专利名称：用于体外基因毒性试验的合适的肝细胞的制作方法
用于体外基因毒性试验的合适的肝细胞本发明涉及借助于增殖的生理活性肝细胞的细胞培养系统对化学、生物和物理活性物质或试剂进行基因毒性试验的方法。该方法特别适合人类和动物中已知药物和新药和活性物质以及其组合的基因毒性试验。而且，它适合测试食物、化妆品、纺织品、材料中的化学或生物学活性物质和其它物质在人类和动物中的基因毒性效应。在许多工业领域如制药、化妆品、食品和化学工业中，例如，新的化学品和/或生物学活性物质和其组合被不断地发展，其对人们健康的潜在的有害效应通常是未知的。这里，完全不同的效应可发生在人类或动物中。除了在治疗意义内的预期效应，药物、化学品或生物学活性物质还可，例如，产生不希望的副作用如肝损伤、对心肌的损伤、神经毒性或致畸性。就此可能导致器官的许多细胞丧失直至退行性器官疾�。缧牧λソ呋蚋嗡鹕�。该毒性的原因可能在于细胞的基本所有区室和功能的受损伤或受影响，这是说，例如，细胞膜的损伤、对生理过程如细胞呼吸、胞内运输、信号传导和基因表达的影响——仅举几个例子。本发明涉及试剂对人类或动物细胞中的遗传物质DNA构成的直接或间接作用及其借助所谓的基因毒性试验的适宜的测试。提供用于测试的适宜细胞是医学和诊断的挑战，特别在体外细胞体系——包括相关的细胞培养物——的发展中。因此，对建立与人类细胞尽最大程度可能相似的细胞培养物/细胞体系存在大的需求，以便可进行有效的体外基因毒性试验。现有技术已建立了细胞系，其是可在适当的培养基上无限地繁殖和永生的细胞。特别地已知肿瘤细胞或肿瘤样细胞，如HeLa细胞-宫颈癌细胞系、COS细胞、HEK-293细胞-肾、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEp-2-人上皮细胞喉癌细胞系和更多的细胞系。这样的细胞系的产生例如描述于EP833934(Crucell)，这样的细胞系例如用于药物检测。然而，这样的细胞系的缺点是遗传改变(如点突变、染色体部分易位(重排)、基因拷贝数增加(基因扩增)、甚至染色体组改变(非整倍性))以及由于缺乏接触抑制的肿瘤性质，借此细胞能够在软琼脂基质上体外生长。肿瘤细胞额外具有由无限增殖性而产生的不受限的分裂能力。已知由于自发突变，这样的细胞系的细胞在培养过程中逐渐转变并可发展成恶性细胞群并在遗传上不稳定。基于发明人的认识，仅大约60次细胞分裂之后，在培养物中出现累积突变的临界阈。这些可以是导致癌基因的激活或肿瘤抑制基因的失活的突变。因此，能够在细胞群中占优势的细胞是由于累积突变而显示增加的细胞分裂活性的那些细胞。该选择过程对应于肿瘤进展中的癌前状态；另外，商业上可获得的细胞系如果它们不源于恶性肿瘤细胞开始，通常已经历了未知数目的倍增过程。此外，以下的基因毒性试验在现有技术中被描述:在所谓的埃姆斯试验(Ames et al., 1973a; Ames et al.，1973b)中,将由于突变，例如基因中的点突变，不再能够合成特定氨基酸(营养缺陷型突变体)的细菌施加到不含有该氨基酸的培养基(琼脂)。因为这些细菌依赖该氨基酸用于它们继续的生存，所以它们将死亡或不能在该营养缺乏的培养基上繁殖。然后将细菌暴露于潜在的诱变物质，例如通过将在其中浸透的滤纸置于培养基上。如果在随后的温育之后所谓的细菌菌落形成，那么单一细菌已生长并已恢复合成相应的氨基酸的能力。这些被称作回复菌落，其中导致营养缺陷的基因中的点突变已被逆转。在染色体畸变试验中，将待测物质与细胞温育。确定的温育时期之后，分析发生的染色体畸变，例如通过核型分析。该方法允许多个染色体畸变可见，如，例如，双着丝粒染色体的发展、染色体断裂和姐妹染色单体互换(Morita et al.，1989)。 Broschinski和同事们报道了 776化学物质的常规基因毒性测试，其中细菌突变试验(埃姆斯试验)和染色体畸变试验的组合为检测诱变剂提供最佳的灵敏度(Broschinski et al., 1998)。许多试剂仅在动物或人类中发挥基因毒性，如果这些被肝脏的酶化学地修饰。