专利名称：用于检测干燥综合症α-胞衬蛋白抗体的胶体金检测卡的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种干燥综合症α-胞衬蛋白(α-fordin)蛋白抗体的快速检测产品。
背景技术：
原发性干燥综合征(Primary sjogren's syndrome，pSS)是一种在遗传、病毒感染和性激素异常等多种因素作用下，引起机体细胞免疫及体液免疫反应异常的自身免疫病。 国外及国内何菁等的研究证实α-胞衬蛋白与原发性干燥综合征的发病有密切关系，对本病的诊断具有重要参考意义。陈巧林等进一步利用生物信息学方法对α -胞衬蛋白抗原表位进行预测分析，并以融合蛋白的方式体外重组表达含重叠序列的α-胞衬蛋白片段，对其抗原表位进行了筛选和鉴定，发现其序列中1 59位氨基酸为主要抗原表位所在区域(陈巧林，朴海燕，何菁等.干燥综合征特异性α-胞衬蛋白的抗原表位筛选及鉴定[J].中国免疫学杂志，2005; 21(11) :864-872.),其自身抗体在原发性干燥综合征中的阳性率为63. 75% (陈巧林，李晶，张翠华等.重组α-胞衬蛋白的表达及其在原发性干燥综合征临床研究中的意义[J]. 中国免疫学杂志，2006 ；22 (12) 1146-1149.)，在SSA抗体阴性、SSB抗体阴性和ANA阴性的原发性SS受测者中该表位多肽抗体的阳性率分别为37. 5%、42. 7%和48.2%，因此该表位多肽抗体的检测对于SSA抗体、SSB抗体及ANA阴性的原发性SS受测者的诊断具有重要意义，是临床原发SS受测者现有诊断抗体的有效补充(陈巧林，李想，何文智等.α-胞衬蛋白抗原多肽的筛选及其在干燥综合征临床诊断中的意义[J].临床免疫学，2007 ;23 (11) 1022-1025.)。近年来常用的抗体检测方法多为ELISA法，但检测需要特殊的仪器设备，且需要长时间的预杂交、杂交洗涤过程，并且要求专业技术人员进行，操作复杂，不适宜做现场快速检测。因此，人们仍然需要寻找快速、灵敏、低成本、操作简易的检测工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种方便、快捷的检测干燥综合症自身抗体的检测卡。本发明所述的一种用于检测干燥综合症α -胞衬蛋白自身抗体的胶体金检测卡， 包括从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维上涂有纳米胶体金标记的重组蛋白G ；所述硝酸纤维素膜上固定有大分子蛋白偶联 α-胞衬蛋白表位多肽，该α-胞衬蛋白表位多肽序列如SEQ ID NO :1所示；以及抗重组蛋白G抗体；其中，固定于靠近吸水纸一端的抗重组蛋白G抗体形成质控线，固定于靠近玻璃纤维一端的大分子蛋白偶联α-胞衬蛋白的表位多肽形成检测线。重组蛋白G (Recombinant Protein G)是从Mi^ptococci细菌中分离出来的胞壁蛋白，可与多数哺乳动物IgG的Fc段结合，重组蛋白G已经除去了其与白蛋白及细胞表面结合位点，减少了交叉反应和非特异性结合。因此，与天然蛋白G相比，重组蛋白G与蛋白A具有更大的亲和力与稳定性。本发明所述检测卡中α-fordin蛋白的表位多肽为大分子偶联，其多肽序列为 FQFFQRDAEELEKff (SEQ ID NO 1)，是发明人经实验确定的α-fordin蛋白的优选抗原表位多肽。根据本发明所述的胶体金检测卡的进一步特征，所述质控线与检测线相距 3-10mmo根据本发明所述的胶体金检测卡的进一步特征，所述固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸的相邻部分彼此重叠l-5mm。根据本发明所述的胶体金检测卡的进一步特征，所述纳米胶体金的粒径为 8-100nm。