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专利名称：表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的筛选方法及由其筛选的抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及表皮生长因子受体(EpidermalGrowth Factor Receptor :EGFR),X 其，涉及能够迅速大量筛选出抑制上述EGFR的酪氨酸激酶(tyrosine kinase)的活性的抑制剂(inhibitors)的筛选方法，更具体而言，涉及利用蛋白质芯片而超高速地大量筛选出抑制EGFR酪氨酸激酶活性的物质的方法，以及由此筛选出的抑制剂。
背景技术：
表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Rec印tor ；以下简称为〃 EGFR") 是分子量为170千道尔顿(kDa)的结合在膜上的蛋白质，其在上皮细胞的表面上被表达出来。EGFR属于作为细胞周期调节分子类(class)的蛋白质酪氨酸激酶的生长因子受体家族 (family)。EGFR在胞外区结合自身的配体(EGF或TGF-α )时被激活，其结果，使同一受体的细胞内的酪氨酸激酶区发生自身磷酸化反应。EGFR 为作为生长启动癌基因(growth promoting oncogene)的 erbB 或 ErbBl 的蛋白质产物，该erbB或ErbBl为，在被认为在多种人类癌症的发病和发展中起到重要的作用的原始致癌基因(protooncogenes)ERBB家族中的一员。尤其，观察出了不仅在胶质母细胞瘤(glioblastomas)，还在乳房癌，膀胱癌，肺癌，头部癌，颈部癌，及胃癌中，EGFR的表达增加。ERBB癌基因家族，将在结构上有关联的4个跨膜(transmembrane)受体，S卩，EGFR、 HER-2/neu (erbB2) ,HER-3 (erbB3)以及HER-4 (erbB4)进行编码。临床上报道了如下内容， 即，对肿瘤而言，ERBB癌基因的增幅和/或受体的过度表达不仅与对治疗方法的反应性有关，还与疾病的复发和患者的预后不良有关。EGFR由下述的3个主要区域构成，即为胞外区(extracellular domain ECD)，其被糖基化(glycosylated)，且包含具有作为双半胱氨酸富集区域的配体结合袋 (ligand-binding pocket)；短的跨膜区；以及，胞内区，其具有固有的酪氨酸激酶活性。跨膜区使配体结合区与胞内区结合。随着对非糖基化形态的EGFR的研究，通过对氨基酸和 DNA碱基序列的分析得知，EGFR的蛋白质骨架的分子量为132kDa，且具有1186个氨基酸残基。当EGF或TGF-α与EGFR结合时，信号传导通路被激活，其结果，细胞增殖。 EGFR分子的二聚化(dimerization)、构象变化(conformational change)以及内在化 (internalization)起到传导细胞内信号的作用，其通过调节细胞的生长而实现。由于影响生长因子受体功能的调节、或受体或配体的过度表达而相连的基因突变，因此其结果细胞增殖。进一步，已知，对于化疗或对放射线的耐药性而言，EGFR在细胞的分化、细胞运动性 (motility)的提高、蛋白质的分泌、血管新生(neovascularization)、侵犯(invasion)以及癌细胞转移等中起到某种作用。在癌症治疗中，用于干预治疗(therapeutic intervention)的有前景的靶标中包含属于人表皮生长因子受体激酶轴(HER kinase axis)的多个成员。所述成员在
