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专利名称：一种黄曲霉毒素B₁磁分离荧光定量检测试剂盒的制备方法
技术领域：
本发明属于纳米生物技术领域，具体涉及一种黄曲霉毒素B1免疫磁分离荧光定量 检测试剂盒的制备方法。
背景技术：
黄曲霉毒素(Aflatoxin，简写AF)是主要由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的次生代 谢产物，世界各地的玉米、小麦、高粱、甘薯、大豆、棉籽、禽蛋、肉、奶及奶制品中均存在黄曲 霉毒素的污染情况。目前发现的18种黄曲霉毒素中，黄曲霉毒是毒性最大的真菌毒素，其 毒性为砒霜的68倍，它诱发肝癌的能力是二甲基亚硝胺的75倍，它具有诱导突变、抑制免 疫和致癌的作用，是目前公认致癌性最强的物质之一。AFMpAFByAFG1次之。同时，AF十分 稳定，加热至230°C才能被完全破坏，因此一般烹饪加工不易消除，并且它可以通过多种途 径污染食品，直接或间接进入人类食物链，威胁人类健康和生命安全。目前国际上对农产品中AF含量的检测，已成为强制性贸易技术措施。其中薄层层 析法、高效液相色谱法和免疫化学法是受人们关注的几个代表性方法。以上三种方法中，薄 层层析法是研究AF初期所使用的主要方法，主要是由于样品前处理过程繁琐、复杂，较适 合于定性检测，不适于大批量样品的快速检测；高效液相色谱法具有快速、灵敏、准确等特 点，并且可以用于定性和定量检测，但仪器价格昂贵，不便于操作；免疫分析法操作简便、快 速，但也只能用来进行定性检测。因此，开发快速、准确、简便的检测技术是当务之急。目前， 用纳米材料实现快速检测的方法是利用金标试纸进行检测，该方法可以快速的检测黄曲霉 毒素的含量达标与否，但不能进行定量检测。本发明利用磁性分离和荧光纳米材料检测技 术相结合的方法，实现黄曲霉毒素B1的定量检测。

发明内容
本发明的目的是提供一种黄曲霉毒素B1磁分离荧光定量检测试剂盒的制备方法， 主要用于检测粮食、食品、饮料、酒类、饲料等中的黄曲霉毒素B1的含量。由于荧光粒子的激发谱在吸收阈值以上几乎是连续的，利于多波长激发；高强度 的荧光发射，发光稳定性好，不容易被光分解和漂白，因此可以用于标记物的定量检测。磁 性纳米材料具有特殊的超顺磁性，是被广泛应用的快速磁分离材料。利用磁性材料将被检 测物从待检样本中分离，并与荧光检测试剂结合形成免疫夹心复合物，这样可以利用荧光 粒子进行样本的定量检测。本发明的技术方案检测原理是样品中的黄曲霉毒素B1首先与磁性纳米材料表面 的抗体(复合物(I))发生免疫反应，偶联到磁性分离试剂一复合物(I)上，再加入偶联有 全抗原的荧光粒子溶液(复合物(II))，复合物(II)中的黄曲霉毒素B1与复合物(I)上的 剩余抗体发生免疫反应，形成复合物(ι)--复合物(II)的免疫夹心复合物(III)，这样免疫 夹心复合物(III)的荧光强度就与黄曲霉毒素B1的量相关。在测试范围内，可以看出样品
3中黄曲霉毒素的浓度与最终被测溶液的荧光粒子溶液的荧光强度成反比，其具体的黄曲霉 毒素的含量需要从标准工作曲线上获得。本发明所述的一种黄曲霉毒素B1磁分离荧光定量检测试剂盒的制备方法，其步骤 如下(1)磁性粒子的制备通过高温分解法制备粒径为5 ISnm的Fe3O4磁性粒子，再 利用细乳液法制备表面功能化的Fe3O4磁性粒子；(2)磁性分离试剂--复合物(I)的制备利用缩合剂EDC(EDC 乙基_(3_ 二甲 基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，使Fe3O4磁性粒子与黄曲霉毒素B1抗体(兔源性多克隆抗 黄曲霉毒素B1抗体，购买于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)偶联形成复合物(I)；(3)荧光粒子的制备通过有机相合成法制备CdSe荧光粒子，所制得的荧光粒子 的尺寸在2. 