分化的肝细胞，因为它们存在于未受损的肝脏中，在体内具有许多种功能，这些功能对食物还有药物或毒素中物质的生物转化是重要的(Elaut et al.，2006中概述)。细胞色素P450系统的I期酶对生物转化是重要的。在人类中，发现了很多同工酶，如CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP4A11，其执行不同的功能。对于一些同工酶，已知多态性，其可以是产生药物对肝脏的毒性作用中个体变异性的原因。CYP450酶是氧化还原酶，其造成包括药物在内的很多物质的氧化降解或代谢。除了 I期酶还存在II期酶，例如N-乙酰基转移酶[NATs]以及UDP-葡萄糖醛酸转移酶(glucorony I transferases)和横基转移酶。一般而言，为了评价活性物质候选物和化学品的潜在的肝毒性，CYP450系统、II期酶的功能性以及其它肝功能具有决定性的重要性。为了考虑该情况，埃姆斯试验通常结合将利用肝脏酶测试的物质的生物转化来进行。为了该目的，通常使用所谓的S9混合物，其是几种肝脏酶的混合物以便模拟肝脏。缩写“S9”指肝细胞提取物在9000g离心的上清液。例如，De Flora等报道了如果非那西丁的温育对仓鼠肝脏的S9部分进行，那么物质非那西丁只在埃姆斯试验中测试为阳性(De Flora S.et al.，1985)。只通过肝细胞中有活性的酶将该物质转变成可在埃姆斯试验中检测的诱变形式。检测试剂的DNA损伤效应的另一个选择是所谓的彗星实验，也被称作单细胞凝胶电泳(Singh et al.，1988)。彗星实验的原理基于将包埋入琼脂糖中的细胞溶解(lysiert)。然后将细胞的DNA暴露于电场。如果DNA被物质或物理作用损伤，那么其将从细胞核中出来并向着阳极移动，而未受损的染色体DNA不能如此。在UV显微镜下，现在观察到损伤的细胞——其先前用荧光染料如溴乙啶染色——则具有由DNA碎片构成的尾，给予它们彗星的外观。彗星尾的长度是DNA损伤的量度。彗星实验测量DNA链断裂的水平，但是不提供关于潜在的DNA损伤的直接信息。已在过去的几年里渐增使用的基因毒性试验是所谓的微核试验，通过该试验可以比用染色体畸变试验明显更容易和更快速地检测细胞遗传学变化。微核含有细胞核的部分——其由于不同的分子原因(由于诱裂效应的染色体损伤、由于非整倍体效应的染色体分离的损伤)没有进入子核中，但在细胞质中呈现为染色质颗粒。微核发生的数目或频率是细胞遗传不稳定性的量度。细胞分裂通常随新的微核发展是必需的。在由于细胞松弛素B而在有丝分裂方面被抑制的细胞中，试验处理产生的新的微核可在双核细胞中被定量，而代表测量背景的“旧的”微核在单核细胞中测定(Fenech和MorIey，1985 )。由于引入了该技术，所以微核正被渐增地分析作为基因毒性的生物指示物。这主要由于与双着丝粒染色体或另外畸变的染色体的评价相比，对微核的评价相对简单和快速的事实。而且，微核计数的自动化比染色体畸变更容易做，或可能比彗星实验更更容易做。微核试验经常在中国仓鼠肺成纤维细胞V79细胞系或在人外周血淋巴细胞中进行。在许多检测中，常常将不同试验组合以获得最可靠的信息可能性:例如Rossi和同事们用埃姆斯试验、染色体畸变试验和微核试验进行了雌激素的潜在基因毒性的检测(Rossi et al.，2007)。W02004/034013描述了可选的体外基因毒性试验，其基于含有人类11号染色体的特定的CHO细胞系。该杂交细胞系表达人CD59蛋白，其将自身呈现在细胞表面上。突变可导致表面上丧失该呈现，这可通过合适的免疫学检测方法来检测。这些试验的问题是至今它们不是十分可靠的，而且它们耗时且花费大。制药工业招致基因毒性试验的高成本。根据2004年12月剑桥健康技术进步生命科学(CambridgeHealthtech Advances Life Sciences)报道的估计,不精确地预测的基因毒性占所谓的药物失败成本的大约30%。美国专利申请US2008/0138820A1描述了基于微核试验的多参数基因毒性试验。