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专利名称：：一种双抗体复合的视黄醇结合蛋白检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医学免疫体外诊断领域，特别是一种检测血清或尿液中的视黄醇结合蛋白测定试剂盒。
背景技术：
：视黄醇结合蛋白(RBP)为血液中视黄醇(维生素A)的转运蛋白。1961年Berggard在免疫电泳中发现在α2-球蛋白区域能形成一条长沉淀线的蛋白质，曾称为长Ci2-球蛋白。在以后几十年中，人们对这种蛋白质的分子结构、生物学特性等进行了全面研究，发现这种蛋白质广泛地分布于正常人体液中，属Ci1-球蛋白，具有从肝细胞中转运视黄醇至周围组织的功能。现认为血液中RBP主要以视黄醇、前白蛋白结合的复合物形式存在，当复合物中视黄醇与靶细胞结合后，RBP便与前白蛋白分离，自肾小球滤出，由近端肾小管上皮细胞吸收、降解。近年来的深入研究表明RBP含量改变能够敏感地反映近端肾小管功能、肝功能损害程度，是反映肾脏、肝脏及营养性疾病发展、转归的敏感指标。目前RBP的测定方法主要有酶联免疫法(EIA)、放射免疫法(RIA)及(ITA)，在上述三种方法中免疫透射分析法因其试剂稳定，操作自动化，检测结果快速、准确、可靠，因此成为临床实验室最具前景的测定方法。但目前市场视黄醇结合蛋白测定试剂盒由于抗体的纯度不够或效价达不到要求，同时，试剂配制过程中单纯采用一种抗体，导致试剂盒特异好而灵敏度不够，或灵敏灵较高但特异性较差。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服上述现有试剂盒存在的缺陷，提供一种双抗体复合的测定试剂盒来检测血清或尿液中视黄醇结合蛋白的含量，以达到操作简便、灵敏度高、特异性好，快速，测定结果准确可靠的目的。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是一种双抗体复合的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，由试剂R1、试剂R2及校准品三部分组成，试剂Rl为磷酸盐缓冲体系，其组成为ρΗ=7.2-7.6的磷酸盐缓冲液35-60mmol/L、聚乙二醇6000-800060-95mmol/L和乙二胺四乙酸二钠6-13mmol/L；试剂R2为抗体液，其组成为鼠抗人单克隆抗体2_4ml/L(效价大于1128)、兔抗人多克隆抗体3-5ml/L(效价大于116)、pH=7.2-7.6的磷酸盐缓冲液35-60mmol/L和乙二胺四乙酸二钠6-13mmol/L；校准品为110mg/L人血清基质的冻干品，其还包括叠氮钠0.2-2.2%、吐温-201_10%、牛血清白蛋白1_3%，上述的百分比为人血清基质体积用量的百分比。上述的叠氮钠也可采用其他的防腐剂，吐温-20也可采用其他的稳定剂，牛血清白蛋白也可采用其他的表面活性剂。本发明采用的复合抗体中羊抗人多克隆抗体效价大于116，鼠抗人单克隆抗体效价大于1128，多抗保证线性与高值，单抗保证灵敏度与低值；高纯度、高效价的抗体可以采用单点定标线性模式在l-110mg/L内即可完全保证测定结果的准确性，操作较其它厂家试剂盒采用的多点定标模式简便、快速，节约成本，测定结果准确可靠。本发明采用多克隆抗体和单克隆抗体的复合抗体保证了灵敏度与高线性，与目前临床实验室所用的视黄醇结合蛋白试剂盒比较，测定结果准确性大大提高。本发明中，对所述的抗体进行了纯化处理，其方法如下用粗抗原或纯化抗原交联到琼脂糖凝胶4B制成亲和层析柱，将粗抗体通过所述的亲和层析柱，洗去未结合的非特异性蛋白，再用硫氰酸钾洗脱，洗脱流出液即为纯的多克隆抗体。亲和层析技术的应用，大大提高了抗体的纯度与效价，最大限度避免了非特异性反应，使结果准确性有了较大提高，精密度更好。抗体的保存冻干抗体具有稳定性好、保质期长等特点，适合于长期保存，配成试剂后可加适量甘油与牛血清白蛋白(BSA)作稳定剂。