专利名称：一种检测样本中被分析物的溶液的制作方法
技术领域：
本发明属于疾病诊断系统，特别的，本发明涉及一种用于检测液体样本中是否存在被分析物的溶液以及包括该溶液的检测系统。
背景技术：
毒品检测目前被大多数国家作为必要的常规检测手段，特别是在入职、驾驶或查 毒过程中常常需要对人员进行测试。唾液作为一个对被检测者没有创伤的检测越来越普及，而唾液中的被分析物质，例如毒品滥用因为浓度小而不容易被检测出，另外还存在一些毒品小分子，容易被收集样本的器具所吸附，从而增加了检测的难度，容易造成漏检。这就需要提供一个更好的改进的方法对这些收集的样本进行处理，以提高检测的灵敏度，同时避免传统技术中的一些缺陷。
发明内容
为了更好的解决以上现有技术的问题，一方面，本发明提供一种用于检测样本中被分析物质的溶液，包括环糊精或环糊精的衍生物、起缓冲作用的缓冲系统。另一方面，本发明提供一种用于检测样本中是否存在被分析物质的系统，包括含有环糊精或环糊精的衍生物的溶液系统，和样本收集器，其包括吸收样本的部件。另一方面，本发明还提供一种检测样本中是否存在被分析物质的方法，该方法包括用收集器收集液体样本，让含有环糊精或环糊精的衍生物的溶液与收集器接触病进行洗脱，检测从收集器上洗脱下来的液体，获得被分析物质含量。其中检测的方式可以用测试元件进行检测。优选的，以上所述的环糊精选自甲基环糊精、环糊精、α-环糊精、甲基环糊精、羟丙基环糊精、羟乙基环糊精、磺丁基环糊精、羧甲基-环糊精、麦芽糊精、吡罗昔康-β -环糊精、磺丁基醚-环糊精中的一种或几种。更优选的，所述的环糊精为甲基环糊精、β -环糊精、α -环糊精、甲基-β -环糊精中的一种或几种。更优选的，所述的环糊精的质量百分比浓度至少为O. 02-5%。作为优选的方案，所述的缓冲系统选自磷酸盐、醋酸中的一种或几种。优选的，所述的溶液还包括抗四氢大麻酚或A9-THC的抗体。优选的，抗体与生物素耦联。优选的，所述的溶液还包BSA，其中BSA与生物素耦联。优选的，吸收样本的部件包括滤纸、无纺布或海绵。更优选的，吸收样本的部件为滤纸。另一方面，本发明还提供一种检测样本中被分析物质的测试元件，该测试元件包括检测区域，位于检测区域上游的样本施加区域；检测区域包括被固定的一种特异结合分子，其中，在检测区域的上游还包括以干的形式存在的环糊精或环糊精的衍生物。其中检测元件可以是检测试纸条。优选的，在测试元件中，让液体样本先与测试元件上的环糊精或环糊精的衍生物接触合适的时间形成混合液体，然后再让混合液体流到检测区域中。合适的时间可以是10秒-30分钟，可以是1，2、3、4、5、6、10、15或20分钟。优选的，测试元件包括标记区域，标记区域位于样本施加区域和检测区域之间。更优选的，标记区域包括抗THC的抗体以及胶体金颗粒；检测区域上固定的分子包括THC抗原或半抗原。优选的，环糊精或环糊精的衍生物位于样本施加区域上。另一方面，本发明提供一种收集液体样本的装置，其中在收集装置上包括以干的形式存在的环糊精或环糊精的衍生物。优选的，在该装置中，让液体样本先与收集装置上的环糊精或环糊精的衍生物接触并进行洗脱；然后测试洗脱液中被分析物质的含量。另一方面，本发明提供一种检测液体样本中的方法，该方法包括让液体样本先和环糊精或环糊精的衍生物接触形成混合液体，然后再让该混合液体被检测，从而获得检测结果。其中所述的环糊精或环糊精的衍生物存在缓冲液体中或以干的形式存在载体上。所述的载体包括滤纸、玻璃纤维素、无纺布等吸水性多孔载体上。有益效果通过本发明，可以提高毒品检测的灵敏度，同时避免漏检。
图IA为本发明的一个具体实施方式
中检测试纸条的立体结构示意图；图IB为本发明的一个具体实施方式
中检测试纸条的俯视结构示意图；附图标记说明检测试纸条101 ;标记片121，样本接收片111，检测片131，吸水片141 ;支撑片151 ;检测线131 ;检测结果控制线133。
