专利名称：：一种人血清中肿瘤标记物Bicr6蛋白的质谱筛选方法
技术领域：
：本发明涉及一种人血清中肿瘤标记物Bicr6蛋白的质谱筛选方法，属于蛋白检测方法
技术领域：
。
背景技术：
：Birc6(baculoviralInhibitorofApoptosis(IAP)repeat-containing6)被认为是一种抗凋亡蛋白，其基因位于染色体2p22-21。目前birc6的主要检测方法包括蛋白免疫印记法、酶联免疫吸附法，它们的缺点是耗时、费力，灵敏度不够高，不适于大规模样本的筛选。
发明内容本发明的目的是克服上述问题，提供一种人血清中肿瘤标记物Bicr6蛋白的质谱筛选方法。为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种人血清中肿瘤标记物Bicr6蛋白的质谱筛选方法，其特征在于，具体步骤为第一步采取人全血，4摄氏度下凝固1小时，离心，取上层血清，保存在-80摄氏度冰箱中，将弱阳离子交换磁珠或免疫金属亲和铜离子磁珠与磁珠结合液在薄壁PCR管中混合，加入血清样本，室温孵育5min，将薄壁PCR管置于磁珠分离器内进行磁珠分离，移去上清，将所剩磁珠用磁珠洗涤液洗涤后，加入磁珠洗脱液，将薄壁PCR管置于磁珠分离器内进行磁珠分离，得到洗脱液，将洗脱液与磁珠稳定液混合得到磁珠富集液；第二步将第一步得到的磁珠富集液加入基质溶液，按以下条件进行基质辅助激光解离电离飞行时间质谱检测第一离子源电压20kv;第二离子源电压18.6kv;晶体电压7.6kv;脉冲离子时间320ns;极性正；矩阵抑制模式门控；门控强度最大；抑制高限600Da;检测器:1400-1500v;样本率1.00Gs/s;电子获取:增强，100mv;实时流畅高;激光频率20Hz;激光衰减关73%，范围20%;峰检测标准信噪比大于5，2Da峰宽过滤，最多峰数200;第三步分析第二步得到的质谱图，观察质谱图中质荷比为4964±1处是否有峰，若有峰，则血清中含有Bicr6蛋白。本发明的优点为本发明选用快速而敏感的基质辅助激光解离电离飞行时间质谱来检测血清birc6，属于蛋白质组学研究范畴，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱在发现和鉴定疾病相关的蛋白或多肽方面是一个非常有效的工具，已经被用来寻找多种疾病特异性标志，该技术联合磁性微粒富集血清蛋白的方法更加快速、有效和精确。这种以磁性微粒为基础的高敏感性和可重复性技术让其在蛋白组学研究领域独树一帜。本方法每次检测只需要数十分钟的时间，完成了血清birc6蛋白的富集和检测，相对于传统的蛋白免疫印记法、酶联免疫吸附法(耗时8小时以上)操作简单、省时，便于大批量样本的检测；因不依赖生物化学反应而不受反应条件的诸多限制，重复性高；另外传统方法的检测灵敏度为微克级，而本方法的检测灵敏度达纳克级，显著高于传统的方法。图1为一份经过磁珠富集后的人血清质谱检测图。具体实施例方式下面结合实施例来具体说明本发明。实施例1.主要试剂弱阳离子交换磁珠MB-WCX试剂盒(BrukerDaltonikGmbH，德国)，免疫金属亲和铜离子磁珠MB-IMACCu试剂盒(BrukerDaltonikGmbH，德国)ct-氰基-4-羟基肉桂酸a_Cyano_4_hydroxycinnamicacid(HCCA)(sigma，美国)丙酮(sigma，美国)乙醇(sigma，美国)AnchorChip革巴(BrukerDaltonikGmbH，德国)2.耗材和仪器真空采血管(BDVacutainerTM，美国)低温冰箱(SANYO,日本)涡旋混合仪(H101，上�？岛坦獾缫瞧饔邢薰�)恒温高速离心机(Z400K，HERMLE，德国)磁珠分离器(BrukerDaltonikGmbH，德国)AutoflexII基质辅助激光解离离子时间飞行质谱(BrukerDaltonikGmbH，德国)LC/MS/MS联用仪(美国应用生物系统公司，上海)其他注射器、E卯endorf管、加样枪、枪头等3.生物标本的收集选用BDVacutainerTM真空采血管(黄头盖)采取人全血后，4度下凝固1小时，用离心机按3000rpm共10min，取上层血清，保存在E卯endorf管内于-80度冰箱待用。4.血清样本前处理(1)在涡旋混合仪上将弱阳离子交换MB-WCX磁珠溶液或免疫金属亲和铜离子MB-IMACCu磁珠溶液彻底混匀lmin。(2)10ii1MB-WCX磁珠结合液和10ii1WCX磁珠溶液转移入一个标准的薄壁PCR管中，上下吹吸混匀。(或用50ii1MB-IMACCu磁珠结合液预处理5y1MB-IMACCu磁珠溶液，将薄壁PCR管放入磁珠分离器，将薄壁PCR管在相邻孔之间移动10次，聚集磁珠于管壁20s，用枪小心移去上清，重复二次，将MB-IMACCu磁珠重悬于20iUMB-IMACCu磁珠结合液中)。加入5iU人血清样本，上下吹吸5次，混匀液体。室温孵育5min。将PCR管置于磁珠分离器内，将管子前后移动3次后，聚集磁珠于管壁lmin，用枪小心移去上清。