4例如前列腺、肺或乳房的实体性上皮细胞瘤(solid epithelial tumor)等中，经常过度表达(upregulated)，此外，在胶质母细胞瘤(glioblastoma)等中也过度表达。EGFR 为HER激酶轴的成员之一，一直以来成为用于开发几种相互不同的癌症的治疗方法而选择的靶标。EGFR 酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitors :EGFR-TKIs) 为这样的治疗方法之一，其理由在于，EGFR通路的激活需要酪氨酸残基的可逆磷酸化过程。换言之，EGFR-TKI对起到触发和/或维持引起肿瘤细胞生长和分化的细胞信号通路的作用的细胞表面受体进行阻断。具体而言，认为这些抑制剂对命名为HER-I的 EGFR激酶区域进行干涉(interfere)。更加有效的EGFR-TKI中存在三种化合物系列， 它们是喹唑啉(quinazolines)、吡啶并嘧啶(pyridopyrimidines)以及吡咯并嘧啶 (pyrrolopyrimidines)。已经出现了对上述EGFR的多种抑制剂，其中包含已作为对多种癌症的治疗而进行临床实验的多种抑制剂。最新的摘要可参阅de Bono, J. S. and Rowinsky, Ε.K. (2002)," The ErbB Receptor Family :A Therapeutic Target For Cancer" ,Trends in Molecular Medicine,8, S19—26。例如，如图1所示，在EGFR的胞外区上结合自身的配体(EGF或TGF- α )而信号传导通路被激活时，存在于胞内区的EGFR激酶，在磷酸基的存在下，使ΡΙ3-Κ、GRB2、SOS等 EGFR激酶底物(substrate)上的酪氨酸(Tyr)磷酸化(pY)，从而激发细胞的信号传导。但是，此时如果存在EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)，上述EGFR-TKIs则会对EGFR激酶区进行干涉(interfere)而抑制上述底物的酪氨酸被磷酸化，从而阻断细胞的信号传导通路。最近，出现了对上述EGFR的多种抑制剂，临床开发后被注册新药的化合物中的两种为吉非替尼(Gefitinib)(由AstraZeneca UK Ltd.开发的化合物ZD1839 ；能够以商标名易瑞沙(IRESSA)购入，以下简称为"IRESSA“)和厄罗替尼(Erlotinib)(由Genentech, Inc.和OSIPharmaceuticalsdnc.开发的化合物0SI774 ；能够以商标名特罗凯(TARCEVA) 购入，以下简称为‘‘TARCEVA〃)，两者皆得到了鼓舞性的临床结果(Presentations at ASCO 2003 and WCLC, Aug. 2003)。使用IRESSA或TARCEVA的现有的癌症治疗方法为，将各化合物以不超过500mg的量每日口服给药。IRESSA. 和TARCEVA 为口服有效(orally active)
的喹唑啉系化合物，其直接抑制EGFR分子上的酪氨酸激酶的磷酸化。以竞争性方式作用于 EGFR的三磷酸腺苷(ATP)的结合部位。此外，酪氨酸激酶抑制剂中还包含EGFR抑制剂，其已知的种类有AG494、AG825、 AG1478> EI-146> HDBA> Tyrphostin 46、Tyrphostin 47、 Tyrphostin 51 \)JsR Tyrphostin 1等。另外，还开发出了用于抑制EGFR的小型核苷酸抑制剂(U. S Pat. Nos. 5914269and 6187585)。另一方面，现有的酪氨酸激酶抑制剂筛选技术为，在研究所或医院等中以诊断为目的且被广泛采用的技术之一的酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbentassay, ELISA)为唯一可用的方法。但是，该方法不仅需要较多的蛋白质的量，而且为非特异性反应，且存在不适于大量筛选的问题。由此，如今切实需要一种为了筛选EGFR激酶抑制剂而将数万个化合物快速且容易进行筛选的方法。

发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种，能够从各种单一化合物库中迅速地大量筛选出，能够优秀地抑制EGFR酪氨酸激酶的活性的新的抑制物质的方法。另外，本发明的目的在于，事先从包含在单一化合物库中的多个化合物中拣选出候选物质，以准备化合物池(Pool)，从而减少用于筛选的费用和时间，并更容易地筛选出具有比现有技术更显著的优秀的抑制效果的抑制剂。另外，目的在于，通过如上所述方法来筛选出，能够优秀地抑制由EGFR激酶引起的自身磷酸化以及其它多种底物的磷酸化的酪氨酸激酶抑制剂，并通过如此筛选出的抑制剂来更加提高，在与EGFR相关的疾病中的药物(medicines)的有效性。