。
32.如权利要求31所述的方法，进一步包括以下步骤 对不与两个内表面都接触的一个或多个红细胞成像； 确定不与两个内表面都接触的红细胞的光密度；使用不与两个内表面都接触的红细胞的光密度、所确定的平均最大光密度、和腔室 高度，来确定不与两个内表面都接触的所述一个或多个红细胞的细胞体积。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述样本具有掺合有等容球状试剂的第一部分和 没有掺合等容球状试剂的第二部分。
34.如权利要求33所述的方法，其中不与两个内表面都接触的所述一个或多个红细胞 中的至少一些红细胞存在于样本的第二部分内，以及该方法进一步包括确定第二部分内 不与两个内表面都接触的所述一个或多个红细胞中的至少一个红细胞的未改变的形态。
35.如权利要求31所述的方法，进一步包括以下步骤 对不与两个内表面都接触的至少一个红细胞成像； 确定不与两个内表面都接触的红细胞的光密度；使用为与两个内表面都接触的红细胞确定的平均光密光，来确定不与两个内表面都 接触的红细胞的血红蛋白浓度。
36.如权利要求M所述的方法，进一步包括在样本中掺合体外活体染料的步骤，该染料可用于使样本内的网状细胞内的网状蛋白被一个或多个预定波长的光激发时发出荧光。
37.如权利要求36所述的方法，进一步包括确定一个或多个发出荧光的网状细胞内的 网状蛋白的相对量的步骤。
38.如权利要求36所述的方法，进一步包括以下步骤对多个红细胞成像，每个这种红细胞的至少一部分与内表面接触，其中使用被红细 胞内的血红蛋白吸收的光来执行该成像；以用于使得样本内的网状细胞内的网状蛋白发出荧光的预定波长对所述多个红细胞 成像；为所述多个红细胞中的每个红细胞确定细胞体积；以及使用所述多个红细胞中的每个红细胞的细胞体积来确定平均细胞体积，从该平均细 胞体积中排除发出荧光的每个红细胞的细胞体积。
39.如权利要求M所述的方法，其中以一个或多个预定波长执行成像步骤，并且血红 蛋白浓度的确定利用了针对所述一个或多个预定波长的血红蛋白的摩尔消光系数。
40.如权利要求M所述的方法，进一步包括以下步骤使用为红细胞上与两个内表面接触的部分确定的光密度，来确定红细胞的血红蛋白 浓度；以及使用血红蛋白浓度和细胞体积，来确定红细胞内的血红蛋白含量。
41.如权利要求40所述的方法，进一步包括以下步骤确定多个红细胞内的血红蛋白含量，每个红细胞的一部分与两个内表面接触； 使用为所述多个红细胞中的每个红细胞确定的血红蛋白含量，来确定平均血红蛋白含量。
42.如权利要求M所述的方法，其中所述血液样本实质上是未稀释的。
43.如权利要求M所述的方法，其中所述血液样本是全血。
44.如权利要求M所述的方法，其中所述图像单位是像素。
45.—种用于确定具有多个红细胞的实质上未稀释的血液样本内的红细胞血红蛋白浓 度的设备，包括分析腔室，适于静止地保持样本以进行分析，所述腔室由第一平板的内表面和第二 平板的内表面限定，其中两个平板都是透明的，并且所述腔室具有在两个平板的内表面 之间延伸的已知高度或者可确定的高度，该高度使得样本内的一个或多个红细胞将与两 个内表面都接触；成像单元，其包括照明器和析像器，该单元用于对与内表面接触的一个或多个红细 胞进行成像，并且产生表示这种被成像的红细胞的图像信号；以及可编程分析器，适于基于每个图像单位，使用所述图像信号来确定被成像的红细胞 上与两个内表面接触的至少一部分的光密度，并且使用所确定的光密度来确定与内表面 接触的红细胞的血红蛋白浓度。
46.—种用于确定实质上未稀释的血液样本内的至少一个红细胞的细胞体积的设备， 包括分析腔室，适于静止地保持样本以进行分析，所述腔室由第一平板的内表面和第二平板的内表面限定，其中两个平板都是透明的，并且所述腔室具有在两个平板的内表面 之间延伸的已知高度或可确定的高度，所述高度使得所述至少一个红细胞与两个内表面 都接触；成像单元，其包括照明器和析像器，该单元用于对与内表面接触的至少一个红细胞 进行成像，并且产生表示该被成像的红细胞的图像信号；以及可编程分析器，适于使用所述图像信号来确定与两个内表面都接触的红细胞的平均 光密度和该红细胞的总的光密度，并且使用平均光密度、总的光密度和腔室的高度来确 定该被成像的红细胞的体积。
全文摘要
用于确定红细胞内的血红蛋白的浓度的方法及设备。将未稀释的、全血样本滴落在透明的分析腔室(10)中，该分析腔室的高度使得红细胞与两个表面(14，18)接触。然后，测量红细胞上与两个表面接触的部分的光密度。根据该光密度和血红蛋白的已知差异系数来计算红细胞的血红蛋白浓度。对其他细胞重复该操作，直到能够可靠地确定平均血红蛋白浓度。从属权利要求包括利用两性离子等容球状试剂来使得该测量与几何形状因子无关。
文档编号G01N33/49GK102027368SQ200980116926
公开日2011年4月20日 申请日期2009年3月20日 优先权日2008年3月21日
发明者尼滕·V·拉尔普里亚, 斯蒂芬·C·沃德洛, 杰里米·R·希尔, 罗伯特·A·莱文, 达瑞恩·W·温弗里希特 申请人:艾博特健康公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