本发明试剂盒的缓冲体系是PH值为7.2-7.6磷酸盐缓冲液，由于免疫复合物的形成有时限变化，当抗原抗体相遇后立即结合成小复合物(<19S)，几分钟到几小时才形成可见的复合物(>19S)。作为快速比浊测定，这种速度太慢，因此，加入聚合剂(或促聚剂)可加速大的免疫复合物形成。本发明加入促聚剂为多用聚乙二醇(MW60008000)，浓度约为4-6%。试剂的稳定性因素主要有抗体的纯度、缓冲液的品质、试剂中的悬浮小颗粒。小颗粒肉眼看不到，漂浮于试剂中，影响光的吸收，且用常规过滤无法去除，其主要成份为杂质、短纤维和细菌，这是导致瓶间与批间差大的原因之一。普通的过滤，无法去除肉眼看不到杂质，本发明为了在最大限度上提高试剂盒有效成分的含量，在生产过程中采用了微膜过滤，通过对过滤膜孔径的研究发现，小孔径过滤可以显著改善试剂的精密度，延长定标稳定期，缩小批间差。滤膜孔径与变异系数、定标有效期的关系(η=20)见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>当孔径在Iym时，基本可以除去一般的杂质微粒；当孔径在0.45μm时，基本可以除去短小纤维；当孔径在0.25μπι时，基本可以除去细菌等微生物。本发明所用的滤膜孔径选用0.25μπι或0.45μm。本发明试剂盒所采用的校准品为冻干人血清，该人血清基质由无HBV、HIV、HAV,HCV,TP传染源的健康人血清经浓缩后获得，由一级参考品和参考方法溯源定值，进一步减小了基质效应对测定结果的影响。由于采用了免疫层析的抗体纯化技术，在临床实验室应用时采用单点定标线性方程。不仅能保证测定结果的准确可靠，而且也避免了采用多点定标时繁锁的校准品倍比稀释过程，从而也降低了测定成本，因此，特别适合国内各级临床实验室的开展应用。本发明采用一种双抗体复合的测定试剂盒来检测血清或尿液中视黄醇结合蛋白的含量，通过两组抗体的复合应用大大提高了测定结果的准确性；同时，在试剂中加入了合适的表面活性剂乙二胺四乙酸二钠，能够使抗原抗体的结合位点充分裸露，从而进一步提高了反应的特异性。此外，由于本试剂盒采用的抗体效价高，且纯度好，完全可以采用单点定标的方程模式，从而更加方便临床实验室的使用，也降低了成本，在临床上具有较大的应用价值。下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步描述。图1为实施例1中视黄醇结合蛋白测定试剂盒单点定标曲线图。图2为实施例1中视黄醇结合蛋白测定试剂盒多点定标曲线图。图3为实施例1中视黄醇结合蛋白测定试剂盒单点定标与多点定标测定结果相关线性图。图4为实施例2中视黄醇结合蛋白测定试剂盒单点定标曲线图。图5为实施例2中视黄醇结合蛋白测定试剂盒多点定标曲线图。图6为实施例2中视黄醇结合蛋白测定试剂盒单点定标与多点定标测定结果相关线性图。图7为实施例3中视黄醇结合蛋白测定试剂盒单点定标曲线图。图8为实施例3中视黄醇结合蛋白测定试剂盒多点定标曲线图。图9为实施例3中视黄醇结合蛋白测定试剂盒单点定标与多点定标测定结果相关线性图。具体实施例方式实施例1测定试剂盒的组成如下RlρΗ7·4磷酸盐缓冲液45mmol/L聚乙二醇600078mmol/L乙二胺四乙酸二钠10.2mmol/LR2鼠抗人单克隆抗体2ml/L兔抗人多克隆抗体3ml/LρΗ7·4磷酸盐缓冲液45mmlo/L乙二胺四乙酸二钠10.2mmlo/L人血清基质校准品浓度110mg/L叠氮钠0.2%吐温-201%牛血清白蛋白本实施例描述的视黄醇结合蛋白测定试剂盒，适合于各种类型的全自动生化分析仪，以日立7060全自动生化分析仪为例，其操作如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>对所得的结果进行单点定标和多点定标。多点定标采用非线性定标中的Spline方程式，仪器自动生成定标曲线，根据定标曲线可自动计算出样品中的RBP浓度。从图2的定标曲线图可以看出，将110mg/L的RPB校准品进行8个浓度的倍比稀释后，测得的吸光度基本与稀释后的浓度成正比，多点定标曲线图为一条直线。