为了达到上述目的，本发明提供一种EGFR酪氨酸激酶抑制剂的筛选方法，其为表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor :EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitors :EGFR_TKIs)的筛选方法，其包含在蛋白质芯片上附着能够被EGFR酪氨酸激酶激活的EGFR酪氨酸激酶底物(substrate)的步骤；在附着有所述底物的蛋白质芯片上使EGFR酪氨酸激酶、ATP、Mg2+以及单一化合物库的化合物池进行反应的步骤；使能够识别由所述反应而被磷酸化的底物且附着有荧光物质的抗体，与所述被磷酸化的底物进行反应的步骤；在与所述被磷酸化的底物的反应结束之后，用缓冲溶液洗涤的步骤；以及测定所述洗涤后的荧光物质的强度的步骤。在此，还可以在使所述单一化合物库的化合物池进行反应的步骤之前，还包括对所述单一化合物库所包含的多个化合物进行药效基团(pharmacophore)的搜索，并进行与所述EGFR酪氨酸激酶的结构虚拟结合的对接仿真的步骤；以及通过所述药效基团搜索和对接仿真所选择的化合物来准备化合物池的步骤。另外，所述药效基团(pharmacophor)的搜索是指，从由喹唑啉(quinazolines)、 吡啶并嘧啶(pyridopyrimidines)以及吡咯并嘧啶(pyrrolopyrimidines)所组成的群中选择的至少一个作为基本模型(model)，从而选择出与所述基本模型的结构相似性较高的一定数量的化合物。所述对接仿真的执行，更优选如下方式，即，使所述选择出的一定数量的化合物与所述EGFR酪氨酸激酶进行虚拟结合，从而选择出结构上匹配可能性较高的一定数量的化合物。另外，还可以是所述EGFR酪氨酸激酶底物为，选自PLC-gammal、EGFR、aic、Grl32/ mSos、P91、PI3-kinase、Ras/Gap以及Cbl中的至少一个物质，且所述单一化合物库由低分子化合物和天然来源化合物组成。进一步，与所述被磷酸化的底物进行反应的步骤，优选包括使能够识别由所述反应而被磷酸化的底物的第一抗体，与所述被磷酸化的底物进行反应的步骤；以及使能够识别进行了所述反应的第一抗体且附着有荧光物质的第二抗体，与所述第一抗体进行反应的步骤。另一方面，本发明的另一实施方式为，一种具有表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor :EGFR) M Sl # Bl Φ # ffl (EGFR tyrosine kinase inhibiting)的化合物，其特征在于，包括如下化学结构2-{l6-(5，6-二羟基-4-氧代-2-苯基-4H-苯并吡喃-7-基氧基)-3，4，5_三羟基-四氢-吡喃_2_羰基]-氨基}-4_甲磺酰基-丁酸甲酯；6,7- 二羟基-4-(邻-甲苯基氨基-甲基)_苯并吡喃-2-烷；或者，N-[3-(3，4-二羟基苯)_丙烯酰]-2-羟基-苯甲酰胺。与此同时，本发明还可以为，一种治疗或预防癌症的药物组合物，其特征在于，包含上述的化合物。其它实施例的具体事项包含在具体实施方式
及附图中。根据上文所述的本发明，在蛋白质芯片上附着可以被EGFR酪氨酸激酶活化的 EGFR酪氨酸激酶底物(substrate)，并将附着有上述底物的蛋白质芯片与EGFR酪氨酸激酶、ATP、Mg2+以及单一化合物库中的化合物池(pool)进行反应，从而能够从各种单一化合物库中迅速地大量筛选出能够优秀地抑制EGFR酪氨酸激酶的活性的新的抑制物质。另夕卜，通过对包含在上述单一化合物库中的多个化合物的药效基团 (pharmacophore)的搜索和与上EGFR酪氨酸激酶的结构进行虚拟结合的对接仿真，来事先拣选出候选物质而准备化合物池，从而具有如下效果，即，减少用于筛选的时间和费用，且容易地筛选出具有比现有技术更显著的抑制效果的抑制剂。另外，根据上述本发明而筛选出的具有EGFR激酶抑制效果的抑制剂为，优秀的 EGFR激酶抑制物质，并且，对EGFR所致的自身磷酸化以及其它多种底物的磷酸化的抑制上表现出优秀的效果，且能够更加提高在EGFR相关疾病中的药物(medicines)的有效性。


