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专利名称：快速检测h5n1亚型禽流感病毒的胶体金测试试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型属于预防兽医学检验领域，具体是一种快速检测H5N1亚型禽流感 病毒的胶体金测试试纸条。
背景技术：
高致病性禽流感病毒(HPAI)是由H5N1型禽流感病毒引起的急性严重呼吸道 传染�。�其发病率和死亡率极高，是危害禽类的主要烈性传染病之一，被国际兽疫 局定为A类传染病。近年来研究发现，高致病性禽流感病毒病毒H5N1可突破种族 屏障，感染人类致病甚至死亡。根据世界卫生组织记录，自2003年底至2005年11 月14日发生人禽流感病毒疫情130例，67例死亡。其中柬埔寨4例，4例死亡， 越南93例，42例死亡，泰国21例，13例死亡，印度尼西亚ll例，7例死亡。中 国3例，2例死亡。使之成为严重�：θ死嘟】档亩裥源�染病之一，而且随着禽流 感病毒病毒H5N1对人类的不断适应与快速变异，以对人类的健康构成了极大的威 胁。因此，建立快速准确的H5禽流感病毒病毒诊断技术，是预防和控制HPAI扩散 和侵入的首要环节。
目前，对H5N1病毒的诊断方法，以普通人流感病毒为基础发展起来的主要有 病毒分离、血清学^^断以及分子生物学方法。但病毒分离时间长，要求条件高，分 离率低；而采集患者急性期与恢复期双份血清进行抗体测定来确认，又不能及时进 行诊断，因此，使这两种方法在使用中受到很大的限制。
发明内容
本实用新型的目的是提供一种快速检测H5N1亚型禽流感病毒的胶体金测试试 纸条，以解决现有技术存在的病毒分离时间长，要求条件高，分离率低，不能及时 进行诊断的问题。
本实用新型的技术方案是包括底衬、样品垫、涂覆胶体金颗粒标记抗体的玻 璃纤维膜、包被膜和吸水纸，包被膜的底面粘帖在底衬上面，在该包被膜两端的上 面分别粘帖玻璃纤维膜和吸水纸，在该玻璃纤维膜的另一端的上面粘帖样品垫；在该包被膜的上面设有检测线和控制线，该检测线包被H5N1亚型禽流感病毒的抗体， 该控制线包被抗鼠抗体。
所述的H5N1亚型禽流感病毒的抗体为高纯度的抗单克隆抗体和/或多克隆抗 体，所述胶体金颗粒标记抗H5N1亚型禽流感病毒的单克隆抗体。
本实用新型采用双抗体夹心法，可用来检测血液样品或者棉拭子等处理样品。 与现有检测试剂盒比较，由于对检测线(T线)和控制线(C线)进行了相应的处 理(主要是调整了 PH值和浓度等)，使其能够产生特异条带，从而满足现地农户、 基层检测的需求。
本实用新型具有高度特异性、灵敏度、检测速度等优点，且不需使用仪器设备， 成本低廉，操作筒便，快速，可以直接判断结果，养殖人员有无兽医基础都可以放 根据说明书操作。能广泛应用于现地农户、基层及个人对于H5N1亚型禽流感病毒 的检测。该试纸条可以直接使用，也可以装配在塑料装置中以检测板形式使用。


图1为本实用新型的侧面结构示意图； 图2为图1的俯^L图示意图3为本实用新型检测结果为阳性的示意图(包被膜4表面的检测线6和控制 线7均显色)；
图4为本实用新型检测结果为阴性的示意图(包被膜4表面的控制线7显色而 检测线6不显色)；
图5为试纸条无效的示意图(包被膜4表面的检测线6和控制线7均不显色)。
具体实施方式

如图l和图2所示，本实用新型包括底村l、样品垫2、涂覆约20nm厚的胶体 金颗粒标记(金标)抗体的玻璃纤维膜3 、包被膜4和吸水纸5，包被膜4的底面 粘帖在底衬1上面，在该包被膜4两端的上面分别粘帖玻璃纤维膜3和吸水纸5， 在该玻璃纤维膜3的另一端的上面粘帖样品垫2。在该包被膜4的上面设有检测线 6和控制线7，该4全测线6包被H5N1亚型禽流感病毒的抗体，该控制线7包被抗鼠 抗体。通过所述^r测线6和控制线7的显色来定性。
所述的H5N1亚型禽流感病毒的抗体为高纯度的抗单克隆抗体和/或多克隆抗 体，所述胶体金颗粒标记抗H5N1亚型禽流感病毒的单克隆抗体。本实用新型采用两条带显色的胶体金层析法制备，显带颜色为红色线条，能准
确检测出样品中H5N1病毒的含量。具体的制造方法如下
A. 包被膜4的制备在硝酸纤维素膜上分别喷涂抗H5N1禽流感病毒的抗体 及抗鼠IgG抗体，并呈两条线上下排列，分别形成所述的检测线6和控制线7。
检测线6:调试喷膜机，喷液量为25微升/35厘米，用包被緩冲液稀释抗H5N1 亚型禽流感病毒的单克隆抗体，浓度为70ug/ul，用喷膜机喷涂划线，室温晾干20 分钟；