且图1中单点定标时110mg/L的校准品浓度与多点定标时110mg/L的校准品浓度的吸光度值基本相同。由此可以分析出，本发明试剂盒可以采用单点线性定标方程来替代繁锁的多点定标方程。实施例1中视黄醇结合蛋白测定试剂盒单点定标与多点定标测定结果的对照测定数据见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>标本号单点定标测定结果(mg/L)多点定标测定结果(mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>计算两组实验数据的相关系数r=0.998488，通过实验结果与两组数据的相关线性图(见图3)表明，本发明试剂盒单点定标测定结果与多点定标测定结果高度相关，因此，测定结果在0-110mg/L范围内，本发明试剂盒完全可以采用单点线性定标来替代繁锁的多点非线性定标方程。实施例1视黄醇结合蛋白测定试剂盒与对照试剂实验数据对照本实验测定标本为对110mg/L的校准品进行一系列倍比稀释，稀释比例见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上述实验数据表明，国内商品试剂盒的测定结果在33mg/L以下，测定结果偏高至少20%以上，测定结果在99mg/L以上偏低9%以上.由于本发明试剂盒采用多克隆抗体、单克隆抗体等复合抗体技术不仅保证的测定的灵敏度，同时，也保证了测定的线性范围·在0-110mg/L内，测定结果的偏差均小于4%·实施例2视黄醇结合蛋白测定试剂盒组成如下RlρΗ7·6磷酸盐缓冲液60mmol/L聚乙二醇600095mmol/L乙二胺四乙酸二钠13mmol/LR2鼠抗人单克隆抗体3ml/L兔抗人多克隆抗体4ml/LρΗ7·6磷酸盐缓冲液60mmol/L乙二胺四乙酸二钠13mmol/L人血清基质校准品浓度110mg/L叠氮钠1.2%吐温-205.5%牛血清白蛋白2%实验过程同实施例1。从图5的定标曲线图可以看出，将110mg/L的RPB校准品进行8个浓度的倍比稀释后，测得的吸光度基本与稀释后的浓度成正比，多点定标曲线图为一条直线。且图4中单点定标时110mg/L的校准品浓度与多点定标时110mg/L的校准品浓度的吸光度值基本相同。由此可以分析出，本发明试剂盒可以采用单点线性定标方程来替代繁锁的多点定标方程。实施例2中视黄醇结合蛋白测定试剂盒单点定标与多点定标测定结果的对照测定数据见下表标本号单点定标测定结果(mg/L)多点定标测定结果(mg/L)~389398~~2278269““3425435~536528~~535Λ365~~6463457~~7689687~~872573Γ5~~9956%7120.5121.5~68767Γ9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>计算两组实验数据的相关系数r=0.999，通过实验结果与两组数据的相关线性图(见图6)表明，本发明试剂盒单点定标测定结果与多点定标测定结果高度相关，因此，测定结果在0-110mg/L范围内，本发明试剂盒完全可以采用单点线性定标来替代繁锁的多点非线性定标方程。实施例2视黄醇结合蛋白测定试剂盒与对照试剂实验数据对照本实验测定标本为对110mg/L的校准品进行一系列倍比稀释，稀释比例见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>上述实验数据表明，国内商品试剂盒的测定结果在33mg/L以下，测定结果偏高11.5%以上，测定结果在99!1^/1，以上偏低10.5%以上。由于本发明试剂盒采用多克隆抗体、单克隆抗体等复合抗体，不仅保证的测定的灵敏度，同时也保证了测定的线性范围在0-110mg/L内，测定结果的偏差均小于4%。