在那里，将利用GFP组成型表达来自着丝粒蛋白的融合蛋白的构建物引入目标细胞系。该功能允许微核被检测到，其通过非整倍体机制形成。硝基还原酶编码序列——其酶活性通过合成底物CytoCy5S (GE Healthcare)的荧光转换可被检测——存在于第二表达构建物上。如果将硝基还原酶可操作地连接到受DNA损伤激活的启动子(例如GADD45a启动子)，那么诱裂的基因毒性效应可被检测。通过加入另外的细胞参数，如增殖指数和细胞毒性，可将适合各自细胞体系的算法应用于潜在的基因毒性物质的多参数分析。然而，对使用用于体外基因毒性试验的合适的细胞——其非常接近人类细胞和具有有利的体外稳定性和代谢功能性——存在很大需求。尤其用基因毒性试验，现有技术中的问题已是人肝细胞的代谢在细胞系中不被充分考虑并因此在外测试环境中测试的试剂提供假阳性或甚至错的结果。因此，本发明的目的是提供合适的肝细胞用于进行体外基因毒性试验。该目的通过权利要求1完全实现。增殖性肝细胞(增殖中的肝细胞)令人惊讶地显示以下优势:根据本发明的增殖性肝细胞的生理学相关的性质如下，其具有至少六种不同的I期酶功能中的至少四种(甚至在增殖期)，优选选自CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4，其是产生药物全部氧化代谢的大约90%的原因(Arimoto、2006)，和因此还特别地含有超过6种不同的I期酶，特别地十种不同I期酶，优选CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4,特别地十三种不同的 I期酶，特别地 CYPlAl、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP4A11。另外，来自现有技术的假阳性和错误结果的问题也被完全解决，因为这些增殖性肝细胞:a.在增殖期间具有活性I期和II期活性；b.在酶供应中具有显著的活性——其对应于体内条件；c.具有保持数天的I期活性；
d.具有通过试剂可被诱导的酶活性；e.因此消除了通过微粒体的外部代谢；f.相当大地减少了来自不能透过细胞的活性试剂的假阳性结果；和g.在试剂已进入细胞之后，试剂自身和产生的代谢物可作用于DNA，因此由于测试物质的不充分的代谢，消除或相当大地减少了假阴性结果。这样的合适的肝细胞的富集，例如，在申请人的W02009030217中被描述，其优选可从原代细胞获得。而且，增殖性肝细胞可同样从其它前体细胞，如干细胞、成体细胞和可被分化的其它细胞获得。在本发明的范围内，术语“原代细胞”将被理解为直接从体液或从体组织获得的移出物，其具有正常的，即非退化的多细胞生物如人类、哺乳动物或合适的供体的细胞。原代细胞培养物是已被培养直到第一代的原代细胞。原代细胞具有天然的分化性质并不是永生的。为了在体外保持细胞，必须利用补偿每次细胞分裂发生的染色体端粒缩短的方法。一种这样的选择是利用端粒酶(Harley, C.B.and B.Villeponteau.1995.Telomeresand telomerase in aging and cancer.Curr.0pin.Genet.Dev.5:249—255)。倉泛补偿端粒的损失例如通过端粒酶的细胞可生长无限数目的细胞分裂并具有永生性。然而，在细胞分裂过程中，存在突变发生的不可避免的缺点，突变发生迟早必定导致癌症的发展。为了在体外保持人原代细胞或可分化的细胞，可进行以下步骤:将原代细胞或可分化的细胞:a.)分离；bl.)将至少一个增殖基因或其基因产物功能性引入细胞；和/ 或b2.)用至少一个诱导细胞分裂停滞的细胞因子进行失活；和/或b3.)瞬时地无限增殖；c.)培养和/或传代。然而，使用的起始材料优选是人原代肝细胞，其可通过例如，活组织检查获得。优�。朐赴啾龋山谐隽硗獾拇虺�20至60个另外的传代。根据本发明，获得如上面所描述的增殖性肝细胞，其高度适合进行基因毒性试验。