根据本发明所述的胶体金检测卡的进一步特征，所述偶联α-胞衬蛋白表位多肽的大分子蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白或钥孔虫戚血蓝蛋白；反应支持物优选PVC板， 金标重组蛋白膜优选聚酯膜、玻璃纤维膜。本发明所述检测卡检测的抗体为针对人α -胞衬蛋白N端46-59氨基酸位点的自身IgG、IgA抗体；所检测的样本为受测者的血清、血浆或全血。本发明的技术原理是以免疫色谱层析为基�。痹谘返嫔系渭友�(含待测自身抗体)时，由于毛细作用，抗体随样品液一起向前运动，当到达金标垫时，纳米金颗粒上包被的重组蛋白G与样品中的抗体结合，结合抗体的金颗粒继续向前移动，当到达检测区域时重组蛋白G结合的自身抗体与大分子偶联的表位多肽特异性结合而固定在检测线上形成红色条带，未结合的金颗粒继续向前移动，与质控线上的抗重组蛋白G抗体结合而固定在质控线上形成红色条带。如果样品中没有相应的自身抗体时，检测区域不出现红线， 而质控线上出现红线。因此，质控线出现红色线说明试纸条可用，而检测线出现与否是样品阴性和阳性的标准。整个检测过程只需要10分钟左右。本发明的特点和优点在于本发明通过在硝酸纤维素膜上包被大分子蛋白偶联 α-fordin蛋白的表位多肽、抗重组蛋白G抗体，分别形成质控线和检测线；结合胶体金标记的重组蛋白G，应用免疫色谱层析技术，检测干燥综合症α-fordin蛋白抗体。本发明所述的胶体金检测卡克服了现有技术操作复杂、耗时长、须要特殊仪器和专业人员的不足，能检测α -胞衬蛋白的自身抗体，检测迅速快捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易识别，适合基层检测，对干燥综合症的早期和中晚期都能起到辅助检测作用。
图1为本发明所述的胶体金检测卡的示意图。图2显示试纸条检测样品结果图。
具体实施例方式实施例一用于检测干燥综合症α -胞衬蛋白抗体的胶体金检测卡的制备1.大分子偶联α -胞衬蛋白表位多肽的制备根据α -胞衬蛋白抗原表位区域研究的结果，并结合计算机软件对α -胞衬蛋白抗原表位趋势进行预测，按抗原趋势指数设计合成α -胞衬蛋白46-59氨基酸区域多肽，采用固相法人工合成，HPLC纯化纯度均> 95%，此多肽再通过EDC法与BSA，OVA, KLH等大分子进行偶联，HPLC纯化纯度均> 98%。2.纳米金(胶体金)的制备在500ML的圆底烧瓶中加入IOOml 0. 01 %的HAuCL4溶液，磁力搅拌加热至沸腾； 然后向上述溶液中加入anl 枸橼酸钠，溶液变为酒红色后，继续煮沸lOmin，停止加热继续搅拌15min ；胶体金溶液4°C避光保存，纳米金通过520nm最大吸光度值鉴定。3.金标重组蛋白G的制备移取20ml胶体金溶液至一干净的烧杯中，快速搅拌下，加入0. lmol/LK2C03将PH 值调至7. 8，5分钟后用去离子水溶解200 μ g组蛋白G(浓度为lmg/ml)200ul缓慢滴加到金液中(蛋白标记量为lOug/ml)，室温半小时；用终浓度为的牛血清白蛋白封闭30分钟后，8400转/分钟离心25分钟，弃上清，沉淀用IOOul含5% BSA和10%蔗糖的0. 01mol/L PBS重新悬浮，制成悬浮液。4.样品垫的处理玻璃纤维浸泡0. 25% TritonX-100,0. 05M Tris_HCL、0. 15M NaCl 溶液后，37°C烘干备用。5.硝酸纤维素膜的处理将大分子蛋白偶联α -fordin蛋白的表位多肽、抗重组蛋白G抗体分别用PBS稀释为lmg/ml后按lyl/cm划膜，分别形成T线(5)和C线，37°C烘干后4°C保存待用。 (见图1)6.胶体金试纸条的组装将固定有大分子蛋白偶联α-fordin蛋白的表位多肽、抗重组蛋白G抗体的硝酸纤维素膜2、吸水纸1、结合纳米金标记重组蛋白G的玻璃纤维3、样品垫6依次固定于PVC 胶板上，相邻部分彼此重叠2mm，经切割成宽4mm后即得到本发明所述的免疫层析胶体金检测卡(见图1)。7.血清样品检测取100 μ 1血清缓慢滴加到检测卡滴样孔中，IOmin内观测结果。