5 3. Onm (其它荧光纳米材料如CdTe荧光粒子、具有核-壳结构的CdSe/ZnS 荧光粒子等也适用于本发明方法)，然后通过聚马来酸使荧光粒子表面功能化并转移到水 相，得到荧光粒子；(4)荧光检测试剂一复合物(II)的制备利用缩合剂EDC，使荧光粒子与黄曲霉 毒素B1的全抗原(BSA-AFB1 连接黄曲霉毒素B1的牛血清白蛋白，购买于西格玛奥德里奇 (上海)贸易有限公司)偶联形成复合物(II)；(5)标准工作曲线的绘制取6份磁性分离试剂一复合物(I)(每份200uL)分 别放入试管中，再依次分别加入不同浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液20uL(黄曲霉毒素B1 标准溶液配制黄曲霉毒素B1首先溶解在甲醇溶液中，配制成lmg/mL甲醇溶液，然后用含 10%甲醇(体积含量)的磷酸缓冲溶液(pH 7.4、0.01mol/L)稀释一定倍数，即得到黄曲 霉毒素B1标准溶液，黄曲霉毒素B1标准溶液的浓度分别为0ng/mL、0. lng/mL,0. 5ng/mL、 1. 0ng/mL、2· 0ng/mL、5· Ong/mL。)，在37°C下孵育20分钟后，在磁场中沉淀；然后倒去上 清液，再分别加入50uL荧光检测试剂复合物(II)溶液，在37°C下孵育20分钟，在磁场中 沉淀，倒去上清液，得到免疫夹心复合物(III)。再分别加入200uL的磷酸缓冲溶液(pH = 7. 4,0. Olmol/L)，测定每个试管内溶液的荧光光谱，记录其最大荧光强度(荧光分光光度 计一岛津RF5301)；然后以荧光强度与黄曲霉毒素标准溶液的浓度为坐标绘制标准工作曲 线。(6)在实际检测中，首先绘制标准工作曲线，再测定(重复第5步中的操作过程) 样品的荧光强度，通过工作曲线读取样品中AFB1的浓度。免疫磁分离荧光定量检测试剂盒用于黄曲霉毒素B1的检测，其检测限为0. 1 5ng/mL。


图1 以荧光强度与黄曲霉毒素标准溶液的浓度为坐标绘制的标准工作曲线。
具体实施例方式1.磁性粒子的制备(1)参照文献 J.Am· Chem. Soc.，2004，126，273-279，通过高温分解方法合成 Fe3O4 磁性粒子。向N2保护的三颈瓶内加入乙酰丙酮铁[Fe(acac)3] (0. 3532g)，1，2-十二二元醇 (1.0117g)，油酸(1.0220mL)，油胺(0. 99mL)混合，苄醚(IOmL)，磁力搅拌。混合物加热至 200°C，2h ；然后停止通入氮气，再加热至约30(TC，Ih，停止加热，终止反应，冷却至室温。冷
4却后向三颈瓶中加入20mL乙醇，14000rpm离心20min，弃上清；将沉淀分散于25uL油酸、 25uL油胺和5mL正己烷混合溶液中；6000rpm离心IOmin ；弃沉淀，向上清加入IOmL乙醇， IOOOOrpm离心20min，弃上清，即得到Fe3O4磁性粒子，粒径为5 18nm，沉淀分散于正己烷
中保存。(2)表面功能化的 Fe3O4 磁性粒子，参照文献 J. Nanopart. Res.，2009，11, 289-296 首先超声将0. 218g Fe3O4磁性粒子分散在ImL苯乙烯和0. ImL环己烷的溶液中形成油相， 再将0. 08g十二烷基硫酸钠(SDS)和0. Olg NaHCO3溶解于30mL水中形成水相；将油相和 水相在冰水浴的条件下混合超声10分钟形成稳定的细乳液，然后将细乳液转入到加热的 四颈瓶中，当温度到达70°C时，加入0. ImL的丙烯酸，然后再加入0. 5mL含有0. 015g过硫酸 钾(KPS)的水溶液引发聚合反应，在通冷凝水、氮气保护、300rpm搅拌的条件下反应12小 时，即得到表面功能化的Fe3O4磁性粒子的溶液(浓度约为5. Omg/mL)。