图1为用于说明根据本发明的在EGFR胞外区结合配体(EGF或TGF-α )而激活信号传导通路的过程的一示例的模拟图。图2为用于说明在进行根据本发明的筛选方法时，执行药效基团的搜索和对接仿真的过程的一示例的模式图。图3为用于举例说明，以依赖本发明的EGFR酪氨酸激酶的浓度的方式，实现底物 (PLC-gammal)的磷酸化的实验结果的照片及其图表。图4为根据本发明使用PLC-gammal以作为底物，从而从单一化合物库中筛选出 EGFR酪氨酸激酶抑制剂的示例的实验结果的照片及其图表。图5为对于根据本发明筛选出的抑制剂E12、H7、C12以及现有的抑制剂 Tyrphostin 51进行了不同浓度的磷酸化抑制程度实验的结果照片及其图表。图6为举例表示根据本发明筛选出的抑制剂E12、H7以及C12的化学结构及其名称，以及通过对接仿真而做出的与EGFR酪氨酸激酶的结合结构的示意图。图7为根据本发明将EGFR作为底物使用而举例证明自身磷酸化具有浓度依赖性的实验结果的照片及其图表。图8为举例表示对于根据本发明筛选出的抑制剂E12、H7、C12以及现有的酪氨酸磷酸化抑制剂51的EGFR自身磷酸化抑制实验结果，以及此时的活性抑制浓度 (half-maximal抑制浓度，IC50)的照片。图9为举例表示对于根据本发明筛选出的抑制剂E12、H7、C12以及现有的抑制剂酪氨酸磷酸化抑制剂51的人宫颈癌细胞(HeLa细胞)的增殖抑制实验结果，以及此时的活性抑制浓度(half-maximal抑制浓度，IC50)的照片。
具体实施例方式下面参照附图对本发明的一较佳实施方式进行详细说明。本发明中为了筛选出能够抑制EGFR酪氨酸激酶(EGFR kinase)，即对EGFR底物 (substrate)的酪氨酸进行磷酸化的酶的活性的抑制剂，从而将可以与上述EGFR酪氨酸激酶结合而被其活化的EGFR酪氨酸激酶底物(substrate)附着在蛋白质芯片上，并且在上述附着有底物的蛋白质芯片上使供给磷酸基的ATP、辅助因子(co-factor)Mg2+以及单一化合物库中的化合物池(pool)与EGFR酪氨酸激酶一同进行了反应。上述蛋白质芯片采用ftOteoChip (Proteogen Inc.，首尔，韩国)。上述ftOteoChip 为在胺化了的(aminated)玻璃载片(GlassSlides)上涂覆杯芳烃(calixarene)衍生物而成，而上述杯芳烃衍生物起到双官能团分子连接基团 (Bifunctional molecular linker)白勺作用。并且，作为上述EGFR酪氨酸激酶底物，只要是能够被EGFR酪氨酸激酶活化的蛋白质则没有特别限制，可以采用该技术领域中公知的所有种类的底物。例如，可采用选自 PLC-gammal、EGFR、Shc、Grt2/mSos、P91、PI3-kinase、Ras/Gap 以及 Cbl 中的至少一种物质。另外，上述单一化合物库可包含低分子化合物以及天然来源化合物，现有的作为 EGFR酪氨酸激酶抑制剂而熟知的大部分化合物为单一化合物，从此点看来，本发明的特征为除单一化合物之外，还包含有天然来源化合物。如此，在附着有EGFR酪氨酸激酶底物的蛋白质芯片上使EGFR酪氨酸激酶，ATP、 Mg2+以及单一化合物库中的化合物池(pool)进行反应时，包含在上述化合物池中的特定的化合物可抑制上述EGFR酪氨酸激酶所致的上述底物的磷酸化，并为了对此进行确认，本发明的特征在于，将附着有荧光物质且能够识别上述被磷酸化的底物的抗体，在已进行了上述化合物池的反应的蛋白质芯片上追加进行反应。在现有技术中，如整联蛋白等受体，能够与对抑制剂候选物质起到拮抗作用的其它配体蛋白质结合，并能够在上述配体蛋白质上直接附着荧光物质，但是，根据本发明的 EGFR酪氨酸激酶并非与抑制剂候选物质起拮抗作用，而是上述激酶磷酸化活性因抑制剂候选物质而被抑制，且无法在上述激酶上直接附着荧光物质，因此本发明中特别利用能够识别由于上述化合物池的反应而被磷酸化的底物的其它抗体，并在此附着荧光物质，以便最后检测出荧光物质的强度。其中，使能够识别上述的被磷酸化的底物的其他抗体进行反应的过程还能通过下述的两个阶段来实现，即，将能够识别被磷酸化的底物的第一抗体与上述被磷酸化的底物进行反应，接着将能够识别已进行上述反应的第一抗体且附着有荧光物质的第二抗体与上述第一抗体进行反应。接下来，在与如上所述的被磷酸化的底物的反应结束之后，用缓冲溶液洗涤，并测定荧光物质的强度，从而筛选出EGFR酪氨酸激酶抑制剂，此时，上述荧光物质的强度较低是说明底物的磷酸化的程度较低，这意味着由于特定的化合物而上述底物的磷酸化被抑制，因此可以将在上述荧光物质的强度较低的斑点上进行反应的化合物，确定为能够优秀地抑制EGFR酪氨酸激酶的活性的抑制剂。另一方面，本发明为了节省用于筛选的时间和费用，而在构成单一化合物库中的化合物池时，可以通过对包含在上述单一化合物库中的多个化合物的药效基团
