专利名称：实时荧光pcr中目的基因的表达量的校正方法
技术领域：
:本发明涉及实时荧光PCR中目的基因的表达量的校正方法，属于分子生物学领域。
背景技术：
:核酸扩增和检测技术是当今生物学研究的重要手段之一。包括基础科学、生物技术、医学研究、法医学、诊断学等在内的各领域的科学家们用这种方法进行广泛的应用研究。对于某些应用，核酸定性检测就可以满足需求；而另外一些应用，要求进行定量分析。常规PCR中，扩增产物(扩增子)是通过终点法来分析检测，即PCR反应结束后，DNA通过琼脂糖凝胶电泳，然后进行成像 分析。而荧光定量PCR可以在反应进行过程中进行累积扩增产物的分析和检测，即“实时”。在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，使PCR产物的实时检测成为可能。满足实验目的的荧光化学物质包括DNA结合染料和荧光标记的序列特异引物或探针；专门的热循环仪配备荧光检测�？椋糜诩嗖饫┰鍪钡挠猓觳獾降挠庑藕欧从沉嗣扛鲅防┰霾锏牧�。相对常规PCR而言，荧光定量PCR的主要优点是准确地确定初始模板拷贝数和宽的动态范围内和高的灵敏度。荧光定量PCR结果可以用于定性(判断一段序列的有无)，也可以用于定量(确定DNA拷贝数)，即q-PCR，而常规PCR只能做半定量。另外，荧光定量PCR的结果无需通过琼脂糖凝胶电泳来评估，大大节省实验时间，提高实验效率。还有，由于PCR反应和检测都在反应管中进行，样品污染的几率大大降低，无需扩增后的实验操作。1996年荧光PCR技术首次由美国AppliedBiosystems公司推出，它是在总结PCR技术的的基础上发展起来的实时定量技术。主要运用不可延伸的寡核苷酸杂交探针和cDNA结合，然后利用DNA聚合酶的5’ -3’的外切活性将探针切断，使探针由于能量传递结构的破坏而发出荧光。相对常规PCR而言，荧光定量PCR的主要优点是准确地确定初始模板拷贝数和宽的动态范围内和高的灵敏度。荧光定量PCR结果可以用于定性(判断一段序列的有无)，也可以用于定量(确定DNA拷贝数)，即qPCR，而常规PCR只能做半定量。另外，荧光定量PCR的结果无需通过琼脂糖凝胶电泳来评估，大大节省实验时间，提高实验效率。还有，由于PCR反应和检测都在反应管中进行，样品污染的几率大大降低，无需扩增后的实验操作。实时定量PCR(q-PCR)是基因表达分析中一种最常用的技术，能同时测定基因在不同组织中的表达量，而且只需要微量的初始样本量。然而采用荧光定量技术研究基因的表达量需要对初始数据进行标准化，因为不同样本间TotalRNA的初始含量是不同的(特别是在活体的组织中)，这是由于在RNA提取和cDNA合成过程中大量的误差造成的。为了控制这些不是实验设计造成的变异，看家基因被广泛的使用。理想的看家基因是在不同的组织不同的阶段能够持续恒定的表达，且不受实验处理的影响和在同样的基因定量分析数据过程中能够产生同样的效应(即具有可重复操作性)。在之前试验中看家基因的选择往往是凭借经验进行的，所选择的看家基因在不同的组织或者不同的条件下能否稳定地表达并没有经过验证，容易造成最后分析结果的不准确，目前对mRNA的看家基因相关方面的评估已经引起关注和重视，已有大量的文章对此进行报道，其中包括猪的。由此可见，选择一组可靠的看家基因数据对标准化定量数据至关重要的，如果选择不正确会造成定量分析中的结论不准确。在实时荧光PCR中，模板的定量有两种方法:相对定量和绝对定量。相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化。绝对定量指用已知的标准曲线来推算未知的样本量。绝对定量是通过样品的CT值和标准曲线进行比较实现的。分析的结果是给定数量的样品中(给定数量的细胞，每微克总RNA)中核酸的量(拷贝数、微克)。相对定量的分析结果是在相当量的试验组(样品A)和对照组(样品B)中一个靶基因的相对比率(倍数差异)。绝对定量中，未知样本的量(即拷贝数或单位数量)可以通过从已知量的标准品范围中推算得出。为了建立标准曲线，需要已知浓度的模板。