2.磁性分离试剂一复合物(I)的制备取上述步骤(2)制备的表面功能化的Fe3O4磁性粒子溶液10uL，加入0. Olmol/L、 PH = 7. 4的磷酸缓冲溶液140uL。再依次加入50 μ LEDC(2mg/mL, 1-乙基_ (3- 二甲基氨基 丙基)碳二亚胺盐酸盐)溶液和IuL抗体溶液(6.7mg/mL，兔源性多克隆抗黄曲霉毒素B1 抗体)，在气浴恒温振荡仪中，37°C条件下反应4h。反应结束后用磁铁将磁性粒子富集在离 心管底部，吸出上清液。将离心管底部的磁性粒子用0. 01mol/L、pH =7.4的磷酸缓冲溶液 200 μ L充分溶解，于4°C保存；即得复合物(I)的溶液。3.荧光粒子的制备(1)储备液的制备①储备液a :氧化镉(0. 0154g)、油酸(0. IOlg)、5mL十八烯溶 解在25mL三颈瓶中，在氮气的保护下加热到240°C得到无色澄清的溶液；②储备液b 硒粉 (0. 188g)、油酸(1. 94g)、18mL十八烯加入到氮气保护的50mL三颈瓶中，加热到100°C反应 20分钟，然后在220°C加热3小时，最终变为黄色溶液；(2)荧光粒子的合成储备液a(25mL)在氮气保护下加热到280°C，加入2mL储备 液b，反应30min，得到亮红色溶液，通过甲醇萃取，沉淀溶于氯仿，即得到CdSe荧光粒子的 氯仿溶液，粒径为2. 5 3. Onm。(3)表面功能化的荧光粒子0. 72g的聚马来酸十六烷醇酯(PMAH)溶解在IOOmL 高纯水中，用NaOH调节pH值到8 10，然后加入IOmL荧光粒子的氯仿溶液(2. OxlO^mol/ L)，常温搅拌24小时，荧光粒子即转移到水相中。将水相溶液再过0. 22um的滤膜，除去大的 颗粒，产物再经过离心纯化，得到表面功能化的CdSe荧光粒子溶液(浓度约为0. 5mg/mL)。4.荧光检测试剂一复合物(II)的制备取荧光粒子溶液100 μ L，加入0. Olmol/L、pH = 7. 4的磷酸缓冲溶液50uL。再依 次加入50uL EDC(2mg/mL, 1-乙基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)溶液和2. 5uL 抗体溶液(5mg/mL，兔源性多克隆抗黄曲霉毒素B1抗体)，在气浴恒温振荡仪中，37°C条件 下反应4h。反应结束后12000rpm离心lOmin，吸出上清液。将离心管底部的荧光粒子用 0. Olmol/L、pH = 7. 4的磷酸缓冲溶液200uL充分溶解，于4°C保存；即得复合物(II)的溶 液。5.标准工作曲线的绘制取6份磁分离试剂一复合物⑴(每份200uL)，分别加入黄曲霉毒素标准溶液20uL(黄曲霉毒素Bl标准溶液的浓度分别为0ng/mL、0. lng/mL,0. 5ng/mL、l. Ong/mL、 2. Ong/mL,5. Ong/mL)，在37°C下孵育20分钟后，在磁场中沉淀；然后倒去上清液，再加入 50uL荧光检测试剂复合物(II)溶液，在37°C下孵育20分钟，在磁场中沉淀；倒去上清液， 再加入200uL的磷酸缓冲溶液(pH= 7. 4,0. Olmol/L)，测定该溶液的荧光光谱，记录其最大 荧光强度。然后再以荧光强度与黄曲霉毒素标准溶液的浓度为坐标绘制标准工作曲线，测 量数据见表1，绘制的标准曲线如图1。表1 黄曲霉毒素标准工作曲线数据表 6.样品的定量检测首先配制样品液(样品1、样品2、样品3，其黄曲霉毒素Bl的已知含量分别为 0. 2ng/mL、0. 8ng/mL和3ng/mL)。然后通过步骤5所述的方法和步骤测定样品1、2、3的荧 光值如下样品1 =645. Icps ；样品2 605. Icps和样品3 564. 4cps，则通过步骤5绘制的标 准工作曲线读取的对应的黄曲霉毒素B1的含量分别为0. 21ng/mL、0. 83ng/mL和3. 02ng/ mL，与已知含量相符合得很好，充分表明本发明所制备的试剂盒能够用于黄曲霉毒素B1的 定量检测，而且准确率高。
