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专利名称：：钠(离子)诊断/测定试剂盒及钠(离子)浓度测定方法
技术领域：
：本发明涉及一种钠(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钠(离子)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定
技术领域：
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背景技术：
：血清中钠离子含量(简称"血钠")在临床上有着非常重要的意义，医学上有三个决定水平，依次为水平1——115mmo1/1，水平2——135mmo1/1，水平3——150mmo1/1。当患者血钠浓度等于或低于水平1时，可出现神志不清、疲劳、恶心、头痛、呕吐和厌食等症状，表明机体内水的比例大于钠，应采用相应治疗措施；当血钠浓度低于水平2时，应查找低钠血症的原因，进一步测定血清渗透压、血钾并进行尿液分析，以确定诊断；当血钠浓度高于水平3时，应检査其它试验项目，寻找导致高钠血症的原因。现有技术中测定钠离子含量的常用方法有火焰光度计法、离子选择电极法、化学测定法、原子分光光度法、酶动力学法等。火焰光度计法——1950年开始使用并一直沿用至今，可检测血清、尿液、脑脊液及胸腹水中的Na+和K+，是一种发射光谱分析法，其结果准确可靠，广为临床采用。该方法分为内标准法和外标准法两种。外标准法操作误差较大，一般不采用。现在主要使用内部标准法，即向标本及标准液中加进相同浓度的内部标准元素锂或铯进行测定，操作时，将含锂的溶液作为稀释液，同时测定K+、Na+和Li+的浓度，以标本与标准液的^+/0+与1^+/0+比值，计算Na+、K+浓度。由于血清稀释倍数大，血清蛋白质粘性的影响几乎可以忽略不计。离子选择电极法——简称ISE法，是采用灵敏的特定专用电极，在专用仪器上进行血清和尿等体液中的K+、Na+的测定，因标本用量少，快速准确，6几乎有取代其它方法的趋势。其测定原理是，用离子选择电极与参比电极组合起来，浸泡在待测标本溶液中进行检测。目前已有的电极种类有①玻璃膜电极，感应材料为玻璃薄膜，有PH电极、K+电极和Na+电极；②固相膜电极，由难溶性金属物质加压成型，以固体膜或单日膜作为感应膜，有c卜电极和F-电极；③液态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯乙稀作为感应膜，有Cf电极；④用缬氨霉素膜制成的K+电极。上述电极均有一定的使用寿命，因为电极使用一段时间后就会自动老化，有效期长短不一。目前离子选择电极法应用也较为普遍，但是电极成本昂贵。此外，化学测定法主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，作为离子载体进行测定。由于大环结构内有空穴，分子内部的氧原子有未共用电子对可与金属离子结合，根据空穴大�。�可选择性结合不同直径的金属离子，从而达到测出离子浓度的目的；原子分光光度法也可用于检测血清中K+、Na+，但操作繁杂，误差较大，不及火焰光度法简便。酶法测定钠离子含量的方法，与火焰光度计法或离子选择电极法都有较好的一致性，这种方法抗干扰性强、稳定性好，但用生化分析仪不能同时测定钠离子和钾离子各自的含量，导致这种方法不能得到推广应用。
发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetricMethod)及酶联法(CoupleReaction)技术，计量通过酶联反应生成吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亚胺色原(Quioneiminedye)所导致在400—700nm波长处吸光度的上升，得以测定钠(离子)浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的钠(离子)诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行钠(离子)浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本发明钠(离子)浓度测定方法原理如下乳糖+水(3-半乳糖苷酶"3+葡萄糖+半乳糖葡萄糖+氧葡萄糖氧化酶葡糖酸内酯+过氧化氢过氧化氢+还原型色原组合过氧化物酶巧l嗒胺色原或醌亚胺色原+水这个方法应用需要钠离子激活的P-半乳糖苷酶((P-galactosidase;EC3.2丄23)具有乳糖酶(lactase;EC3.2丄108)的特性，(偶)联葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase;EC1.1.3.4)及过氧化物酶(peroxidase;EC1.11.1.7)酶促反应速率比色法。在钠离子的激活下，P-半乳糖苷酶酶解乳糖反应产生葡萄糖，再通过(偶)联合葡萄糖氧化酶、过氧化物酶的作用，最后生成的过氧化氢在过氧化物酶的作用下，将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400—700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染料一吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亚胺色原(Quioneiminedye)—含量高低的光吸收大�。煌ü�测量400—700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)处吸光度上升的速度，得出钠(离子)浓度大小测定结果。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下成分关系的本发明钠(离子)诊断/测定试剂盒较为理想缓冲液10Ommol/L稳定剂过氧化物酶(3-半乳糖苷酶葡萄糖氧化酶乳糖500mmol/L30000U/L10000U/L12000U/L20mmol/L还原型色原体组合0.1--20mmol/L所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任何一个配对组合3-甲基-2-苯噻唑酮腙石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基^N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N,N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2.4-双氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3.5-双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙双甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2,2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3-甲基-2-苯噻唑酮腙4-羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3-甲基-乙基-羥基苯胺94-氨基抗砒石碳酸4-氨基抗砒N-乙基一N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒N，N-双乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒2.4-双氯石碳酸4-氨基抗砒2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒3，5-双氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3.5-双氯-2-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒双甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺4-氨基抗砒2,2'-AZINO-双G-乙基苯噻唑-6-磺酸)4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒3-甲基-乙基-羥基苯胺本发明的钠(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、(3-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、乳糖、还原型色原体组合。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂试剂1缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、乳糖。试剂2缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、卩-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶。还原型色原体组合、P-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、乳糖在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂试剂1缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、乳糖。试剂2缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶。试剂3缓冲液、稳定剂、p-半乳糖苷酶。还原型色原体组合、(3-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、乳糖在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。具体实施例方式下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。