特别有利地，可获得细胞，其不呈现肿瘤细胞，更特别地恶性肿瘤细胞的任何性质，如在软琼脂中生长或体内肿瘤生长(异种移植动物模型中肿瘤的生长)。将这样的细胞在本领域技术人员已知的细胞培养基上培养。在本发明的范围内，增殖基因是在可被有限程度地增加的原代细胞中改善细胞分裂和赋予细胞分裂能力的基因，其中与来自现有技术的细胞系相比，细胞转化或分化性质改变的可能性显著减小。根据本发明，增殖基因优选选自病毒增殖基因:乳头状瘤病毒如HPV (人乳头状瘤病毒)和BPV (牛乳头状瘤病毒)的E6和E7 ;多瘤病毒如SV40、JK病毒和BC病毒的大的和小的肿瘤抗原(TAgs);腺病毒的ElA和ElB蛋白、EB病毒(EBV)的EBNA蛋白；以及HTLV和松鼠猴疱疹病毒的增殖基因和各自的编码蛋白或其嵌合体，选自细胞增殖基因，特别地选自以下基因种类:myc、jun、ras、src、fyg、myb、E2F和Mdm2和TERT (酶端粒酶的催化亚基)，优选人端粒酶(hTERT )。然而，根据本发明，病毒增殖基因是优选的，HPV或BPV的E6和E7特别优选。为此，可使用HPV型的增殖基因，其与恶性疾病相关。高危乳头状瘤病毒的最已知的实例是HPV16 和 HPV18。高危组的另外实例包括 HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73 和82。然而，还可能使用所谓的低危HPVs的E6和E7增殖基因。已知的实例包括HPV6和11型，低危组的其它HPV型包括HPV40、42、43、44、54、61、70、72和81。而且，相应的嵌合体或嵌合基因产物可任意组合和使用。E6蛋白连同增殖的增加的意义首先的是在于p53途径的失活和在于端粒酶的诱导。E7蛋白连同增殖的增加的意义首先是在于pRB途径的失活。结合本发明，还可能组合一个病毒种或不同病毒种的不同血清型的增殖基因或甚至可能产生和使用一个病毒种或不同病毒种的不同血清型的嵌合增殖基因。例如，嵌合基因中的一个E6结构域可源自HPV16，例如，而另一个源自HPV6。当然增殖基因还可被截短或具有一个或多个碱基交换，而不背离本发明的范围。前面提到的增殖基因代表优选的实施方式并不期望限制本发明。增殖基因可任选地是合成的或人工产生的基因序列的主题。将这些因子“功能性引入”靶细胞，假定其细胞分裂能力增加，并且为了该目的，可使用以下基因转移系统，而不限于此:上面提到的基因功能的表达构建物通过传统的磷酸钙方法(Wigler, M.et al.，1977.Cellll: 223-232)、通过脂转染(Feigner, P.L.et al, 1987.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A84:7413-7417)、通过电穿孔(Wolf’H.etal., 1994.Biophys.J.66:524-531 )、通过显微注射(Diacumakos, E.G.1973.Methods CellBiol.7:287-311)、通过结合物——其通过细胞受体或不依赖受体而获得——转移进细胞。上面提到的基因功能还可通过病毒载体转移至靶细胞。实例包括逆转录病毒载体、AAV载体、腺病毒载体和HSV载体，仅举几个载体的例子(病毒载体的概述在=Lundstrom, K.2004.Technol.Cancer Res.Treat.3: 467-477 ; Robbins, P.D.and S.C.Ghivizzan1.1998.Pharmacol.Ther.80:35-47中)。术语“功能地引入”包括特别地通过至少一个增殖基因对靶细胞进行的转染。上面提到的病毒或细胞增殖基因的表达可受强或弱的组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子(Meyer-Ficca, M.L.et al.2004.Anal.Biochem.334:9-19)的调控，或表达盒可位于分子切除系统的特定序列两侧。