通过对80例临床确诊的原发性干燥综合征(PSQ患者和37例正常人血清中抗α-fordin蛋白抗体的检测发现其阳性率为63. 75% (51/80)，明显高于正常人的21. 67% (8/37) (P <0.01)，且各例正常人的阳性条带均明显浅于原发性干燥综合征患者，图2中A-C为原发性干燥综合征 (pSS)患者血清检测结果，检测卡C线(4)和T线(5)都显色，D为正常人血清检测结果，只有C线(4)显色。根据相关文献报道，抗α-fordin蛋白抗体在原发性干燥综合征(pSS) 患者血清中阳性率为70%左右，本检测卡对其检出率为63. 75%，本发明对原发性干燥综合征的诊断有重要意义。相比传统ELISA法，该方法更快速而灵敏度并无减少，适合自我早期诊断和大规模筛查。质量控制标准(图2)(I)C线(质控线)出现红色的线证明胶体金试纸条有效。线(检测线)出现红色的线与否，是阳性阴性判别的标准。结果判定标准(I)C线出现红色的线，同时T线出现红色的线，说明被检样品为阳性；
(2) C线出现红色的线，同时T线没有出现红色的线，说明被检样品为阴性；(3) C线没有出现红色的线，说明纳米生物传感器失效。
权利要求
1.一种用于检测干燥综合症α-胞衬蛋白自身抗体的胶体金检测卡，其特征在于包括从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维上涂有纳米胶体金标记的重组蛋白G ；所述硝酸纤维素膜上固定有大分子蛋白偶联α -胞衬蛋白表位多肽，该α -胞衬蛋白表位多肽序列如SEQ ID NO 1所示；以及抗重组蛋白G抗体；其中，固定于靠近吸水纸一端的抗重组蛋白G抗体形成质控线，固定于靠近玻璃纤维一端的大分子蛋白偶联α-胞衬蛋白的表位多肽形成检测线。本发明所述检测卡检测的抗体为针对人α -胞衬蛋白N端46-59氨基酸位点的自身 IgG、IgA 抗体
2.根据权利要求1所述的胶体金检测卡，其特征在于所述质控线与检测线相距 3-10mmo
3.根据权利要求1所述的胶体金检测卡，其特征在于所述固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸的相邻部分彼此重叠l_5mm。
4.根据权利要求1所述的胶体金检测卡，其特征在于所述纳米胶体金的粒径为 8-100nm。
5.根据权利要求1所述的胶体金检测卡，其特征在于所述偶联α-胞衬蛋白表位多肽的大分子蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白或钥孔虫戚血蓝蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测干燥综合症α-胞衬蛋白自身抗体的胶体金检测卡，包括从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；玻璃纤维上涂有纳米胶体金标记的重组蛋白G；硝酸纤维素膜上固定有大分子蛋白偶联α-胞衬蛋白表位多肽，该α-胞衬蛋白表位多肽序列如SEQ ID NO1所示；以及抗重组蛋白G抗体；其中，固定于靠近吸水纸一端的抗重组蛋白G抗体形成质控线，固定于靠近玻璃纤维一端的大分子蛋白偶联α-胞衬蛋白的表位多肽形成检测线。本发明的胶体金检测卡，制备简便、检测迅速，不需要专业的技术人员及昂贵的仪器设备，适合大批量检测，适用于基层，对干燥综合症的早期和中晚期都能起到辅助诊断作用。
文档编号G01N33/558GK102236016SQ20101015706
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月20日 优先权日2010年4月20日
发明者方志远, 曾令文 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院
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