8(pharmacophore)的搜索，以及与上述EGF酪氨酸激酶的结构进行虚拟结合的对接仿真，来拣选候选物质，进而准备化合物池。S卩，上述药效基团(Pharmacophore)是为了将分子(或化合物)与特定的酶、蛋白质或受体进行有效结合所必须知悉的多种官能团(化学性质)的3D排布(Sutter等， 2000)，用于拣选出具有与现有作为EGFR酪氨酸激酶抑制剂所公知的IRESSA或TARCEVA 的结构相似的药效基团的化合物。例如，从由喹唑啉(quinazolines)、吡啶并嘧啶 (pyridopyrimidines)以及吡咯并嘧啶(pyrrolopyrimidines)组成的群中选择的至少一个作为基本模型(model)，从而先拣选出与上述基本模型的结构相似性较高的一定数量的化合物。另外，进行上述对接仿真是指，使包含在单一化合物库中的多个化合物与上述 EGFR酪氨酸激酶进行虚拟结合，从而拣选出在结构上匹配可能性较高的一定数量的化合物。本发明通过药效基团搜索和对接仿真而拣选出候选物质，以准备化合物池，从而具有如下效果，即，减少用于筛选的时间和费用，且能够容易筛选出具有比现有技术更显著的抑制效果的抑制剂。本发明能够通过下述实施例而更易于理解，并且，下述实施例以举例说明本发明为目的，而并非限定权利要求的范围所限定的保护范围。_仿丨丨1 靈劲勿白備媒酣議口X·方直图2为用于说明在进行根据本发明的筛选方法时，进行药效基团的搜索和对接仿真的过程的一示例的模式图，为了进行虚拟筛选而使用了化学计算集团(Chemical Computing Group) ^M^JfR^i^itilJM (Molecular Operating Environment, Μ0Ε)禾呈序。虚拟筛选方法，一并使用了药效基团(pharmachphore)的搜索和分子对接仿真。首先，制作出了与现有的作为EGFR酪氨酸激酶抑制剂而被熟知的IRESSA以及 TARCEVA的结构近似的药效基团基本模型，在IBS的40000个库化合物中拣选出7000个具有与上述基本模型近似的药效基团的化合物。然后，以这些7000个化合物为对象，对EGFR激酶的X-Ray结构实施了对接仿真， 从而选定了对接得分较高的前300个化合物。用于对接计算的搜索算法，使用α三角 (Alpha Triangle)方法来实施对每个配体化合物的最多500000次的结构变化能量计算。 该方法使用了如下算法，即，将分子的三个点(point)形象化为三角形，并判断出与受体蛋白质的其它三角形匹配与否，从而进行对接的算法。评分方法使用LondondG方法而对每个配体计算了最多10个位姿(p0se)。MOE所支持的评分方法有LondondG、AffinitydG, AlphaHB三种，在本计算中使用的LondondG如下。 LondondG函数，作为参数使用，由于结合而产生的旋转/平移熵(rotational/ translation entropy)变化、由于配体(Iigand)的结合而产生的弹性能(flexibilityenergy)的减少、氢结合能、金属离子连接(ligation)，去溶能(desolavtion energy)差异等。通过如上所述的方法，拣选出对接仿真结果中得分即LondondG值最优秀的300个化合物，从而准备了用于蛋白质芯片筛选的化合物池。t施例2 由EGFR激的底物的磷酸仆^应实龄首先，本实施例中为了了解结合在芯片上的EGFR激酶底物的稳定性，从而确认上述EGFR激酶底物与EGFR激酶之间的反应程度。蛋白质芯片使用了ftOteoChipTMO^roteogen，Inc.，首尔，韩国)，在 ProteoChip (Proteogen, Inc.，首尔，韩国)上以微阵列(CM-1000 ；Proteogen，Inc.，首尔，韩国)的方式将EGFR激酶底物按不同浓度分别点样，从而形成EGFR激酶底物微阵列 (microarray)。EGFR激酶底物使用从Calbiochem公司购买的PLC-gammal，将上述底物溶解于包含30%甘油的磷酸盐缓冲溶液(phosphate-buffered saline, PBS)后，点样到 I^oteoChip 上，然后，在4°C的潮湿环境中过夜而使其固定。