实例包括Cre/Lox系统(美国专利4，959，317)，其使用导致表达构建物从靶细胞基因组分子去除。在另外的实施方式中，像这样或通过融合蛋白可同样地将增殖基因的基因产物直接功能地引入靶细胞。优选这些是信使蛋白(转运蛋白)如VP22、HIV TAT (Suzuki etal.，277J.Biol.Chem.2437-24432002 和 Futaki245Int.J.Pharmaceut.1-7 (2002)，(HIV)REV, Antennapedia Polypeptid (W097/12912 和 W099/11809)或 Penetratin (Derossiet al., 8Trends Cell Biol.,84-87 (1998)、Engrailed (Gherbassi, D.&Simon, H.H.J.Neural Transm.Suppl47-55 (2006)> Morgan, R.580FEBS Lett., 2531-2533 (2006)、Han,K.et al.1OMol.Cells728-732 (2000))或 Hoxa-5 (Chatelin et al.55Mech.Dev.111-117 (1996))、由L-精氨酸或D-精氨酸氨基酸残基形成的聚合物(Can.PatentN0.2，094，658; U.S.Pat.N0.4，701，521; W098/52614)、由 L-赖氨酸或 D-赖氨酸氨基酸残基形成的聚合物(Mai et al.，277J.Biol.Chem.30208-30218 (2002)、Park etal.13Mol.Cells202-208 (2002)、Mi et al.2Mol.Ther.339-347 (2000))、转录因子如BETA2/neuro D、PDX-1 (Noguchi and Matsumoto60Acta Med.0kayamal-1I, (2006)、Noguchi et al.52Diabetesl732_1737 (2003)、Noguchi et al.332Biochem.Biophys.Res.Commun.68-74 (2005))、核定位信号(Yoneda et al.201Exp.Cell Res.313-320 (1992)、组蛋白衍生的妝(Lundberg and Johansson291Biochem.Biophys.Res.Comm.367-371(2002))、由阳离子大分子形成的聚合物、FGF-1和FGF-2、乳铁蛋白等等，如文献中所适当描述的。本发明因此还涉及这样的增殖性肝细胞，其被瞬时地无限增殖，优选通过1.)具有细胞无限增殖化活性的多肽；i1.)在染色体末端合成端粒DNA的多肽或其各自的融合肽，其中第一部分中的融合肽由转运蛋白组成，参见上面。这样的具有细胞无限增殖化活性的多肽可，例如，从前面提到的病毒或细胞增殖基因获得。而且，参考EP1175436B1来产生这样的多肽。这样的在染色体末端合成端粒DNA的多肽优选选自端粒酶、端粒酶逆转录酶(hTERT)、pl40、pl05、p48和p43。而且，参考EP1175436B1来产生这样的多肽。在本发明的范围内，“用至少一个诱导细胞分裂停滞的细胞因子失活”将被理解为指，例如，细胞分裂停滞在衰老程序中被激活(概述在:Ben Porath, 1.andR.A.Weinberg.2005.1nt.J.Biochem.Cell Biol.37:961-976.)或指分化程序的范围内在细胞中被激活的细胞分裂停滞。例如，在心肌细胞的情况下已知，它们在出生之后不久停止分裂，这通过细胞周期抑制剂如pl6、p21、p27的表达等来调节(Brooks, G.，etal.1998.Cardiovasc.Res.39，301-311 ；F1 ink, 1.L.et al.，1998.J.Mo 1.CellCardiol.30，563-578 ；Walsh, K.and Perlman, H.1997.Curr.0pin.Genet.Dev.7，597-602)。