具体实施例方式下面对本发明及的结构或这些所使用的技术术语做进一步的说明。环糊精环糊精是从淀粉得到的六个以上D-卩比喃葡萄糖单元以alpha-1,4-糖苷键连结的具有环状疏水圆锥型结构(右上旋转的环糊精模型)的低聚糖非还原性化合物系列。在这个环糊精系列中，它们的命名基于环中葡萄糖基的数量，以6个D-吡喃葡萄糖单元组成的环状糊精，称为α -环糊精(alpha-⑶)，以此类推，7个的称为β -环糊精(beta-⑶)，8个的称为Y _环糊精，(gamma-⑶)。以上这二种环糊精是最常用的，我们也称以上这二种环糊精为基础环糊精。经过对这三种基础环糊精进行化学修饰和改性之后，我们称之为基础环糊精的衍生物。也叫做环糊精的衍生物。Villiers在1891年的时候最先发现了环糊精，他从土豆淀粉中用芽胞杆菌通过培养基分离出一种晶状的物质(后来被称为环糊精)。现在，工业生产环糊精的细菌是使用一种天然的酶，环糊精葡萄糖转移酶(CGTase)从两端剪断呈螺旋状的淀粉后把它连接起来组成一个疏水的圆锥型环状，由于剪出来的淀粉长度不同，这样就产生了三种不同的环状糊精。环糊精是淀粉经环糊精葡萄糖基转位酶作用后形成的一系列环状寡聚糖，常用的分别是由6，7，8个葡萄糖分子构成的a-环糊精，β-环糊精和Y —环糊精，其中又以β —环糊精的用途最广目前。本发明中的溶液或体统中都可以包括以上环糊精或环糊精的衍生、物。在一些优选的方式中，β —环糊精或以β —环糊精为基础的衍生物被作为本发明中的成分使用，可以较好的减少取样装置上吸收样本的部件对被分析物质的吸附，例如对THC的吸附。例如，甲基-β -环糊精、羟丙基-β -环糊精、羟乙基-β -环糊精、磺丁基-β -环糊精、羧甲基-β -环糊精、吡罗昔康-环糊精、磺丁基醚-环糊精中的一种或几种。更优选的，所述的环糊精为甲基环糊精、β -环糊精、α -环糊精、甲基-β -环糊精。这些举例只是有限的列举，并不对本发明的范围构成任何限制。
作为以溶液存在的环糊精或环糊精的衍生物，溶剂可以是水等任何可以让其溶解、悬浮其中的试剂。在一些优选的方式中，溶液中还包括一些起缓冲作用的试剂，例如磷酸、盐酸、醋酸、Tris-盐酸等等。以溶液形式存在的这样的试剂可以更好的与样本中被分析物质接触或让被分析物质从取样载体上洗脱下来。取样载体包括取样器、取样器中吸收样本的部件可以使任何能够保留样本的载体，载体包括任何可以吸收液体样本的多孔载体或非吸水载体。吸水多孔载体包括，例如海绵、棉花、滤纸、无纺布；或者非吸水载体包括塑料、玻璃等。环糊精的浓度选择也是另外一个因素，可以根据不同的种类选择不同的浓度，例如占洗脱液重量百分比为O. 05-5%，0. 2-3% ；0. 2-2. 5% ;0. 2_2。0% ;例如，当选择的环糊精为甲基-β -环糊精的时候，洗脱液中甲基-β -环糊精的浓度为O. 2-5%,优选的为O. 2-3%，例如为 O. 1%,0. 5%,O. 25%,O. 6%,O. 8% ；2. 5% ；3. 0%等。以上的实施方式特别适用洗脱收集器对THC的吸附。当然如果针对其他的被分析物质的时候，可以通过一些简单的试验确定使用环糊精的种类以及不同种类需要的浓度，这是本领域的一般技术人员通过阅读本发明容易想到的，而且通过有限次试验可以确认的。当环糊精或环糊精的衍生物以溶液(又称为洗脱液)存在的时候，提供一种方法，先让样本与洗脱溶液接触或让带有样本的收集器与洗脱溶液接触并进行洗脱，然后对从收集器洗脱的溶液进行测试，从而获得测试结果。测试包括用测试元件进行测试，也包括用液相色谱、气相色谱或质普仪器进行测试。洗脱的方式可以是让含有环糊精或环糊精的衍生物的溶液直接与收集器接触一段时间，也可以让收集器在洗脱溶液中反复挤压，漂洗，或者让洗脱溶液冲洗收集器合适的时间等等。