专利名称：持续焦虑小鼠特征蛋白质指纹图谱及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及特征蛋白质指纹图谱检测技术领域，涉及一种持续焦虑小鼠的特征蛋白质指纹图谱，以及该持续焦虑小鼠特征蛋白质指纹图谱的应用。
背景技术：
现代社会竞争不断加剧，由此引发的心理疾病日益增多，焦虑症作为一种普遍的心理障碍，也越来越大地威胁到人类的身心健康。流行病学研究表明，城市人口中大约有 4. 1 6. 6%的人群患有得焦虑症，但是，目前焦虑症的临床诊断准确率与符合率却并不尽如人意。近年来，在肿瘤学的探讨中，心理社会因素日益受到学者们的关注，研究结果显示， 心理因素在癌症的发生、发展和预后中有着不可忽视的作用。癌症作为一种心理应激，可导致抑郁、焦虑情绪，而抑郁、焦虑情绪又可加速癌症的恶化，降低患者的生活质量，影响癌症治疗的结局，增加医疗费用。癌症患者中焦虑抑郁症状的发生率明显高于正常人。但是，当前国内外对于焦虑的研究仅限于量表的测评，例如SAS焦虑自评量表、 HAMA焦虑量表等。上述各种焦虑评定量表具体操作方面专业性强，易受病人及评定人员主观因素的影响，影响观察的准确性和客观性，且实施起来较为复杂，量表评分不十分准确， 有一定的差异。它们大多是很实用的筛选焦虑症的评定量表，但并不能准确地反映焦虑状态，因此仅能为临床诊断焦虑症提供参考，而不能作为诊断的主要参考依据。2002年获得诺贝尔化学奖的蛋白质芯片表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer, SELDI-T0F-MS)的问世，为生命科学领域提供了一种强有力的分析测试手段。SELDI技术主要结合了质谱、层析等技术原理对样品进行大规模检测，优势是操作简单易行，无需纯化，样本用量少并可同时进行高通量分析，可直接对粗样本血清、组织、细胞裂解液、尿液等进行检测，通过SELDI检测获得相关蛋白质指纹图谱，在蛋白分离方面具有不可比拟的优势。该方法可以快速地分析各种生物样品中蛋白质组的组成，在基础医学研究、 临床疾病诊断以及药物研发方面显示出广阔的应用前景及临床意义。近年来的研究结果显示，焦虑症或焦虑情绪可能与一些蛋白表达相关。但采用 SELDI技术检测焦虑患者血清蛋白质指纹图谱的研究，尚未见公开文献报道。
发明内容
本发明的目的是建立一种持续焦虑小鼠的特征蛋白质指纹图谱，以提高对于持续焦虑症的判读准确性。提供持续焦虑小鼠特征蛋白质指纹图谱的应用，是本发明的另一发明目的。本发明的持续焦虑小鼠特征蛋白质指纹图谱是应用SELDI技术对持续焦虑小鼠血清进行检测，在质荷比(M/Z) 15000+H 16800+H之间产生的丰度彡5%的单组或双组峰簇。本发明在应用SELDI技术对持续焦虑小鼠的血清进行检测时，选择的是CMlO芯片(弱阳离子交换芯片)。将使用CMlO芯片检测的新鲜血清和储存在-80°C低温冰箱内的同一血清的蛋白质指纹图谱进行比较，未发现有明显的峰值变化。CMlO芯片的活性表面由弱羧基阴离子构成，通过离子亲和作用与蛋白质分子中带有正电荷的赖氨酸、精氨酸、组氨酸等氨基酸残基结合，作为WCX2芯片的改进型，在蛋白质结合区的周围有疏水涂层，使得蛋白质与芯片的结合更均勻。因此本发明选择变异性�。榷ㄐ院涂芍馗葱越细叩腃MlO芯片。本发明在应用SELDI技术对持续焦虑小鼠的血清进行检测时，检测到的蛋白质指纹谱型的质荷比(M/Z)下限为1+H，上限为25000+H。