相似的方法当然应用于所有原代细胞类型的大多数。在分化的细胞中细胞周期抑制剂的失活因此可引起细胞恢复增殖。在本发明的上下文中，这还应用于这里没有提到的另外的细胞周期抑制蛋白。在本发明的范围内，对控制细胞周期重要的蛋白p53和直接结合p53的所有蛋白、该P53途径的上游和/或下游因子可通常被失活以达到增加的细胞分裂能力的目的(p53途径概述在:Giono, L.E.and J.J.Manfred1.2006.J.Cell Physiol209:13-20 ；Farid, N.R.2004.Cancer Treat.Res.122:149-164)。在本发明的范围内，对控制细胞周期重要的蛋白pl6/INK4a和直接结合pl6/INK4a的所有蛋白、该pl6途径的上游和/或下游因子可通常被失活以达到增加的细胞分裂能力的目的(pl6/INK4a 途径概述在:Shapiro, G.1.et al., 2000.Cell Biochem.Biophys.33:189-197)。在本发明的范围内，对控制细胞周期重要的蛋白pRb、和pRb家族的所有成员(例如pl07、pl30)和直接结合pRb家族的所有蛋白、该pRb途径的上游和/或下游因子可通常被失活以达到增加的细胞分裂能力的目的(pRb途径概述在=Godefroy, N.et al.2006.Apoptosis.11: 659-661; Sevi I le, L.L.et al.2005.Curr.Cancer DrugTargets.5:159-170)。
细胞因子如p53、pRB, pl6等的失活可，例如，通过相应因子的显性失活突变体的表达(Herskowitz, 1.1987.Nature329:219-222 ;Kiipper，J.H.，et al.1995.Biochimie77:450-455)、通过在反义寡核苷酸(Zon, G.1990.Ann.N.Y.Acad.Sc1.616:161-172)、RNAi 分子(Aagaard, L.and J.J.Ross1.2007.Adv.Drug Deliv.Rev.59:75-86 ；Chakraborty, C.2007.Curr.Drug Targets.8:469-482)、吗啉代(morpholinos) (Angerer, L.M.and R.C.Angerer.2004.Methods Cell Biol.74:699-711)、核酶(Sioud, M.and P.0.1versen.2005.Curr.Drug Targets.6:647-653)的辅助下抑制这些因子的表达或通过基因敲除(Le, Y.and B.Sauer.2000.Methods Mo 1.Biol.136:477-485 ；Yamamura, K.1999.Prog.Exp.Tumor Res.35:13-24)而发生。这些方法对本领域技术人员是已知的并在文献中的许多地方被描述。失活还可通过特异抗体(例如单链抗体、细胞内抗体等的；概述在:Leath, C.A., III, et al.2004.1nt.J.0ncol.24:765-771 ；Stocks,M.R.2004.Drug Discov.Today9:960-966 中)的作用而发生。失活还可通过使用细胞因子的化学抑制剂，例如通过使用激酶抑制剂而发生。激酶抑制剂的一个实例是物质伊马替尼(Glivec4'.)。细胞增殖的减少通过这种方式获得。伊马替尼是特异性抑制剂，其在患病的细胞中阻断Abl酪氨酸激酶的活性并由此抑制突变的血液干细胞的病理性增加的增殖。在优选实施方式中，本发明因此同样涉及建立试验的方法，包括以下步骤:a.)提供载体材料；b.)在该载体材料上固定(immobilizing或fixing)增殖性肝细胞；和将来自b.)的细胞与试剂接触和测定剂的基因毒性。在本发明的范围内，试剂指任何任意的物质，例如被批准或研发中的药物和药物候选物和其前体；一般而言的化学品；生物学活性物质，这是说由细胞产生的分子，如以该方式天然出现，或在生物体或病毒中以修饰的形式，或可在那里形成的蛋白；包括在物理效应如电磁辐射、热、冷能、声音或类似物理效应下。