在另一方面，以上的这些环糊精不仅可以以溶液的形式存在，还可以直接处理在检测装置上并以干的形式存在，例如一些测试元件上并以干的形式存在，测试元件包括检测试纸条，例如硝酸纤维素膜上。例如，把环糊精配置成溶液，然后在测试元件的样本施加区域上处理一定体积的糊精溶液，然后烘干。在进行测试的时候，先让液体样本与测试元见上处理有环糊精或环糊精的衍生物的溶液的区域接触形成混合液体，然后再让混合液体流到测试元见的检测区域上。经过我们的试验发现，这样的方式也可以减少样本施加区域因为材质的不同而对一些小分子物质的吸附，例如对THC分子的吸附。因此，本发明提供一种测试元件，包括位于测试区域上游的样本施加区域；检测区域，其包括固定在检测区域的特异结合分子；其中，在检测区域的上游包括以干的状态存在的环糊精分子或其衍生物。另一方面，本发明还提供一种收集液体样本的装置，其中，该装置包括以干的状态存在的环糊精分子或其衍生物。这种收集装置包括以海绵头，滤纸等材料组成的吸收液体样本的部件，在这些吸收样本的部件上包括环糊精分子或其衍生物。上述阐述的环糊精的不同种类和浓度都可以被包括在此一些具体的实施方式中。
样本任何类型的样本都能够用本发明的装置进行试验，包括体液(例如，尿液和其它体液，以及临床样本)。液体样本可能源自固体的或者半固体的样本，包括粪，生物组织和食物样本。这些固体的和半固体的样本可以通过任何适合的方法转变成液体样本，例如在一种适当的液体中混合，跺碎，浸软，孵育，溶解或者酶解固体样本(例如，水，磷酸盐缓冲液或者其它缓冲液)。“生物样本”包括源自活的动物、植物和食物的样本，也包括尿液、唾液、血液和血液成分、脑脊液、阴道拭子，精液、粪便、汗液、分泌物、组织、器官、肿瘤、组织和器官的培养物，细胞培养物和那里的条件介质，不管是人的还是动物的。食物样本包括加工过的食物成分和最后的产品，肉，奶酪，酒，牛奶和饮用水。植物样本包括源自任何植物、植物组织、植物细胞培养物和那里的条件介质的样本。“环境样本”是那些源自环境的样本(例如，湖水样本或者其它水体的样本，污水样本，土壤样本，地下水样本，海水样本，废物废水的样本)。污水和相关的废物也可以包含在环境样本中。被分析物用本发明可以分析任何被分析物质。能够用本发明稳定检测的被分析物的例子包括(但是不仅仅包括)人绒毛膜促性腺激素(hCG)，黄体生成素(LH)，卵巢刺激素(FSH)，丙肝病毒(HCV)，乙肝病毒(HBV)，乙肝表面抗原，艾滋病病毒和任何滥用的药物。被分析物能够在任何的液体或者液化样本中检测到，例如尿液，唾液，口水，血液，血浆，或者血清。其它的被分析物的例子还有肌氨酐酸，胆红素，亚硝酸盐，蛋白质(非特异性的)，血液，白细胞，血糖，重金属和毒素，细菌成分(例如，特定类型的细菌的特殊的蛋白质和糖分，例如大肠杆菌0157: H7，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，产气荚膜梭菌，弯曲杆菌，单核增生李斯特菌，肠炎弧菌，或者腊状芽孢杆菌)。任何其它的适合侧流试验形式的被分析物都可以用本装置检测。被分析物还可以是有传染性物质或可提示感染期的物质。被分析物可以是药品(如滥用药物)，激素，蛋白，核酸分子，病原体。“滥用药物”(DOA)是指非医学目的地使用药品(通常起麻痹神经的作用)。滥用这些药物会导致身体和精神受到损害，产生依赖性、上瘾并且/或者死亡。药物滥用的例子包括可卡因；安非他明(例如，黑美人、白色安非他命药片、右旋安非他命、右旋苯异丙胺药片、Beans);甲基苯丙胺(crank、甲安菲他明、crystal,speed);巴比妥酸盐(如Valium , Roche Pharmaceuticals, Nutley, New Jersey);镇静剂(即睡觉辅助药品);麦角酸酰二乙胺(LSD);抑制剂(downers, goofballs, barbs, bluedevils, yellow jackets,安眠酮)；三环类抗抗抑郁剂(TCA,即丙咪嗪、阿密曲替林和多虑平);苯环己哌唆(PCP);四氢大麻醇(THC、pot, dope, hash, weed,等。)