实施例3视黄醇结合蛋白测定试剂盒组成如下RlρΗ7·2磷酸盐缓冲液35mmol/L聚乙二醇600060mmol/L乙二胺四乙酸二钠6mmol/LR2鼠抗人单克隆抗体4ml/L兔抗人多克隆抗体5ml/LρΗ7·2磷酸盐缓冲液35mmol/L乙二胺四乙酸二钠6mmol/L人血清基质校准品浓度110mg/L叠氮钠2.2%吐温-2010%牛血清白蛋白3%实验过程同实施例1。从图8的定标曲线图可以看出，将110mg/L的RPB校准品进行8个浓度的倍比稀释后，测得的吸光度基本与稀释后的浓度成正比，多点定标曲线图为一条直线。且图7中的单点定标时110mg/L的校准品浓度与多点定标时110mg/L的校准品浓度的吸光度值基本相同。由此可以分析出，本发明试剂盒可以采用单点线性定标方程来替代繁锁的多点定标方程。实施例3中视黄醇结合蛋白测定试剂盒单点定标与多点定标测定结果的对照测定数据见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>计算两组实验数据的相关系数r=0.999，通过实验结果与两组数据的相关线性图(见图9)表明，本发明试剂盒单点定标测定结果与多点定标测定结果高度相关，因此，测定结果在0-110mg/L范围内，本发明试剂盒完全可以采用单点线性定标来替代繁锁的多点非线性定标方程。实施例3视黄醇结合蛋白测定试剂盒与对照试剂实验数据对照本实验测定标本为对110mg/L的校准品进行一系列倍比稀释，稀释比例见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>上述实验数据表明，国内商品试剂盒的测定结果在33mg/L以下，测定结果偏高15.8%以上，测定结果在99!1^/1以上，偏低12.5%以上。由于本发明试剂盒采用多克隆抗体、单克隆抗体等复合抗体，不仅保证的测定的灵敏度，同时也保证了测定的线性范围在0-110mg/L内，测定结果的偏差均小于4%。权利要求一种双抗体复合的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，由试剂R1、试剂R2及校准品三部分组成，试剂R1为磷酸盐缓冲体系，其组成为pH＝7.2-7.6的磷酸盐缓冲液35-60mmol/L、聚乙二醇6000-800060-95mmol/L和乙二胺四乙酸二钠6-13mmol/L；试剂R2为抗体液，其组成为鼠抗人单克隆抗体2-4ml/L、兔抗人多克隆抗体3-5ml/L、pH＝7.2-7.6的磷酸盐缓冲液35-60mmol/L和乙二胺四乙酸二钠6-13mmol/L；校准品为130mg/L人血清基质的冻干品，其还包括防腐剂0.2-2.2％、稳定剂1-10％和表面活性剂1-3％，上述的百分比为人血清基质体积用量的百分比。2.根据权利要求1所述的测定试剂盒，其特征在于对所述的抗体进行了纯化处理，其方法如下用粗抗原或纯化抗原交联到琼脂糖凝胶4B制成亲和层析柱，将粗抗体通过所述的亲和层析柱，洗去未结合的非特异性蛋白，再用硫氰酸钾洗脱，洗脱流出液即为纯的多克隆抗体。3.根据权利要求1或2所述的的测定试剂盒，其特征在于试剂在生产过程中采用了微膜过滤，滤膜孔径选用0.25ym或0.45ym。全文摘要目前市场视黄醇结合蛋白测定试剂盒由于抗体的纯度不够或效价达不到要求，试剂盒特异好而灵敏度不够，或灵敏灵较高但特异性较差。本发明提供了一种双抗体复合的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，由试剂R1、试剂R2及校准品三部分组成，试剂R1为磷酸盐缓冲体系，其组成为pH＝7.2-7.6的磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000-8000和乙二胺四乙酸二钠；试剂R2为抗体液，其组成为鼠抗人单克隆抗体、兔抗人多克隆抗体、pH＝7.2-7.6的磷酸盐缓冲液和乙二胺四乙酸二钠。本发明采用多克隆抗体和单克隆抗体的复合抗体保证了灵敏度与高线性，测定结果准确性大大提高。文档编号G01N33/531GK101833009SQ20101015983公开日2010年9月15日申请日期2010年4月29日优先权日2010年4月29日发明者尹鹏申请人:浙江康特生物科技有限公司