这样的试剂的作用包括但不限于DNA损伤的产生如核苷酸氧化、脱氨基、碱基丢失、链断裂、加合物、DNA-DNA交联。引起DNA断裂的试剂指诱变剂。试剂的间接的基因毒性效应是，例如，对纺锤体的损伤，这是染色体或姐妹染色单体分离所需要的，并且其中，由于损伤，例如，细胞分裂期间染色体断裂或不规则的染色体分布到子细胞可发生。影响染色体分布的试剂指非整倍体的。作为一种或多种试剂的这些基因毒性效应的结果，细胞的基因构成的改变发生，这可以但不是必定与引起细胞死亡的直接毒性联系。另一方面，基因构成的改变可在改变的基因活性中显示自身，这导致改变的细胞代谢。测定基因毒性的阳性事件可用试验试剂以更广泛的意义来证明，例如通过荧光标记的抗体或类似物。特别地，这里应提到合适的生物分析方法，例如免疫组织化学、抗体阵列、Luminex/Luminol、ELISA、免疫荧光和放射免疫测定。术语“固体载体”包括实施方式如滤器、膜、磁性小球、硅晶片、玻璃、塑料、金属、芯片、质谱靶或基质，例如由蛋白制成，或其它基质，如PEG例如，等等。在根据本发明的排列的进一步优选实施方式中，该实验对应于具有微孔板(96孔、384孔或更多的孔)大小的格子、硅晶片、芯片、质谱靶或基质。载体材料(基质)可以以球形非聚集的颗粒——称作小球、纤维或膜的形式存在，其中基质的孔隙度增加表面。例如，孔隙度可以以惯常的方式通过将成孔材料如环己醇或1-十二醇加入到悬浮聚合的反应混合物中而增加。
实施例:实施例1:诱导增殖性肝细胞的CYP3A4活性首先，通过用W02009030217A2中描述的方法处理原代人类肝细胞来产生能够增殖的肝细胞。为了分析本发明中描述的增殖性肝细胞的代谢能力，在多个倍增数字(PD23、32和36)测量CYP3A4活性的诱导。为了该目的，将细胞以2.3 X IO4细胞/cm2的密度接种在涂布胶原的细胞培养容器上并培养4天。此后，在通过基于发光的P450-Glo实验(Promega)测量CYP3A4活性之前，每天用利福平(20 u M)处理细胞，进行三天。以对照细胞的CYP3A4活性除以用利福平处理的细胞的CYP3A4活性(以RLU/s/孔))，计算X倍诱导(平均值土标准差，n=3)。可能在所有三个测试的倍增时期里诱导增殖性肝细胞的CYP3A4活性(
图1)。对于被分析的所有倍增时间，诱·导是相似的，并满足针对人类肝细胞中的CYP3A4诱导的FDA标准(这是说大于四倍)。实施例2:正确地鉴定基因毒性试验的阳性和阴性物质为了检查关于基因毒性试验在专利中描述的可增殖性肝细胞的适合性，将细胞用被认为是基因毒性的阳性和阴性物质处理。利用FACS实验，与对照组相比，通过诱导的微核的部分定量基因毒性。详细地，测试了阳性物质丝裂霉素C (MMC)和环磷酰胺(CPA)和阴性物质姜黄素。如果该物质先前用CYP酶提取物(S9混合物)转化，那么CPA首先必须被代谢以具有基因毒性效应和仅在目前使用的微核试验中用V79细胞检测。在基于啮齿动物细胞系的标准基因毒性试验中，将姜黄素分类为假阳性。将本发明中描述的增殖性肝细胞以3000细胞/cm2的密度铺到涂布胶原的细胞培养容器上，并用多种浓度的前面提到的物质来处理。在根据OECD的规定测试的范围内，测试发生达50%的细胞毒性，这通过MTT生存能力实验预先测定每种物质。由于在48小时肝细胞的细胞分裂速度小于V79细胞系，所以针对处理(每种情况中指出的)选择较长的温育和恢复时期。对于MMC和CPA，观察微核形成的剂量-效果关系，以便这些物质被清楚地识别为阳性(图2和3)。正确地鉴定的CPA的基因毒性证实了细胞的代谢能力。相比之下，姜黄素没有诱导增加的微核形成，并因此被正确地分类为阴性物质(图4)。文献目录Agarwal, M.L.，Taylor, W.R.，Chernov, M.V.，Chernova, 0.B.and Stark, G.R.(1998).