然后，将固定着EGFR激酶底物(PLC-gammal)的蛋白质芯片用包含3%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的 PBS封闭(blocking)后，用洗涤溶液(PBST 包含0. 5% Tween 20的PBS，pH7. 4)洗涤而去除未固定的底物和BSA。接下来，在附着有上述底物的蛋白质芯片上与ATP/Mg2+混合物一同使EGFR酪氨酸激酶以不同浓度分别进行反应。上述ATP/Mg2+混合物和EGFR酪氨酸激酶使用了从UPSTATE 公司购买的产品，上述EGFR酪氨酸激酶的浓度设定为，在10 5，000 μ 1/ml分别不同。反应中使用了缓冲溶液(IOOmM M0PS,5mMDTT, PBS, pH7. 2)而在30°C的潮湿环境中进行了一小时的反应。根据上述反应，三磷酸基(ATP)的磷酸使得底物的酪氨酸序列被磷酸化，此后，用洗涤溶液将没有进行反应的三磷酸基、反应后产生的二磷酸基、EGFR酪氨酸激酶以及缓冲溶液进行去除。然后，将识别上述被磷酸化的底物的第一抗体(购买UPSTATE公司以及 Abfrontier公司的产品)稀释到以1 100比例含有30%甘油和10% BSA的PBS溶液中， 并在30°C的潮湿环境中，与包含上述被磷酸化的底物的芯片反应了一小时。然后，用洗涤溶液洗涤芯片，并将识别第一抗体的、附着有荧光的第二抗体，在包含10% BSA和30%甘油的PBS溶液中以100 1稀释之后，在30°C潮湿且无光的环境中， 与包含上述第一抗体的芯片反应了一小时。将结束了如上所述的反应之后的芯片用洗涤溶液洗涤，使用GENETIX公司制造的 Aquire 荧光扫描仪来分析了芯片上的荧光强度，其结果如图3所示。图3为用于举例说明，以依赖本发明的EGFR酪氨酸激酶的浓度的方式，实现底物(PLC-gammal)的磷酸化的实验结果的照片及其图表，如该图所示，对上述底物 (PLC-gammal)和EGFR激酶之间的反应程度进行确认的结果，从EGFR激酶以依赖浓度的方式活化上述EGFR激酶底物来判断，由此确认被固定的EGFR激酶底物为正常。^MM 3 从单一化合物库中高谏地,大量f帝诜Ml EGFR^IS抑制剂首先，采用与上述实施例2相同的方法，在蛋白质芯片上附着了 EGFR激酶底物 (PLC-gammal)，此时底物的浓度为每Imm芯片为20 μ g。然后，在附着有上述底物的蛋白质芯片上，与ATP/Mg2+混合物以及EGFR酪氨酸激酶一同将作为阳性对照的ImM酪氨酸磷酸化抑制剂51 (Tyrphostin51)以及在上述实施例1中选择的300个库化合物按不同化合物区分而分别以50mM的浓度进行了反应。其它过程与实施例2相同，反应结束后对芯片进行荧光强度分析的结果如图4所示。图4为根据本发明使用PLC-gammal以作为底物，从而从单一化合物库中筛选出 EGFR酪氨酸激酶抑制剂的示例的实验结果的照片及其图表，如该图所示，可以筛选出EGFR 酪氨酸激酶抑制效果比现有的作为EGFR酪氨酸激酶抑制剂而熟知的Tyrphostin 51更优秀的化合物，并作为示例来选择其中的三种并将其命名为H07，E12，C12。实施例4 筛诜出的抑制剂的桉不同浓度的EGFR激酶抑制效果实骑对在上述实施例3中选择的三个化合物进行了上述化合物的不同浓度的EGFR激酶活性抑制效果的实验。S卩，上述实施例3中，将300个化合物分别以50mM浓度进行了反应，但是在本实施例中，分别将H07，E12，C12化合物以1 μ M 100 μ M的不同浓度来进行反应，其它过程与实施例2相同。对反应结束后的芯片进行的荧光强度分析的结果如图5所示。图5为对于根据本发明筛选出的抑制剂E12、H7、C12以及现有的抑制剂 Tyrphostin 51进行了不同浓度的磷酸化抑制程度实验的结果照片及其图表，如该图中所示，可以确认，根据本发明的抑制剂Ε12，Η7，C12以依赖浓度的方式抑制EGFR酪氨酸激酶的活性。图6为举例表示根据本发明筛选出的抑制剂Ε12、Η7以及C12的化学结构及其名称，以及通过对接仿真而做出的与EGFR酪氨酸激酶的结合结构的示意图，如此图中所示， 上述根据本发明的抑制剂Ε12，Η7，C12分别具有如下结构，即，2- {[6- (5,6- 二羟基_4_氧代_2_苯基_4Η_苯并吡喃_7_基氧基)_3，4，5_三羟基-四氢-吡喃-2-羰基]-氨基}-4_甲磺酰基-丁酸甲酯；(Β0Χ1-Ε12)；6，7-二羟基-4-(邻-甲苯基氨基-甲基)_苯并吡喃-2-烷；N-[3-(3，4-二羟基苯)_丙烯酰]-2-羟基-苯甲酰胺(B0X2-C12)，这与现有技术中已知的EGFR激酶抑制剂的结构完全不同。