、Δ 9-THC ;鸦片制剂(即吗啡、鸦片、可待因、海洛因，羟二氢可待因酮)以及他们在动物体内的代谢产物。使用该检测试纸条也可以用于属于医学用途但又容易服药过量的检测，如三环类抗抑郁药(丙米嗪或类似物)和乙酰氨基酚。测试元件测试元件可以选用横向流动的检测试纸条，它可检测多种被分析物。当然，其他合适的测试元件也可以运用在本发明。各种测试元件可以被组合在一起运用到本发明中。一种形式是检测试纸。用于分析样本中的被分析物(如毒品或表明身体状况的代谢物)的检测试纸可以是各种形式，如免疫测定或化学分析的形式。检测试纸可以采用非竞争法或竞争法的分析模式。检测试纸一般包含一具有样本加样区的吸水材料，试剂区和测试区。加样本至样本加样区，通过毛细管作用流到试剂区。在试剂区，如果存在被分析物，样本与试剂结合。然后样本继续流动到检测区。另一些试剂，如与被分析物特异性结合的分子被固定在检测区。这些试剂与样本中的被分析物(如果存在)反应并将被分析物结合在该区，或者与试剂区的某一个试剂结合。用于显示检测信号的标记物存在与试剂区或分离的标记区。典型的非竞争法分析模式是如果样本中含有被分析物，信号就会产生，如果不包含被分析物，就不产生信号。在竞争法中，如果被分析物不存在于样本中，信号产生，如果存在被分析物，则不产生信号。测试元件也可以是检测试纸，可以选用吸水或非吸水的材料。检测试纸可包括多种材料用于液体样本传递。其中一种检测试纸的材料可覆盖在另一种材料上，如滤纸覆盖在硝酸纤维素膜上。检测试纸的一个区可以选用一种或多种材料，而另一区选用其他不同的一种或多种材料。检测试纸可以被黏附在某种支持物或者硬质表面用于提高拿捏检测试纸的强度。被分析物通过信号发生系统而被检测到，如利用与本分析物发生特异性反应的一种或多种酶，利用如前述将特异结合物质固定在检测试纸上的方法，将一种或多种信号发生系统的组合物固定在检测试纸的被分析物检测区。产生信号的物质可在加样区，试剂区，或检测区，或整个检测试纸上，该物质可以充满检测试纸的一种或多种材料上。将含有信号物的溶液加到试纸的表面或将试纸的一种或多种材料浸没在含信号物的溶液中。使加入含信号物溶液的试纸干燥。检测试纸的各个区可以按以下方式排列加样区，试剂区，检测区。或有必要还可以包括控制区，以及确定样本是否掺假的区域，液体样本吸收区。控制区位于检测区之后。所有的区可以被安排在只用一种材料的一条试纸上。也可是不同区采用不同的材料。各个区可以直接和液体样本接触，或不同的区依据液体样本流动的方向排列，将各区的末端与另一区的前端相连并交叠。所用的材料可以是吸水性较好的材料如滤纸，玻纤或者硝酸纤维素膜等。检测试纸也可以采用其他形式。用于所公开的测试元件可以为现有技术中任何已知的测试元件，这样的测试元件包括但是不局限于现有技术中所熟知的免疫测定，化学测定和酶的试验，例如但不局限于，单一抗体免疫测定，多种抗体免疫测定，复合免疫测定，对比的免疫测定，非对比的免疫测定等等，包括利用辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，荧光素酶，抗体配对，抗体片断，荧光标记抗体，改性抗体，标记抗体，胶体金颗粒的抗体，或以着色乳胶体颗粒标记的抗体等等，它们都是现有技术中所熟知的。