本实施例的钠(离子)诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液100mmol/L稳定剂500mmol/L卩-半乳糖苷酶10000U/L葡萄糖氧化酶12000U/L过氧化物酶30000U/L乳糖20mmol/L4-氨基抗砒2mmol/L石碳酸10mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37i:，反应时间10分钟，测试主波长505nm，测试副波长600nm，被测钠(离子)样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的速度，从而测算出钠(离子)的浓度大小,实施例二本实施例的钠(离子)诊断/测定试剂为双试剂，包括试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液100mmol/L试剂2稳定剂乳糖2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液稳定剂(3-半乳糖苷酶葡萄糖氧化酶过氧化物酶4-氨基抗砒50mmol/L20mmol/L0.2mmol/L100mmol/L500mmol/L10000U/L12000U/L30000U/L0.6mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，测试主波长5Mnm，测试副波长600nm，被测钠(离子)样品与试剂的体积比例为1/20，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的速度，从而测算出钠(离子)的浓度大小。实施例三本实施例的钠(离子)诊断/测定试剂为三试剂，包括试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液100mmol/L稳定剂50mmol/L试剂2乳糖3-甲基-2-苯噻唑酮腙三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液稳定剂葡萄糖氧化酶过氧化物酶双甲基苯胺20mmol/L0.6mmol/L100mmol/L500mmol/L12000U/L30000U/L2mmol/L试剂三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液100mmol/L稳定剂500mmol/L10000U/L:试剂，可以直接使用。卩-半乳糖苷酶试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，测试主波长578nm，测试副波长660nm，被测钠(离子)样品与试剂的体积比例为1/30，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长578nm吸光度上升的速度，从而测算出钠(离子)的浓度大小。申请人经过实验验证，采用以上
发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。14总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.024;吸光度时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达50—200mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5%;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《3%;试剂的灵敏度可达0.00018±0.00009AA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。权利要求1.一种酶比色法及酶联法技术的钠(离子)浓度测定方法，其方法原理如下乳糖+水<u>β-半乳糖苷酶/Na</u><u>+</u>葡萄糖+半乳糖葡萄糖+氧<u>葡萄糖氧化酶</u>葡糖酸内酯+过氧化氢过氧化氢+还原型色原组合<u>过氧化物酶</u>吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400—700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度，得出钠(离子)浓度大小测定结果。2.—种钠(离子)诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20——500mmol/L稳定剂1——-4000mmol/L过氧化物酶500———80000U/L(3-半乳糖苷酶1000———80000U/L葡萄糖氧化酶1000———80000U/L乳糖l一50mmol/L还原型色原体组合0.1-20mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。3.根据权利要求2所述钠(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、(3-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、乳糖、还原型色原体组合组成单剂试剂。4.根据权利要求2所述钠(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、P-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、乳糖、还原型色原体组合组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、乳糖、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、P-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成。过氧化物酶、还原型色原体组合、(3-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、乳糖在试剂1或试剂2中的位置可以不限。5.根据权利要求2所述钠(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、卩-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、乳糖、还原型色原体组合组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、乳糖、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成；试剂3,由缓冲液、稳定剂、卩-半乳糖苷酶组成。还原型色原体组合、卩-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、乳糖在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。6.根据权利要求2所述钠(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂1一4000mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。7.根据权利要求2所述钠(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于所述还原型色原体组合可以是下列28个组合中的任一个配对组合3-甲基-2-苯噻唑酮腙石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基^N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N,N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2.4-双氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙2,4,6-仁溴-3-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3.5-双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙双甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3—甲基—2-苯噻唑酮腙2,2'-AZINO-双G-乙基苯噻唑-6-磺酸)3-甲基-2-苯噻唑酮腙4-羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3-甲基-乙基-羥基苯胺4-氨基抗砒石碳酸4-氨基抗砒N-乙基^N-G-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒N,N-双乙基-m-甲苯胺<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>全文摘要本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的钠(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钠(离子)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定
技术领域：
。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、乳糖、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及稳定剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出钠(离子)浓度的大小。文档编号G01N21/31GK101464358SQ20071019215公开日2009年6月24日申请日期2007年12月19日优先权日2007年12月19日发明者王尔中申请人:苏州艾杰生物科技有限公司