实施例5 =EGFR激酶所致的EGFR的自身磷酸化反应实验首先，替代在上述实施例2中作为EGFR激酶底物的PLC-gammal而使用了 EGFR， 并基于此进行了由EGFR激酶引起的EGFR的自身磷酸化反应实验。其结果如图7所示，可以确定如下事实，即，即使使用EGFR以作为EGFR激酶底物，也由于EGFR酪氨酸激酶而底物 (EGFR)的磷酸化以依赖浓度的方式实现。另一方面，确认了在作为EGFR激酶底物而使用EGFR的情况下，根据本发明而筛选出的抑制剂E12，H7以及C12是否能够抑制EGFR激酶的活性。代替在上述实施例2中作为 EGFR激酶底物的PLC-gammal而以10mg/mL浓度附着了 EGFR，此时将EGFR激酶100ng/mL 和ATP/Mg2+在缓冲溶液(100mMM0PS，5mMDTT，PBS，pH 7. 2)中进行混合而处理，此时，分别将通过上述的实施例3和实施例4而筛选出的化合物E12 (450mM)，H7 (1. 8mM)，C12 (1. 8mM)， Tyrphostin(ImM)的浓度稀释5倍而一同进行反应。图8为举例表示对于根据本发明筛选出的抑制剂E12、H7、C12以及现有的抑制剂酪氨酸磷酸化抑制剂51的EGFR自身磷酸化抑制实验结果和此时的活性抑制浓度
11(half-maximal抑制浓度，IC50)的照片，如该图中所示，可以确认上述E12，H7，C12能够将 EGFR的自身磷酸化以依赖浓度的方式进行抑制。实施例6 筛诜出的抑制剂的牛物活件分析通过人宫颈癌细胞(HeLa细胞)的增殖抑制实验，分析了根据本发明而筛选出的抑制剂的生物活性。细胞增殖实验根据MTT溴化[(3-(4,5-二甲噻唑-2基-2，5-二苯基-2H-四唑鐺]实验协议(protocol)进行。首先，将HeLa细胞在涂覆有聚苯乙烯(Polystyrene)96-孔组织培养板中按每孔 4X103个的细胞浓度来添加。由此静置M小时之后，将根据本发明的抑制剂E12、H07、C12 和现有的抑制剂Tyrphostin 51分别与包含10% FBS的培养混合溶液一同添加到各个孔中，并反应72小时。此时，上述E12、H07、C12和Tyrphostin 51分别以10 μ M 100 μ M的浓度进行反应。然后向各个孔中添加5mg/ml MTT溶液10 μ 1，并在37°C反应3小时。然后， 去掉各个孔中的上清液之后，将显色反应物(Formazancrystal)溶解于100 μ 1的二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMS0)中，并用酶联免疫检测仪(ELISA Reader) (595nm)测定了吸光度。图9为举例表示根据本发明筛选出的抑制剂E12、H7、C12以及现有的抑制剂酪氨酸磷酸化抑制剂51的人宫颈癌细胞(HeLa细胞)的增殖抑制实验结果和此时的活性抑制浓度(half-maximal抑制浓度，IC5tl)的照片。图9中空白(Media alone)显示在没有添加样品(Sample)的培养液中将HeLa细胞进行增殖的结果。由此，根据本发明的E12、H7、C12 化合物表现出了比Tyrphostin51 (Tyrosin kinase inhibitor 酪氨酸激酶抑制剂)更优秀的抑制效果，其中E12和H7具有最卓越的抑制EGFR酪氨酸激酶的抑制作用。另外，根据上述E12，H7，C12化合物来阻碍HeLa细胞的增殖50 %时所需的浓度(半数(half-maximal)抑制浓度)分别显示为 27. 96 士 3. 30 μ M，11. 95 士 0. 39 μ M， 41. 83士6. 29 μ Μ，在上述化合物中Η7表现出能够最有效地抑制HeLa细胞的增殖。一方面，在上述中将本发明以特定的较佳实施例来图示并进行说明。但本领域技术人员应知悉，在没有脱离权利要求书中体现的本发明的技术特征或领域的情况下，可以对本发明进行多种改造及变化。本发明提供一种能够从各种单一化合物库中超高速地大量筛选出具有EGFR激酶抑制效果的物质的方法，且由此筛选出的抑制剂对由EGFR激酶引起的自身磷酸化以及其它底物的磷酸化抑制表现出优秀的效果，从而能够更加提高在EGFR相关疾病中的药物 (medicines)的有效性。