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权利要求
1.增殖性肝细胞的用途，其用于就基因毒性进行的体外试验方法。
2.根据权利要求1的增殖性肝细胞的用途，其特征在于进行埃姆斯试验、染色体畸变试验、彗星实验、微核试验。
3.根据权利要求1或2的增殖性肝细胞的用途，其特征在于这些增殖性肝细胞包括至少四种选自 CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYPlAl、CYP3A5、CYP3A7 和 CYP4A11 的 I 期酶。
4.根据在前权利要求中任一项的增殖性肝细胞的用途，其特征在于这些增殖性肝细胞在软琼脂中不显示生长能力或在体内不显示肿瘤生长。
5.根据在前权利要求中任一项的增殖性肝细胞的用途，其特征在于来自人类或哺乳动物的原代细胞的这些增殖性肝细胞具有 a.)增殖基因，特别地细胞和/或病毒增殖基因；和/或 b.)至少一个诱导细胞分裂 停滞的细胞因子被失活，和/或 c.)瞬时地无限增殖。
6.根据权利要求5的增殖性肝细胞的用途，其特征在于该细胞增殖基因选自myC、jun、ras、src、fyg、myb、E2F和Mdm2和TERT,或所述病毒增殖基因选自下组:乳头状瘤病毒如HPV的E6和E7 ;多瘤病毒如SV40、JK病毒和BC病毒的大的和小的TAg ;腺病毒的ElA和ElB蛋白，EB病毒(EBV)的EBNA蛋白；以及HTLV和松鼠猴疱疹病毒。
7.根据权利要求5的增殖性肝细胞的用途，其特征在于所述病毒增殖基因是HPV或BPV 的 E6 和 E7,特别地 HPV16 和 HPV18 和 HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73 和82 和 / 或 HPV6 和 HPVll 以及 HPV40、42、43、44、54、61、70、72 和 81。
8.根据权利要求5的增殖性肝细胞的用途，其特征在于所述细胞因子选自下组:p53、pl6、pRB、pl07、pl30或其各自的上游或下游因子、或在该途径与其结合的蛋白，并且这样的细胞因子的所述失活通过显性失活突变体的表达而发生，或者通过利用反义寡核苷酸、RNAi分子、Morpholinos、核酶抑制这些因子的基因表达而发生，或者通过基因敲除、通过特异抗体的作用或通过化学抑制剂而发生。
9.根据权利要求5的增殖性肝细胞的用途，其特征在于所述瞬时无限增殖化通过1.)具有细胞无限增殖化活性的多肽， .)在染色体末端合成端粒DNA的多肽、或其各自的融合肽而发生。
10.根据权利要求5的增殖性肝细胞的用途，其特征在于所述瞬时无限增殖化通过1.)选自根据权利要求6或7的表达产物的具有细胞无限增殖化活性的多肽而发生。
11.根据权利要求5的增殖性肝细胞的用途，其特征在于所述瞬时无限增殖化通过i1.)选自端粒酶、端粒酶逆转录酶(hTERT)、pl40、pl05、p48和p43的在染色体末端合成端粒DNA的多肽而发生。
12.根据权利要求5的增殖性肝细胞的用途，其特征在于所述瞬时无限增殖化通过融合肽而发生，其中第一部分是转运多肽，特别地VP22、HIV TAT、(HIV) REV、触角多肽、Penetratin、Engrailed、Hoxa_5、由L-精氨酸或D-精氨酸氨基酸残基形成的聚合物、由L-赖氨酸或D-赖氨酸氨基酸残基形成的聚合物、转录因子如BETA2/neuro D、TOX-1、核定位信号、组蛋白衍生的肽、由阳离子大分子形成的聚合物、FGF-1和FGF-2、乳铁蛋白，并且第二部分是根据权利要求6或7的多肽。
13.建立试验的方法，包括以下步骤: a.)提供载体材料； b.)在该载体材料上固定增殖性肝细胞，和 将来自b.)的这些细胞与试剂接触并测定所述试剂的基因毒性。
14.根据权利要求9的建立试验的方法，其特征在于所述试剂选自化学和生物学活性物质、药物和化 妆品。
全文摘要
本发明涉及借助于增殖的生理活性肝细胞的细胞培养系统对化学、生物和物理活性物质或试剂进行基因毒性试验的方法。
文档编号G01N33/50GK103221822SQ201180055099
公开日2013年7月24日 申请日期2011年10月4日 优先权日2010年10月4日
发明者A·J·C·M·布拉斯潘宁, S·海因兹, A·内伦贝格, N·休伊特, J-H·屈佩尔 申请人:米迪赛特有限公司
专业数控铣床产品供应商
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