本发明应用SELDI技术对持续焦虑小鼠血清进行检测的具体方法是1)以任意一种焦虑小鼠动物模型构建方法构建持续焦虑小鼠动物模型，摘取小鼠眼球取血，静置离心分离血清，-80°C低温冰箱保存。2)自_80°C冰箱中取出血清样品，在冰浴上缓慢融解30 60min，4°C下IOOOOrpm 离心anin;向IOyL U9血清处理液中加入上述血清5 μ L，4°C下在摇床上600rpm振荡 30min，使充分混合，用Binding Buffer将U9处理后的血清稀释至200 μ L，4°C下在摇床上 600rpm振荡30min，用于上样。3)将CMlO芯片放入盛有lOOmmol/L盐酸的试管中，振荡4 5min，液谱纯水冲洗，将芯片安装到Bio-processor上，每孔加200 μ LBinding Buffer,室温振荡5min，弃掉
液体，重复一次。4)取上述经U9处理并稀释过的血清10(^1^加到01110芯片上，41下600印111摇床上振荡充分反应1小时后，去除样品。5)每孔加入200 μ L Binding Buffer,室温下摇床上600rpm振荡5min后除去液体。重复该过程2次。再用液谱纯水200 μ L快速清洗1次。6)将芯片从Bio-Processor中取出，自然干燥，每点加50%饱和SPA0. 5μ L，待其自然干燥后，重复点加1次，自然干燥。7)在SELDI-T0F阅读器中检测CMlO芯片，设定仪器初始激光强度195，灵敏度8， 检测蛋白质分子量范围2000 20000Da，优化范围2000 15000Da，以质荷比为横轴、相对分子量为纵轴得到特征蛋白质指纹图谱。对于得到的原始数据，先以ftOteinchipSoftward. 2软件校正，使总离子强度及分子量达到均一，并过滤噪音，设置初始噪音过滤值5，二次噪音过滤值2，以10%为最小阈值进行聚类。应用Bi0markerWizard3. 1软件寻找组间有差异的蛋白质峰(P < 0. 05)，用数据挖掘软件Biomarker Pattern Software对数据分组及相关性进行分析，寻找组间表达有差异的蛋白质峰，结合各个峰的权重，比较不同蛋白质峰排列组合的判别分析结果，选出最佳排列组合。用Biomarker Wizard3. 1软件自动分析比较血清蛋白质指纹图谱数据，采用 SPSS16.0统计软件储存和分析数据。计量资料用均数士标准差(χ士s)表示，统计学方法采用t检验和pearson相关分析。检验水准a = 0. 05，P < 0. 05认为有统计学意义。采取正常小鼠和以任何一种焦虑小鼠动物模型构建方法构建的持续焦虑小鼠动物模型的血清，分别采用上述实验方法进行操作，结果显示，正常小鼠的蛋白质指纹图谱中，质荷比(M/Z)在15000+H-16800+H之间丰度< 5%，无任何峰簇出现，说明在正常
4小鼠血清中不含有这种蛋白质或含量较低，焦虑症相关蛋白质指纹阴性，可能不存在焦虑症；与其相反，持续焦虑小鼠动物模型的血清蛋白质指纹图谱出现异常，在质荷比(M/ Z) 15000+H-16800+H之间有单组或双组峰簇出现，其丰度彡5%，与正常小鼠的蛋白质指纹图谱比较有差异性，说明在持续焦虑小鼠动物模型的血清中，这种焦虑蛋白质含量增高，焦虑症相关蛋白质指纹阳性，可能存在焦虑症。故而，本发明成功地从构建的持续焦虑小鼠动物模型上捕获到一组特征性的焦虑相关蛋白质指纹图谱。该特征蛋白质指纹图谱可以用于判断焦虑小鼠动物模型的构建是否成功。进一步地，本发明的特征蛋白质指纹图谱还可以作为诊断焦虑症有价值的界定值，应用在焦虑症的临床诊断筛选上。本发明提供的持续焦虑小鼠特征蛋白质指纹图谱为焦虑症的蛋白质组学研究注入了新的活力，使焦虑症的研究进入了分子水平，上升到了一个新的高度。本发明的特征蛋白质指纹图谱为临床早期诊断焦虑症及研究焦虑症的产生机制提供了有价值的客观依据， 避免了临床上量表评定的主观性和隐蔽性。将本发明的特征蛋白质指纹图谱界定值用作筛选诊断焦虑症的评价指标，可以为相应临床工作与基础研究提供有价值的工作平台。