可以归入本装置的一些测试元件的实例可以在下面的美国专利中找到US 4857453 ；US 5073484 ；US 5119831 ；US 5185127 ；US 5275785 ；US5416000 ；US5424193 ；US 5504013 ；US 5602040 ；US 5622871 ；US 5654162 ；US 5656503 ；US5686315 ；US 5766961 ；US 5770460 ；US 5916815 ；US 5976895 ；US 6248598 ；US 6140136 ；US 6187269 ；US 6187598 ；US 622 8660 ；US 6235241 ；US 6306642 ；US 6352862 ；US6372515 ；US 6379620 ；US 6403383 ；US6656744 ；US6979576 ；US6372513 ；US 6372513。更进一步地，可以归入本装置的一些测试元件的实例可以在下面的美国专利申请中找到序列号为 09/579672 ；09/579673 ；09/653032 ；60/233739 ;09/915494，10/211199 和 09/860408。捡湿
检测表示化验或测试一种物质或材料是否存在，比如，但并不限于此，化学物质、有机化合物、无机化合物、新陈代谢产物、药物或者药物代谢物、有机组织或有机组织的代谢物、核酸、蛋白质或聚合物。另外，检测表示测试物质或材料的数量。进一步说，化验还表示免疫检测，化学检测、酶检测等。实施例为了更清楚的阐述本发明如何实现，现在以有限的实验进行说明，这些说明仅在本发明的权利要求的精髓下做有限的举例，并不构成对本发明权利要求的限制。没有特别指明，本发明所用的百分比均为质量百分比。
实施I :缓冲液中存在甲某-β-环糊精(RMCD)与不存在甲某-β-环糊精(RMCD)对检测唾液中大麻原型的比较。材料唾液收集器-40个海绵棒，40条检测试纸均为本公司自行生产，选取同一批号的产品；基础缓冲液体磷酸缓冲溶液(PH = 8. 3);比色卡。步骤I.配置100ng/ml A9-THC阳性大麻原型标准品2.向20个唾液收集器上的每个加3毫升100ng/ml Λ 9-THC的阳性大麻原型(或大麻酹)标准品溶液；3.用基础缓冲液配置成表I中A，B两种不同的缓冲液体，然后把这些缓冲液分别盛装在10个玻璃瓶内，每个玻璃瓶盛装3毫升缓冲溶液，然后把唾液收集器插入到这些玻璃瓶中，让玻璃瓶里的缓冲液体尽量淹没吸收液体的海绵体，然后来回挤压10次左右，丢弃唾液收集器，分别得到洗脱液体共20份(A处理10份；B处理10份)；4.另外用3毫升的基础缓冲液与3毫升100ng/ml Δ 9-THC阳性大麻原型标准品混合得到C处理10份；另外用3毫升的含I % RMCD的基础缓冲液与3毫升100ng/ml Δ 9-THC阳性大麻原型标准品混合得到D处理10份；5.把收集的以上四中液体各自滴加100微升到检测试纸的样本施加区域，每个处理10个检测试纸条；10分钟后用肉眼观察检测区是否有线条出现，并用标准的色卡(表2)来比较检测线条的颜色深浅程度。并与标准的色卡进行比较来判读检测结果(“ + ”表示阳性，表示阴性)。6.检测试纸条的准备按照如下方法准备如图IA所示的试剂条101用来说明本实验所用本发明的试剂条的部件和制作方法。6. I.硝酸纤维素膜的处理。检测片131为硝酸纤维素膜(NC)，在硝酸纤维素膜上有两条线条，一个是检测线207，位于检测线下游的检测结果控制线206。在检测线132上固定连接有IgG的链霉亲和素(streptavidin-IgG);在检测结果控制线133上固定羊抗兔IgG。固定的方法可以用自动喷膜处理机器来自动处理，其中在处理检测线条的浓度为O. 3毫克/毫升，稀释缓冲液体为磷酸缓冲液(PBS);在检测结果控制线上固定羊抗兔IgG抗体；浓度为O. 3毫克/毫升，稀释缓冲液体为磷酸缓冲液(PBS)。把处理好的硝酸纤维素膜放在37°C烘箱里烘干即可。6. 2标记片121的处理。标记片为聚脂膜，被胶体金颗粒标记好的带有耦联蛋白分子BSA的THC半抗原被处理在聚脂膜上。