控制线7:调试喷膜才几，喷液量为25孩i升/35厘米，用包#:缓冲液稀释抗鼠IgG 多克隆抗体，浓度为2mg/ml， ；f几器划线，两线间隔5mm,应细致均匀，室温晾干 20分钟。37。C封闭60分钟，取出后置37。C烘干处理两小时，封袋备用；
B. 金标抗体的制备用0.1M碳酸钾调胶体金pH值至7.5,按15微克抗体/ 毫升胶体金加入抗H5N1亚型禽流感病毒的单克隆抗体，混勻，静置30分钟， 12000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，最后一次其去上清， 将沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解，置4'C备用，效期7天。
C. 将制备好的金标抗体涂覆在玻璃纤维膜或聚酯膜上形成涂覆金标抗体的 玻璃纤维膜3。
所述涂覆金标抗体的玻璃纤维膜3可以用普通方法将金标抗原涂覆在玻璃纤维 膜上，也可以通过下述方法得到将标记好的胶体金均匀地铺在玻璃纤维膜上，每 毫升溶液铺10平方厘米，冷冻干燥，封袋，置4。C备用。
D. 在底衬1上顺次相互搭接地粘贴样品垫2、涂覆金标抗原的玻璃纤维膜3、 包被膜4以及吸水纸5，得到本实用新型试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸 条。
所述包被緩冲液和封闭液的配方及制备方法是本领域通用的技术。 上述制备方法所涉及的各种材料的具体制备方法进一步详细说明如下
A. 抗原制备采用高纯度的抗H5N1亚型禽流感病毒的单克隆抗体作为包被抗原。
B. 抗原膜的制备
包被緩冲液的制备0.05MpH9.6碳酸盐緩冲液为包被溶液，0.22u膜过滤，置 4。C备用，效期7天。
封闭液的配置配制0.01MpH7.0磷酸盐緩冲液(PBS), 0.22u膜滤过，置4°C 备用，效期7天。配制封闭工作液2%BSA， 2%脱脂奶，0.01MpH7.0 PBS, 0.22u膜过滤，置4i:备用，效期3天。
C. 金标抗体的制造规程
氯金酸的配制用双蒸水溶解氯金酸，配成1%溶液，置4。C备用，效期3天。 1000ml 1 %氯金酸溶液配方10g氯金酸；1000ml双蒸水。
柠檬酸三纳的配置用双蒸水溶解柠檬酸三纳，配成iy。溶液，置4r备用，
效期3天。
O.IM碳酸钾的配制用双蒸水配制，0.22u膜过滤，置4。C备用，效期7天。 1000ml0.1M石友酸钾溶液配方13.8g石友酸《甲；1000ml双蒸水。
3%PEG-20000的配制:用双蒸水配制，0.22u膜过滤，置4。C备用，效期7天。 1000ml3。/。PEG溶液配方30gPEG-20000; 1000ml双蒸水。
标记洗涤液的配制2%BSA, 0.01MpH7.0PBS溶液，0.22u膜过滤，置4。C备 用，效期两周。1000ml标记洗涤液的配制20gBSA; 1000ml 0.01MpH7.0 PBS溶 液。
金标抗体保存液的配制1%BSA, 0.5%脱脂奶，5/万NaN3， 0.1% Tween-20, 0.01MpH7.0PBS溶液，0.22u膜滤过，置4。C备用，效期15天，1000ml金标抗 体保存液的配置10gBSA;5g脱脂奶；0.5g NaN3;lml Tween墨20;1000 ml 0.01M pH 7.0 PBS溶液。
胶体金的烧制用双蒸水将1%氯金酸稀释成0.01%，置电炉煮沸，按每IOO 毫升0.01 %氯金酸加入4毫升1 %柠檬酸三纳，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停 止加热，冷却至室温后补足失水。外观应纯净，透亮，无沉淀和漂浮物。
金标抗体的制备用0.1M碳酸钾调胶体金pH值至7.6,按10微克抗体/毫升 胶体金加入抗抗H5N1亚型禽流感病毒的单克隆抗体，混匀，静置30分钟，12000rpm 离心三十分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，最后一次弃去上清，将沉淀 用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解，置4。C备用，有效期一周。
D. 金条抗体的干燥
将标记抗体的胶体金均匀地铺在玻璃纤维膜3上，每毫升溶液铺10平方厘米， 干燥，封袋，置4"C备用。
E. 金标抗体包被的玻璃纤维膜3宽度的确定将胶体金玻璃纤维膜3裁成4毫 米、5毫米、6毫米规格，与包被膜4组成测试条，每条宽4毫米。选择能检出室 内质控样本，无非特异性反应的金标玻璃纤维膜宽度定为使用宽度。