图1为实施例中正常组小鼠血清的蛋白质指纹图谱；图2为实施例中模型组小鼠血清的特征蛋白质指纹图谱。
具体实施例方式下面结合附图对本发明的实施例作进一步的详细说明。一、实验动物及分组成年雌性昆明小鼠(山西省肿瘤医院研究所动物实验室提供) 只，体重20 30g,随机分成两组，正常组6只，模型组20只。正常组小鼠按照常规环境饲养，l i:12h，即7:00 19:00室内自然光照射， 19:00 7:00无光；笼具空间合适，温度20士2°C，湿度45 50%，有一定的休息睡眠时间； 期间动物可以自由摄食饮水。二、高架十字迷宫法构建持续焦虑小鼠动物模型实验所采用高架十字迷宫测试系统主要包括小鼠行为学测试系统。测试所用的笼具大小为45X 30cm，笼具内密闭无光。十字迷宫架高lm，架内轨道宽50cm，长:3m。将小鼠先放入笼具内进行喂养，笼内温度保持在，湿度保持在50 60%。 待小鼠体重达到70 80g时，将小鼠置于十字架迷宫内训练，持续刺激小鼠在迷宫内爬行， 期间不给于任何喂养，改变小鼠的睡眠习惯，直到小鼠出现异常行为。三、SELDI检测1)主要试剂CHAPS :3-环乙胺-1-丙磺酸(promegahc.美国)；Tris (上海生工生物工程公司)；NaAc 乙酸钠(上海生工生物工程公司)；DTT 二硫苏糖醇(Sigmahe.美国)； SPA:能量吸收基质(Ciphergenlne.美国)；TFA 三氟乙酸(Sigmalnc.美国)；ACN:乙睛 (Sigmalne.美国)；Urea 尿素(Sigmalne.美国)。
2)相关溶液的配制U9 (9mol/L Urea, 2% CHAPS, 50mmol/L Tris-HCl, ρΗ9· 0)称取 2. 7gUrea，加 3mL 液谱纯水和250 μ L lmol/L Tris-HCl充分溶解，再加入0. IgCHAPS充分溶解，以液谱纯水定容至4. 5 μ L，调ρΗ至9. 0,加入0. 05gDTT,定容至5 μ L，分装入500 μ L离心管，每管 IOOyL,以封口膜封口后，置于-80°C保存。Binding Buffer (50mmol/L NaAc, pH4. 0)称取 0. 82g 无水 NaAc，溶于 180mL 液谱纯水中，用HCl调节ρΗ至4. 0，以液谱纯水定容至200mL，4°C保存。1 % TFA溶液取TFA10 μ L，加入990 μ L液谱纯水中，混勻，封口，4 °C闭光保存。ACN分装取CAN ImL,分装为每管100 μ L，封口，4°C闭光保存。SPA 饱和溶液(50% ACN+0. 5% TFA)取 1 % TFA 溶液 80 μ L、ACN80 μ L,同时加入 SPA分装管中，在涡旋混合器上充分混合3min，静置5min，以IOOOOrpm离心5min后备用。幻SELDI血清蛋白质指纹图谱的检测1)取样分别取正常小鼠和上述构建的持续焦虑小鼠动物模型，摘取小鼠眼球取血，静置离心分离血清，-80°C低温冰箱保存。