处理溶液的OD值为75，稀释溶液为I倍PBS缓冲溶液，其中还含有1%的BSA。在标记片上还处理有胶体金标记的兔IgG抗体。把处理好的标记片放在37°C烘箱里烘干即可。6. 3样本接受片111的处理。样本接受片为玻璃纤维素膜，在该膜上处理的溶液为=Borax(O. 07M/L) ；Tween20(l% ) ；Cholic Acid(l% ) ；Tris (O. 1M)。把处理好的样本接受片放在37°C烘箱里烘干即可。6.4.试剂条的组装。把处理好的各个部件按照图IB所示的样子组装，让样本接受片位于标记片的上游，标记片位于检测片和样本接受片之间，在检测片的下游放置吸水的滤纸。这些部件都放置在一个非吸水性的支撑片上。测试结果如下表I表I，含有环糊精与不含环糊精对被分析物THC吸附效果的影响
权利要求
1.一种用于检测样本中是否存在被分析物质的溶液，包括环糊精或环糊精的衍生物、起缓冲作用的缓冲系统。
2.根据权利要求I所述的溶液，其中，所述的环糊精选自a_环糊精，￠-环糊精和Y-环糊精中的一种或几种。
3.根据权利要求I所述的溶液，其中，所述的环糊精为￠-环糊精。
4.根据权利要求3所述的溶液，其中，所述的￠-环糊精为甲基-￠-环糊精、羟丙基-￠-环糊精、羟乙基-￠-环糊精、磺丁基-￠-环糊精、羧甲基-￠-环糊精、吡罗昔康-P -环糊精、磺丁基醚-P -环糊精中的一种或几种。
5.根据权利要求I所述的溶液，其中，所述的缓冲系统选自磷酸盐、醋酸，Tris-盐酸中的一种或几种。
6.根据权利要求I所述的溶液，其中，所述的溶液还包括抗四氢大麻酚或A9-THC的抗体，其中抗体与生物素耦联。
7.根据权利要求I所述的溶液，其中，所述的溶液还包括BSA，其中BSA与生物素耦联。
8.根据权利要求1-7之一所述的溶液，其中，所述的环糊精的质量百分比浓度为0.2-5%。
9.一种用于检测样本中是否存在被分析物质的系统，包括包括有环糊精或环糊精的衍生物的溶液系统,和包括样本收集器,其包括吸收样本的部件。
10.根据权利要求9所述的系统，其中，吸收样本的部件包括滤纸、无纺布或海绵。
11.根据权利要求10所述的系统,其中，吸收样本的部件为滤纸。
12.根据权利要求9所述的系统，其中，所述的溶液还包括抗四氢大麻酚或A9-THC的抗体，其中抗体与生物素耦联。
13.根据权利要求9所述的系统，其中，所述的溶液还包BSA，其中BSA与生物素耦联。
14.根据权利要求9所述的系统，其中，所述的环糊精的质量百分比浓度至少为0.2-5%。
15.根据权利要求9所述的系统，其中，所述的环糊精为￠-环糊精、a-环糊精和Y-环糊精的一种或几种。
16.一种用于检测样本中是否存在被分析物质的检测试纸，其中该试纸包括检测区域，以及位于检测区域上游并以干的形式存在的环糊精或环糊精的衍生物。
17.一种用于检测样本中是否存在被分析物质的方法，包括用收集器收集液体样本；让含有环糊精或环糊精的衍生物的溶液洗脱该收集器；测试洗脱液中的被分析物质。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，用测试元件测试洗脱液中的被分析物质。
全文摘要
本发明提供一种用于检测样本中是否存在被分析物质的溶液，包括环糊精或环糊精的衍生物、起缓冲作用的缓冲系统。利用该溶液可以提高毒品检测的灵敏度，特别是针对THC的检测，提高灵敏度的效果更明显。
文档编号G01N33/68GK102636376SQ20121007386
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月20日 优先权日2012年3月20日
发明者伍欣, 吴银飞, 赵福铨, 陈杰 申请人:艾博生物医药(杭州)有限公司
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