权利要求
一种黄曲霉毒素B1磁分离荧光定量检测试剂盒的制备方法，其步骤如下(1)磁性粒子的制备通过高温分解法制备粒径为5～18nm的Fe3O4磁性粒子，再利用细乳液法制备表面功能化的Fe3O4磁性粒子；(2)磁性分离试剂 复合物(I)的制备利用缩合剂1 乙基 (3 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，使Fe3O4磁性粒子与黄曲霉毒素B1抗体偶联形成复合物(I)；(3)荧光粒子的制备通过有机相合成法制备荧光粒子，然后通过聚马来酸使荧光粒子表面功能化并转移到水相，得到荧光粒子；(4)荧光检测试剂 复合物(II)的制备利用缩合剂1 乙基 (3 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，使荧光粒子与黄曲霉毒素B1的全抗原偶联形成复合物(II)；(5)标准工作曲线的绘制取6份体积均为200uL的磁性分离试剂 复合物(I)分别放入试管中，再依次分别加入不同浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液20uL，在37℃下孵育20分钟后，在磁场中沉淀；然后倒去上清液，分别加入50uL荧光检测试剂复合物(II)溶液，在37℃下孵育20分钟，在磁场中沉淀；倒去上清液，再分别加入200uL、pH＝7.4、浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲溶液，然后测定每个试管内溶液的荧光光谱，记录其最大荧光强度；再以荧光强度与黄曲霉毒素标准溶液的浓度为坐标绘制标准工作曲线；(6)对未知浓度的黄曲霉毒素B1溶液重复步骤(5)中的操作过程，得到样品的最大荧光强度，然后通过步骤(5)绘制的标准工作曲线读取样品中黄曲霉毒素B1的浓度。
2.如权利要求1所述的一种黄曲霉毒素B1磁分离荧光定量检测试剂盒的制备方法，其 特征在于黄曲霉毒素B1的检测限为0. 1 5ng/mL。
3.如权利要求1所述的一种黄曲霉毒素B1磁分离荧光定量检测试剂盒的制备方法，其 特征在于荧光粒子为CdSe荧光粒子、CdTe荧光粒子或具有核_壳结构的CdSe/ZnS荧光 粒子。
4.如权利要求1所述的一种黄曲霉毒素B1磁分离荧光定量检测试剂盒的制备方法，其 特征在于黄曲霉毒素B1标准溶液的配制是将黄曲霉毒素B1首先溶解在甲醇溶液中，配制 成lmg/mL甲醇溶液，然后用体积含量10%甲醇的磷酸缓冲溶液稀释，稀释后黄曲霉毒素B1 溶液的浓度分别为 0ng/mL、0. lng/mL、0. 5ng/mL、l. 0ng/mL、2. Ong/mL 和 5. Ong/mL。
全文摘要
本发明属于纳米生物技术领域，具体涉及一种黄曲霉毒素B1免疫磁分离荧光定量检测试剂盒的制备方法。本发明为免疫检测系统与磁性纳米材料的快速分离技术、荧光纳米材料的发光特性相结合的一种测定方法，其先是制备磁性分离试剂——复合物(I)，然后使黄曲霉毒素B1偶联到复合物(I)上，再加入偶联有全抗原的荧光粒子溶液(复合物(II))，复合物(II)中的黄曲霉毒素B1与复合物(I)上的剩余抗体发生免疫反应，形成复合物(I)-复合物(II)的免疫夹心复合物(III)，这样黄曲霉毒素的浓度与最终被测溶液的荧光粒子溶液的荧光强度成反比，本发明的优点是检测快速、准确、明显、灵敏度高等。
文档编号G01N21/64GK101923089SQ201010228290
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月16日 优先权日2010年7月16日
发明者吕绍武, 张代辉, 张学忠, 徐力, 郭轶 申请人:吉林大学