2)血清预处理自-80°C冰箱中取出血清样品，在冰浴上缓慢融解30 60min， 4°C下IOOOOrpm离心^iiin ；向10 μ L U9血清处理液中加入上述血清5 μ L，4°C下在摇床上 600rpm振荡30min，使充分混合，用Binding Buffer将U9处理后的血清稀释至200 μ L，4°C 下在摇床上600rpm振荡30min，将血清稀释约40倍，用于上样。3)芯片预处理将CMlO芯片放入盛有lOOmmol/L盐酸的试管中，振荡4 5min， 液谱纯水冲洗，将芯片安装到Bio-processor上，每孔加200 μ L Binding Buffer，室温振荡 5min,弃掉液体，重复一次。4)血清与芯片结合取上述经U9处理并稀释过的血清100 μ L加到CMlO芯片上， 4°C下600rpm摇床上振荡充分反应1小时后，去除样品。5)冲洗每孔加入200 μ L BindingBuffer,室温下摇床上600rpm振荡5min 后除去液体，重复该过程2次，再用液谱纯水200μ L快速清洗1次。用力甩干并将 Bio-processor倒扣在清洁的吸水纸上轻拍以去除多余的水。6)点加能量吸收分子(EAM)将芯片从Bio-Processor中取出，待芯片自然干燥后，每点加50%饱和SPA0. 5μ L，待其自然干燥后重复点加1次。自然干燥。7)芯片检测在SELDI-T0F阅读器中检测CMlO芯片，用加有All-in-one标准蛋白质的NP20芯片校正质谱仪，使误差<0. 1%。设定仪器初始激光强度195，灵敏度8，检测蛋白质分子量范围2000 20000Da，优化范围2000 15000Da，低于2000Da的蛋白质或肽段将自动从波谱中清除，因在0 2000Da这一区间可存在加合物、试剂成分、SPA以及其它化学成分，影响后续的数据分析。随后检测CMlO芯片，以质荷比为横轴、相对分子量为纵轴得到特征蛋白质指纹图谱。8)数据处理原始数据先以ftOteinchipSoftward. 2软件校正，使总离子强度及分子量达到均一，并过滤噪音，设置初始噪音过滤值5，二次噪音过滤值2，以10%为最小阈值进行聚类。应用Bi0markerWizard3. 1软件寻找组间有差异的蛋白质峰(P < 0. 05)。用数据挖掘软件Biomarker Pattern Software对数据分组及相关性进行分析，寻找组间表达有差异的蛋白质峰，结合各个峰的权重，比较不同蛋白质峰排列组合的判别分析结果，选出最佳排列组合。9)统计分析用Biomarker Wizard3. 1软件自动分析比较血清蛋白质指纹图谱数据，采用SPSS16. O统计软件储存和分析数据。计量资料用均数士标准差(χ士s)表示，统计学方法采用t检验和pearson相关分析。检验水准a = 0. 05，P < 0. 05认为有统计学意义。10)焦虑蛋白质指纹谱型的构建评估上述实验结果显示，正常组小鼠的蛋白质指纹图谱质荷比(M/Z)在 15000+H-16800+H之间丰度< 5%，无任何峰簇出现(图1)，说明正常组小鼠血清中不含有这种蛋白质或含量较低，焦虑症相关蛋白质指纹阴性，可能不存在焦虑症。与正常组相比，焦虑模型组小鼠的血清蛋白质指纹图谱出现异常，在质荷比(M/ Ζ) 15000+H-16800+H之间有单组或双组峰簇出现，其丰度彡5% (图2)，与正常小鼠的蛋白质指纹图谱比较有差异性，说明在持续焦虑小鼠动物模型的血清中，焦虑蛋白质含量增高， 焦虑症相关蛋白质指纹阳性，可能存在焦虑症。
权利要求
1.持续焦虑小鼠特征蛋白质指纹图谱，其特征是应用SELDI技术对持续焦虑小鼠血清进行检测，在质荷比(M/Z) 15000+H 16800+H之间产生的丰度彡5%的单组或双组峰簇。