4向管中加入100ill磁珠洗涤液，将PCR管在磁珠分离器内前后来回移动IO次，注意磁珠的移动。聚集磁珠于管壁上20s，用枪小心移去上清。重复本步骤两次。加入5ii1MB-WCX磁珠洗脱液(或10MB-IMACCu磁珠洗脱液)，通过强烈的上下吹吸10次将磁珠从管壁上溶解下来，等待5min。将管子放入磁珠分离器，在管壁上聚集磁珠2min，将含有洗脱分子的上清转移进一个干净的管子中。向洗脱液中加入4iU磁珠稳定液，上下吹吸强烈混匀。将1ill洗脱的样品加入101的基质溶液(HCCA溶液，其在乙醇丙酮为2:1的溶液中浓度为0.3g/l)，点1yl到MALDI-TOF质谱靶上。5.质谱条件第一离子源电压20kv;第二离子源电压18.6kv;晶体电压7.6kv;脉冲离子时间:320ns;极性:正;矩阵抑制模式门控；门控强度:最大；抑制高限:600Da;检测器:1400-1500V;样本率1.OOGs/s;电子获取增强，lOOlW;实时流畅高；激光频率20Hz;激光衰减关73%，范围20%。峰检测标准信噪比大于5，2Da峰宽过滤，最多峰数200。6.结果分析如图1所示，为一份经过磁珠富集后的人血清质谱检测图，分析如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>上表中质荷比为4963.46处的峰即为Birc6蛋白的峰。7.标志物的进一步鉴定磁珠富集液用液相色谱质谱质谱联用仪进行鉴定，用MASCOT程序对质谱数据进行在线的国际蛋白参数(InternationalProteinIndex,IPI)数据库(http://www.ebi.ac.uk)查询。其中，液相色谱_质谱/质谱设备由二个LC-20AD的纳米流液相色谱泵、一个SIL-20AC自动进样器、LC-20AB微流液相色谱泵连接LTQ-Orbitrap质谱构成。样本装填于CAPTRAP柱，流速50ul/分，3分钟后进入C18反相柱进行液相分离，流速500nl/分，流动相为5%乙腈和0.1%甲酸(A相、装填相)、95X乙腈和0.1%甲酸(B相)，B相线性梯度5%-45%(60分钟)。分离后的样本通过ADVANCE30um二氧化硅接口端进入质谱仪，喷雾电压lkv，温度18(TC，数据依赖模式，每次完整质谱扫描质量范围400-2000Da，分辨力100000。肽段在LTQ部分应用氦气碰撞诱导解离，标化解离能量值35X。带2+和3+的解离峰被选做质谱/质谱分析。选用BioWorks3.3.1spl软件对IPI人类蛋白数据库进行在线搜索，条件2个可能误差位点，多肽质量偏差允许为10ppm，片段质量偏差允许为1.00Da。质荷比为4964士1的物质峰鉴定为birc6蛋白。权利要求一种人血清中肿瘤标记物Bicr6蛋白的质谱筛选方法，其特征在于，具体步骤为第一步采取人全血，4摄氏度下凝固1小时，离心，取上层血清，保存在-80摄氏度冰箱中，将弱阳离子交换磁珠或免疫金属亲和铜离子磁珠与磁珠结合液在薄壁PCR管中混合，加入血清样本，室温孵育5min，将薄壁PCR管置于磁珠分离器内进行磁珠分离，移去上清，将所剩磁珠用磁珠洗涤液洗涤后，加入磁珠洗脱液，将薄壁PCR管置于磁珠分离器内进行磁珠分离，得到洗脱液，将洗脱液与磁珠稳定液混合得到磁珠富集液；第二步将第一步得到的磁珠富集液加入基质溶液，按以下条件进行基质辅助激光解离电离飞行时间质谱检测第一离子源电压20kv；第二离子源电压18.6kv；晶体电压7.6kv；脉冲离子时间320ns；极性正；矩阵抑制模式门控；门控强度最大；抑制高限600Da；检测器1400-1500v；样本率1.00Gs/s；电子获取增强，100mv；实时流畅高；激光频率20Hz；激光衰减关73％，范围20％；峰检测标准信噪比大于5，2Da峰宽过滤，最多峰数200；第三步分析第二步得到的质谱图，观察质谱图中质荷比为4964±1处是否有峰，若有峰，则血清中含有Bicr6蛋白。全文摘要本发明提供了一种人血清中肿瘤标记物Bicr6蛋白的质谱筛选方法，其特征在于，具体步骤为取人血清，用磁珠吸附后洗脱得到磁珠富集液；将磁珠富集液加入基质溶液，按以下条件进行基质辅助激光解离电离飞行时间质谱检测第一离子源电压20kv；第二离子源电压18.6kv；晶体电压7.6kv；脉冲离子时间320ns；极性正；矩阵抑制模式门控；门控强度最大；抑制高限600Da；检测器1400-1500v；样本率1.00Gs/s；电子获取增强，100mv；实时流畅高；激光频率20Hz；激光衰减关73％，范围20％；质荷比为4964±1处的峰为Bicr6蛋白。本发明时间短、灵敏度高。文档编号G01N30/72GK101793882SQ201010105550公开日2010年8月4日申请日期2010年2月4日优先权日2010年2月4日发明者刘韬韬,沈锡中,董玲,薛如意申请人:复旦大学附属中山医院
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