R金标抗体玻璃纤维膜3的裁切根据滴配实验确定的宽度，将金标抗体玻璃纤维膜3进行裁切，置干燥房间备用。
G. 吸水纸5的裁切
用裁纸机将吸水纸5切成35厘米长，4.2厘米宽，置于干燥房间备用。
H. 玻璃纤维膜的裁切将玻璃纤维模切成长35厘米，宽2厘米的长条，置于干 燥房间备用。该玻璃纤维膜是没有标记抗体的玻璃纤维膜，其起到引导液体流动通 路的作用。
I. 大板的粘贴
按要求把包被膜4、吸水纸5、冻干的金标抗体(已经涂覆在玻璃纤维膜3上)、 玻璃纤维膜3粘贴在塑料底板1上，组成大板。组装车间温度控制在25。C,湿度 20%-30%。
J.切条
用切条机将大板切成单个人份，每人份宽度3毫米，随机抽检，灵敏度能检出 室内质控，条带显色程度达到一个"+ "号，无非特异性条带。 K.封装与组盒
将l份已切好的试纸条与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，放入试剂盒，与 4-20。C避光保存。
本实用新型采用高纯度的抗H5N1亚型禽流感病毒的单克隆抗体作为包被抗原 进行特异的H5N1亚型禽流感病毒检查。其原理是试纸条中含均匀分布的胶体金标 记H5N1亚型禽流感病毒的单克隆抗体，抗H5N1亚型禽流感病毒的抗体及抗鼠IgG 抗体分别固定于硝酰膜上并呈两条线上下排列，抗鼠IgG抗体在上方为阴性对照， 抗H5N1亚型禽流感病毒的抗体在下方为检测线。当被检样中含有H5N1亚型禽流 感病毒的抗原时，H5N1亚型禽流感病毒先和金标记的H5N1亚型禽流感病毒的抗 体进行特异性吸附，形成Ag-Abp复合物。由于微孔滤膜的毛细管作用和层析作用， 反应复合物沿硝酰膜向前移动，待行至抗ccH5Nl亚型禽流感病毒的抗体线时，形成 Aba-Ag-Ab(3-Au复合物而富集在包被线上，最终形成一条红色沉淀线，是为H5N1 亚型禽流感病毒的阳性反应。而试纸条上无关的金标记鼠IgG随尿液继续上行至抗 鼠IgG抗体处，与之形成红色标记的抗原抗体复合物是为阴性对照。
本实用新型用于检测时，检测线6和控制线7通过控制胶体金颗粒的大小与多 少，得到颜色不同深浅的检测线和控制线从而确定H5N1亚型禽流感病毒的有无。 观察检测线6和控制线7的显色和形状即可判断样品是阳性还是阴性。如图3所示，当检测线6和控制线7均显色时，结果为阳性；如图4所示，当控制线7显色而检 测线6不显色时，结果为阴性。
图5为试纸条无效的示意图(包被膜4表面的检测线6和控制线7均不显色)。
权利要求1、一种快速检测H5N1亚型禽流感病毒的胶体金测试试纸条，其特征在于包括底衬(1)、样品垫(2)、涂覆胶体金颗粒标记抗体的玻璃纤维膜(3)、包被膜(4)和吸水纸(5)，包被膜(4)的底面粘帖在底衬(1)上面，在该包被膜(4)两端的上面分别粘帖玻璃纤维膜(3)和吸水纸(5)，在该玻璃纤维膜(3)的另一端的上面粘帖样品垫(2)；在该包被膜(4)的上面设有检测线(6)和控制线(7)，该检测线(6)包被H5N1亚型禽流感病毒的抗体，该控制线(7)包被抗鼠抗体。
2、 根据权利要求1所述的快速检测H5N1亚型禽流感病毒的胶体金测试试纸条， 其特征在于所述的H5N1亚型禽流感病毒的抗体为高纯度的抗单克隆抗体和/或多 克隆抗体；所述的胶体金颗粒标记抗体为抗H5N1亚型禽流感病毒的单克隆抗体； 抗H5N1亚型禽流感病毒的抗体及抗鼠IgG抗体分别固定于硝酰膜上并呈两条线上 下排列，形成所述的检测线(6)和控制线(7)。
专利摘要本实用新型涉及一种快速检测H5N1亚型禽流感病毒的胶体金测试试纸条，包括底衬、样品垫、涂覆金标抗体的玻璃纤维膜、包被膜和吸水纸，包被膜的底面粘帖在底衬上面，在该包被膜两端的上面分别粘帖玻璃纤维膜和吸水纸，在该玻璃纤维膜的另一端的上面粘帖样品垫；在该包被膜的上面设有检测线和控制线，该检测线包被H5N1亚型禽流感病毒的抗体，该控制线包被抗鼠抗体。本实用新型具有高度特异性、灵敏度、检测速度等优点，且不需使用仪器设备，成本低廉，操作简便，能广泛应用于现地农户、基层及个人对于H5N1亚型禽流感病毒的检测。该试纸条可以直接使用，也可以装配在塑料装置中以检测板形式使用。
文档编号G01N33/552GK201397335SQ20092015067
公开日2010年2月3日 申请日期2009年5月18日 优先权日2009年5月18日
发明者崔尚金 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所