2.根据权利要求1所述的持续焦虑小鼠特征蛋白质指纹图谱，其特征是在应用SELDI 技术对持续焦虑小鼠血清进行检测时，使用CMlO芯片。
3.根据权利要求1所述的持续焦虑小鼠特征蛋白质指纹图谱，其特征是检测的蛋白质指纹图谱质荷比下限为1+H，上限为25000+H。
4.持续焦虑小鼠特征蛋白质指纹图谱的构建方法，其特征是按照以下步骤进行1)以任意一种焦虑小鼠动物模型构建方法构建持续焦虑小鼠动物模型，摘取小鼠眼球取血，静置离心分离血清，-80°C低温冰箱保存；2)自_80°C冰箱中取出血清样品，在冰浴上缓慢融解30 60min，4°C下IOOOOrpm离心 2min ；向IOyL U9血清处理液中加入上述血清5 μ L，4°C下在摇床上600rpm振荡30min，使充分混合，用Binding Buffer将U9处理后的血清稀释至200 μ L，4°C下在摇床上600rpm振荡30min，用于上样；3)将CMlO芯片放入盛有lOOmmol/L盐酸的试管中，振荡4 5min，液谱纯水冲洗，将芯片安装到Bio-processor上，每孔加200 μ L Binding Buffer,室温振荡5min，弃掉液体，重复一次；4)取上述经U9处理并稀释过的血清100μ L加到CMlO芯片上，4°C下600rpm摇床上振荡充分反应1小时后，去除样品；5)每孔加入200μ L Binding Buffer,室温下摇床上600rpm振荡5min后除去液体，重复该过程2次，再用液谱纯水200 μ L快速清洗1次；6)将芯片从Bio-Processor中取出，自然干燥，每点加50%饱和SPA0. 5 μ L，待其自然干燥后，重复点加1次，自然干燥；7)在SELDI-T0F阅读器中检测CMlO芯片，设定仪器初始激光强度195，灵敏度8，检测蛋白质分子量范围2000 20000Da，以质荷比为横轴、相对分子量为纵轴得到特征蛋白质指纹图谱。
5.根据权利要求4所述的持续焦虑小鼠特征蛋白质指纹图谱构建方法，其特征是以 ProteinchipSoftware3. 2软件校正原始数据，设置初始噪音过滤值5，二次噪音过滤值2， 以10%为最小阈值进行聚类。
6.权利要求1所述持续焦虑小鼠特征蛋白质指纹图谱作为焦虑症界定值的应用。
7.权利要求1所述持续焦虑小鼠特征蛋白质指纹图谱在判别焦虑小鼠动物模型构建上的应用。
全文摘要
一种持续焦虑小鼠特征蛋白质指纹图谱，是应用SELDI技术对持续焦虑小鼠血清进行检测，在质荷比(M/Z)15000+H～16800+H之间产生的丰度≥5％的单组或双组峰簇。其构建方法是采集持续焦虑小鼠动物模型血清，将经U9处理并稀释的血清加到CM10芯片上，经结合、冲洗后点加能量吸收分子，在SELDI-TOF阅读器中检测得到以质荷比为横轴、相对分子量为纵轴的特征蛋白质指纹图谱。本发明的特征蛋白质指纹图谱可以作为焦虑症的界定标准，避免了临床上量表评定的主观性和隐蔽性，为临床早期诊断焦虑症及研究焦虑症的产生机制提供了有价值的客观依据。本发明的特征蛋白质指纹图谱还可以用于判别焦虑小鼠动物模型是否构建成功，结果真实准确。
文档编号G01N27/62GK102175748SQ20101059956
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者王清馨 申请人:王清馨
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