模板稀释后，用这些稀释样品作为标准样品，将未知的待测样本和标准样置于同一次实验中进行反应，用稀释的标准样品构建标准曲线，通过推算来确定未知样本中目的基因的量。这与用分子量标记来判定琼脂糖凝胶上未知DNA条带分子量大小的原理相似。相对定量 分为两种。一是以质量单位作为标准进行相对定量，用质量单位(如细胞数目或核酸的微克数)而不用参照基因作为标准的优点是，实验设计概念简单，数据数学分析处理简单易学。无论细胞数目或核酸质量是否作为标准，这个方法要求准确地量化初始材料。当用相对定量法比较多个样本时，选择一个样本作为校验样本(Calibrator,即我们常说的对照)，所有其它样本目标基因的表达都以对照为标准上调或下调。通常用未处理或基准样本作为对照。二是以参照基因作为标准进行相对定量，用参照基因(如GAPDH或β -actin)而不用质量单位作为标准的优点是，这个方法能准确量化初始材料的载量，尤其当初始材料量常常受限时，进行相对基因表达分析实验十分方便，缺点是这个方法要求得到一个或多个在所有测试样本中恒定表达的已知参照基因，而且表达水平不受研究条件下处理方式的影响。确定这样的参照基因十分重要，最近有报道提出在大多数研究实验中，使用多个参照基因对于准确定量是必须的。以参照基因作为标准的相对定量又分为:(a) Livak法，即众所周知的法；(b)用参照基因的2_"ct法；(C)Pfaffl法。2_"吣法是现在最常用的基因相对表达量分析方法，其具体推导方法如下:PCR指数扩增的公式是:Xn = X0X (1+Ex)n, [I]Xn是第η个循环后目标分子数；X。是初始目标分子数；Ex是目标分子扩增效率；η是循环数；CtR表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。因此:_'氧_鉍mIMXT是目标分子达到设定的阈值时的分子数；CT, X是目标分子扩增达到阈值时的循环数；
Kx是一个常数。对于内参反应而言，也有同样的公式:
权利要求
1.实时荧光PCR中目的基因的表达量的校正方法，其特征在于包括如下步骤: 1)按照设定的体积比a:b将反转录产物的试验样品和参照模板混合作为模板CDNA进行荧光定量PCR反应，并针对每一个不同的样本分别重复以上步骤得到Ct(1。。。。n)； 2)在进行实时荧光定量PCR反应时增加以参照模板为样本的反应孔，体积总量与步骤(I)相同，得到Ct0; 3)按照2_"ct法、2_λΔετ法或者Pfaffl法得到基因的相对表达量； 4)根据步骤I)的混合比例得到方程一:ax+by = 2~ (_Ctn)，根据步骤2)得到方程二:(a+b)y = 联解方程组可以得到各个样本看家基因的相对表达量X ; 5)以根据方程组联解得到的看家基因相对表达量来对目的基因表达量进行校正。
2.根据权利要求1所述 的校正方法，其特征在于所述的2_Λact法法是指根据荧光定量所得Ct值，进行2(_ct)将Ct值转化为线性关系，计算得到基因相对表达量的方法。
3.根据权利要求1所述的校正方法，其特征在于所述的2-"CT法是指根据荧光定量所得Ct值，进行2(_Gt)将Ct值转化为线性关系，计算得到基因相对表达量的方法。
4.根据权利要求1所述的校正方法，其特征在于所述的Pfaffl法是指用于相对定量荧光定量PCR的数据处理方法。
全文摘要
本发明公开了实时荧光PCR中目的基因的表达量的校正方法，本方法主要是通过看家基因模板和已有cDNA按照一定比例的混合以后作为模板进行荧光定量，根据混合的比例所导致的Ct值的差异来计算得到看家基因在各个样本中的表达量，通过这个定量结果来对目的基因的表达量进行校正。
文档编号G01N21/64GK103173559SQ201310121958
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月26日 优先权日2013年3月26日
发明者朱砺, 张顺华, 朱康平, 李雪梅, 李学杰, 陈晨, 洪蜜, 袁红敏, 张宇, 熊勇 申请人:四川农业大学
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