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专利名称：一种大叶藻胚石蜡切片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种石蜡切片的制作方法，尤其涉及一种大叶藻胚的石蜡切片制作方法。
背景技术：
大叶藻(Zostera marina L.)俗称海带草，是海洋高等种子植物，属于被子植物 门(Angiospermae)，单子叶植物纲(Monocotyledoneae，或称百合纲Liliopsida)，泽泻目 (Alismales)，眼子菜科(Potamogetonaceae)，大叶藻属(Zostera L.)，大叶藻能够在海洋 中进行沉水生活，和陆地的高等植物一样能进行光合作用，用种子来繁殖后代。为适应海洋 沉水环境，大叶藻种子植物的内部组织结构与陆生种子植物具有较大差异，比如细胞膜上 有强大的Na、K泵结构，表皮细胞排列紧密，细胞壁较厚，水分不易被完全置换，细胞具有高 渗透压，水分含量高等差别。正因为大叶藻种子与陆生种子存在上述差别，而现有石蜡切片 方法主要用于陆生植物，利用现有的石蜡切片方法获得的大叶藻胚石蜡切片染色不清晰， 组织结构不完整。究其原因，现有石蜡切片方法制作的大叶藻胚石蜡切片固定时间短，组织 容易变形；脱水时间短，组织不能完全透明，也就不能完全浸蜡；浸蜡时间长，易使组织变 脆变硬，不能切出完整、清晰的石蜡切片。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种染色清晰，组织结构完整的大叶藻胚石蜡 切片制作方法。本发明要解决的技术方案是一种大叶藻胚的石蜡切片制作方法，其步骤是一种大叶藻胚石蜡切片的制作方法，其步骤是(1)取材与固定将去掉胚乳后获得的完整大叶藻胚浸入FAA固定液中固定48小 时以上；(2)脱水大叶藻胚自固定液中取出后先入50%浓度酒精中浸泡3次，每次5分 钟，然后依次入50 %浓度酒精、70 %浓度酒精、80 %浓度酒精、95 %浓度酒精、无水乙醇中浸 泡脱水，各级浸泡脱水2小时，每梯度需更换同浓度酒精3 4次；脱水后的大叶藻胚再依 次入体积比为1 1的无水乙醇和二甲苯的混合液浸泡30分钟，在二甲苯中第1次浸泡5 分钟，在二甲苯中第2次浸泡5分钟；(3)浸蜡与包埋在盛有大叶藻胚和二甲苯的容器中渐次加入石蜡，当二甲苯与 石蜡的体积比为1 1时开始浸泡30分钟，再转入融化的纯石蜡中浸泡3次，每次放置30 分钟，将充分透蜡后的大叶藻胚放入恒温箱中保持58°C，进行常规石蜡包埋，获得含有大叶 藻胚的蜡块；(4)切片、展片、烘干将包有大叶藻胚的蜡块固定在轮转式切片机上进行石蜡连 续切片，得到蜡带，切片厚度为10微米，将蜡带置于水浴锅中展片，水浴锅温度为40°C，蜡 带受热摊平完全展开后，将涂有甘油蛋白的载玻片插入水里，让蜡带附在载玻片上，室温晾干或者放到35°C恒温箱中烘干获得切片；(5)脱蜡、复水、苏木精染色干燥后的切片入二甲苯中第1次脱蜡20分钟，在二 甲苯中第2次脱蜡10分钟，脱蜡后的切片依次入体积比为1 1的二甲苯与无水乙醇的混 合液、无水乙醇、95 %浓度的酒精、80 %浓度的酒精、70 %浓度的酒精、50 %浓度的酒精中各 浸泡5分钟，再入蒸馏水中浸洗两次，每次5分钟，完成复水，复水后的切片经苏木精染液染 色5分钟，最后用水冲洗15分钟；(6)切片脱水、伊红酒精染色染色后的切片经蒸馏水浸洗两遍，依次入50%浓度 的酒精、70%浓度的酒精、80%浓度的酒精中各浸泡5分钟进行脱水处理，脱水后的切片入 事先配好备用的10%伊红酒精溶液染色1分钟，然后依次经过第1次95%浓度的酒精、第 2次95%浓度的酒精、第1次无水乙醇、第2次无水乙醇中各浸泡5分钟；(7)透明、封片将染色后的切片分别入体积比为1 1的二甲苯与无水乙醇混合 液浸泡5分钟、第1次二甲苯浸泡10分钟、第2次二甲苯浸泡20分钟进行透明处理，切片 从二甲苯中取出后，擦去切片周围的二甲苯，在二甲苯未挥发完之前，在切片中央滴一滴中 性加拿大树胶，盖上盖玻片，通风干燥，制成永久制片。在所述步骤(1)中，所述FAA固定液按50%浓度的酒精18体积份、冰醋酸1体积 份、37%浓度的福尔马林1体积份比例配置。在所述步骤(4)中，所述甘油蛋白按甘油和鸡蛋清以体积比1 1的比例配制。在所述步骤(5)中，所述苏木精染液按如下比例配置，每95毫升蒸馏水取苏木精 0. 8克，将苏木精溶于蒸馏水中，然后加入7. 5克研磨后的硫酸铝铵(铵明矾)，待铵明矾溶 解后依次加入0. 1克碘酸钠、45毫升甘油和3毫升冰醋酸即可获得苏木精染液。在所述步骤(6)中，10%的伊红酒精溶液按如下比例配置，每100毫升95%浓度的 酒精取10克署红，将署红溶于95%浓度的酒精即可获得伊红酒精溶液。本发明的技术效果是表一为现有石蜡切片方法与本发明石蜡切片方法的区别， 以及本发明石蜡切片具有的技术效果。表1现有石蜡切片方法与本发明石蜡切片方法的切片效果及原因