权利要求
1.一种EGFR酪氨酸激酶抑制剂的筛选方法，其为表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor :EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitors EGFR-TKIs)的筛选方法，其包含在蛋白质芯片上附着能够被EGFR酪氨酸激酶活化的EGFR酪氨酸激酶底物 (substrate)的步骤；在所述附着有底物的蛋白质芯片上，使EGFR酪氨酸激酶、ATP、Mg2+以及单一化合物库的化合物池(pool)进行反应的步骤；使能够识别由所述反应而被磷酸化的底物且附着有荧光物质的抗体，与所述被磷酸化的底物进行反应的步骤；在与所述被磷酸化的底物的反应结束之后，用缓冲溶液洗涤的步骤；以及测定所述洗涤后的荧光物质的强度的步骤。
2.根据权利要求1所述的EGFR酪氨酸激酶抑制剂的筛选方法，其特征在于， 在使所述单一化合物库的化合物池进行反应的步骤之前，还包括对所述单一化合物库所包含的多个化合物进行药效基团(pharmacophor)的搜索，并进行与所述EGFR酪氨酸激酶的结构虚拟结合的对接仿真的步骤；以及通过所述药效基团搜索和对接仿真所选择的化合物来准备化合物池的步骤。
3.根据权利要求2所述的EGFR酪氨酸激酶抑制剂的筛选方法，其特征在于， 所述药效基团(pharmacophor)的搜索是指，从由喹唑啉(quinazolines)、吡啶并嘧啶(pyridopyrimidines)以及吡咯并嘧啶(pyrrolopyrimidines)所组成的群中选择的至少一个作为基本模型(model)，从而选择出与所述基本模型的结构相似性较高的一定数量的化合物。
4.根据权利要求3所述的EGFR酪氨酸激酶抑制剂筛选方法，其特征在于，所述对接仿真的执行是指，使所述选择出的一定数量的化合物与所述EGFR酪氨酸激酶进行虚拟结合，从而选择出结构上匹配可能性较高的一定数量的化合物。
5.根据权利要求1所述的EGFR酪氨酸激酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述 EGFR 酪氨酸激酶底物为，选自 PLC-gammal、EGFR、She, Grb2/mSos, P91、 PI3-kinase、Ras/Gap以及Cbl中的至少一个物质。
6.根据权利要求1所述的EGFR酪氨酸激酶抑制剂的筛选方法，其特征在于， 所述单一化合物库由低分子化合物和天然来源化合物组成。
7.根据权利要求1所述的EGFR酪氨酸激酶抑制剂的筛选方法，其特征在于， 与所述被磷酸化的底物进行反应的步骤，包括使能够识别由所述反应而被磷酸化的底物的第一抗体，与所述被磷酸化的底物进行反应的步骤；以及使能够识别进行了所述反应的第一抗体且附着有荧光物质的第二抗体，与所述第一抗体进行反应的步骤。
8.一种具有表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor :EGFR)酪氨酸激酶抑制(EGFR tyrosine kinase inhibiting)作用的化合物，其特征在于，包括如下化学结构2- {[6- (5,6- 二羟基-4-氧代-2-苯基-4H-苯并吡喃_7_基氧基)_3，4，5-三羟基-四氢-吡喃-2-羰基]-氨基}-4_甲磺酰基-丁酸甲酯；·6，7- 二羟基-4-(邻-甲苯基氨基-甲基)-苯并吡喃-2-烷；或者 N- [3- (3，4- 二羟基苯)-丙烯酰]-2-羟基-苯甲酰胺。
9. 一种治疗或预防癌症的药物组合物，其特征在于， 包含权利要求8所述的化合物。
全文摘要
本发明，在蛋白质芯片上附着了可以被EGFR酪氨酸激酶活化的EGFR酪氨酸激酶底物(substrate)，并在附着有上述底物的蛋白质芯片上使EGFR酪氨酸激酶、ATP、Mg2+以及单一化合物库的化合物池(pool)进行反应，从而能够迅速并大量地筛选出能够有效地抑制EGFR酪氨酸激酶的活性的新的抑制物质。
文档编号G01N33/573GK102341708SQ200980157759
公开日2012年2月1日 申请日期2009年3月31日 优先权日2009年3月16日
发明者崔荣晋, 康仁哲, 金應允 申请人:湖西大学校产学协力团