权利要求
1.一种大叶藻胚石蜡切片的制作方法，其步骤是(1)取材与固定将去掉胚乳后获得的完整大叶藻胚浸入FAA固定液中固定48小时以上；(2)脱水大叶藻胚自固定液中取出后先入50%浓度酒精中浸泡3次，每次5分钟，然 后依次入50 %浓度酒精、70 %浓度酒精、80 %浓度酒精、95 %浓度酒精、无水乙醇中浸泡脱 水，各级浸泡脱水2小时，每梯度需更换同浓度酒精3 4次；脱水后的大叶藻胚再依次入 体积比为1 1的无水乙醇和二甲苯的混合液浸泡30分钟，在二甲苯中第1次浸泡5分钟， 在二甲苯中第2次浸泡5分钟；(3)浸蜡与包埋在盛有大叶藻胚和二甲苯的容器中渐次加入石蜡，当二甲苯与石蜡 的体积比为1 1时开始浸泡30分钟，再转入融化的纯石蜡中浸泡3次，每次放置30分 钟，将充分透蜡后的大叶藻胚放入恒温箱中保持58°C，进行常规石蜡包埋，获得含有大叶藻 胚的蜡块；(4)切片、展片、烘干将包有大叶藻胚的蜡块固定在轮转式切片机上进行石蜡连续切 片，得到蜡带，切片厚度为10微米，将蜡带置于水浴锅中展片，水浴锅温度为40°C，蜡带受 热摊平完全展开后，将涂有甘油蛋白的载玻片插入水里，让蜡带附在载玻片上，室温晾干或 者放到35°C恒温箱中烘干获得切片；(5)脱蜡、复水、苏木精染色干燥后的切片入二甲苯中第1次脱蜡20分钟，在二甲苯 中第2次脱蜡10分钟，脱蜡后的切片依次入体积比为1 1的二甲苯与无水乙醇的混合液、 无水乙醇、95 %浓度的酒精、80 %浓度的酒精、70 %浓度的酒精、50 %浓度的酒精中各浸泡5 分钟，再入蒸馏水中浸洗两次，每次5分钟，完成复水，复水后的切片经苏木精染液染色5分 钟，最后用水冲洗15分钟；(6)切片脱水、伊红酒精染色染色后的切片经蒸馏水浸洗两遍，依次入50%浓度的酒 精、70%浓度的酒精、80%浓度的酒精中各浸泡5分钟进行脱水处理，脱水后的切片入事先 配好备用的10%伊红酒精溶液染色1分钟，然后依次经过第1次95%浓度的酒精、第2次 95%浓度的酒精、第1次无水乙醇、第2次无水乙醇中各浸泡5分钟；(7)透明、封片将染色后的切片分别入体积比为1 1的二甲苯与无水乙醇混合液浸 泡5分钟、第1次二甲苯浸泡10分钟、第2次二甲苯浸泡20分钟进行透明处理，切片从二 甲苯中取出后，擦去切片周围的二甲苯，在二甲苯未挥发完之前，在切片中央滴一滴中性加 拿大树胶，盖上盖玻片，通风干燥，制成永久制片。
2.根据权利要求1所述一种大叶藻胚石蜡切片的制作方法，其特征在于在所述步骤 (1)中，所述FAA固定液按50%浓度的酒精18体积份、冰醋酸1体积份、37%浓度的福尔马 林1体积份比例配置。
3.根据权利要求1所述一种大叶藻胚石蜡切片的制作方法，其特征在于在所述步骤中，所述甘油蛋白按甘油和鸡蛋清以体积比1 1的比例配制。
4.根据权利要求1所述一种大叶藻胚石蜡切片的制作方法，其特征在于在所述步骤 (5)中，所述苏木精染液按如下比例配置，每95毫升蒸馏水取苏木精0. 8克，将苏木精溶于 蒸馏水中，然后加入7. 5克研磨后的硫酸铝铵，待硫酸铝铵溶解后依次加入0. 1克碘酸钠、 45毫升甘油和3毫升冰醋酸即可获得苏木精染液。
5.根据权利要求1所述一种大叶藻胚石蜡切片的制作方法，其特征在于在所述步骤(6)中，10%的伊红酒精溶液按如下比例配置，每100毫升95%浓度的酒精取10克署红，将 署红溶于95%浓度的酒精即可获得伊红酒精溶液。
全文摘要
本发明公开了一种大叶藻胚石蜡切片的制作方法，其步骤是(1)取材与固定取大叶藻种子，剥去果皮，去掉胚乳后获得完整大叶藻胚浸入FAA固定液中固定48小时以上；(2)脱水大叶藻胚自固定液中取出后先入酒精中浸泡脱水；(3)浸蜡与包埋在盛有大叶藻胚和二甲苯的容器中渐次加入石蜡，并进行常规石蜡包埋，获得含有大叶藻胚的蜡块；(4)切片、展片、烘干将包有大叶藻胚的蜡块固定在轮转式切片机上进行石蜡连续切片，得到蜡带，让蜡带附在载玻片上；(5)脱蜡、复水、苏木精染液染色；(6)切片脱水、伊红酒精染色；(7)透明、封片，制成永久制片。本发明能够得到染色清晰，组织结构完整的大叶藻胚石蜡切片。
文档编号G01N1/06GK102116711SQ20111004118
公开日2011年7月6日 申请日期2011年1月31日 优先权日2011年1月31日
发明者刘延岭, 吴萌萌, 崔翠菊, 李慧, 李霞, 梁广津, 王宏梅, 田萍萍, 钱冠兰, 钱瑞 申请人:山东东方海洋科技股份有限公司