专利名称：基于电导率检测的等电聚焦电泳测试结果预评估的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物分离与分析技术领域的方法，具体是一种基于电导率检测的等电聚焦电泳(isoelectric focusing, IEF)测试结果预评估的新方法,该方法具有识别电迁移电流与扩散电流、识别固化PH梯度胶条(IPG strip)与非固化pH梯度胶条(non-1PG strip)、识别蛋白样本前处理效果好坏、以及识别实验操作方法正确与错误功能的检测方法。
背景技术：
等电聚焦电泳(IEF)是利用电解质在介质中创造一个pH梯度，同时利用蛋白质具有两性解尚和等电点的特点，对蛋白质进行闻效分尚富集(P.G.Rightti, In: T.S.Work and R.H.Rurdonj Laboraotary Techniques in Biochemistry and MolecularBioboligyj Elsevier Biomedical Press,Amesterdam New York Oxford,vII，1983，p.1-86，268-313)。IEF电泳技术应用广泛，它不仅是蛋白质pi表征和纯度鉴定的标准分析技术；同时也是复杂蛋白质及其组学研究中的关键分离方法(Nilesh STannuj Scott E Hembyj Nature Protocols，I (2006) 1732)，在双向凝胶电泳中亦是作为关键的第一向分离技术(P.H.01 Farrell, J.Biol.Chem.250 (1975) 4007 ；Rolland ADj EvrardB，Guitton N, J.Proteome Res.6 (2007) 683)。基于常规凝胶电泳的IEF技术主要有二种，包括:(i)、管式凝胶IEF技术(L.E.M.Miles，G.E.Simmons, A.Chrambach，Anal.Biochem.49 (1972) 109.) ;(ii)、薄层凝胶 IEF 技术(P.G.Rightti，Ιη:Τ.S.Work and R.H.Rurdonj LaboraotaryTechniques in Biochemistry and Molecular Bioboligy,Elsevier BiomedicalPress, Amesterdam New York Oxford, v II，1983，p.1-86，268-313)。但在这两种凝胶IEF电泳技术中始终存在pH梯度水平化(plateau of pH gradient, P.Arosioj E.Granaand P.G.Righettij J.Chromatogr., 166 (1978) 55)和 pH 梯度漂移(drifting of pHgradient, H.Rilbej In:Electrofocusing and Isotachophoresis(Editors:B.J.Radolaand D.Graeslin), Walter de Gruyter & C0., Berlin New York，1977，p35_50)，这二种现象造成的IEF不稳定性。并且在双向凝胶电泳(two dimensional gel electrophoresis，2DE)中，由于管式和薄层凝胶IEF的凝胶很难取出，取出后也很难完整的进行后续的转移操作；因此，基于常规凝胶的第一向IEF分离技术很难与第二向的SDS-PAGE电泳兼容。为了克服常规凝胶IEF技术稳定性问题以及与SDS-PAGE电泳兼容性问题，Rightti等于上世纪八十年代发明了固定化pH梯度(immobilized pH gradient，IPG)胶条以及基于 IPG 胶条的 IEF 技术((A.Gorg3 W.Postelj R.Westermeierj B.Bjellqvistj K.Ekj E.Gianazzaj P.G.Righettij Prot.Biol.Fluids30 (1983) 607 ;Α.Gorg,W.Postelj R.Westermeierj B.Bjellqvistj K.Ekj E.Gianazzaj P.G.Righettij Prot.Biol.Fluids30(1983)607)。由于较好地解决了传统凝胶IEF技术稳定性和兼容性等问题，基于IPG胶条的IEF是目前应用最广泛的聚焦电泳技术，已经成为2DE的第一向标准分离技术(Nilesh S Tannuj Scott E Hembyj Nature Protocols，I (2006) 1732)。相关的 IEF 技术体系、IPG胶条以及仪器设备等主要有美国GE公司通用电气医疗集团生命科学部(http://gehealthcare.bioon.com.cn/)、美国 Bio-Rad 公司(http://www.bio-rad.com/)、以及美国Hoefer Inc 公司(http:// www.hoeferinc.com/)提供。但不论是在常规凝胶IEF技术还是在IPG-1EF技术中始终存在成功率低、重复性差等问题，尤其是不同来源和不同人员准备的蛋白质样品的IEF和2DE实验。究其原因，主要是对IEF过程中电迁移和扩散产生的电流在机制上认识不深，对CA的添加及其对电迁移电流的影响尚未阐明，对蛋白质样品前处理各种盐份的存在、及其对IEF和电流影响认识不足，尚没有对IPG-1EF和non-1PG-1EF过程中电流产生的机制进行比较。尤其是没有对在IEF过程中的电迁移与扩散产生的电流、蛋白质样品中盐份对IEF电流影响、IPG-1EF与non-1PG-1EF的电流等进行比较和识别，进而形成新的相关技术体系。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于电导率检测的等电聚焦电泳测试结果预评估的方法，根据IEF过程中电迁移和扩散阶段的电流形成机制，将电迁移电流和扩散电流转化成电迁移电导与扩散电导，并对IEF中的电迁移电导与扩散电导进行实际对比分析，得到电导率随时间的变化曲线。本发明可以通过监测对比起始状态下的电导大小来衡量蛋白质样品前处理脱盐效果的好坏，或/和评判实验操作的正确与错误，预测聚焦的效果和成功率；如起始电导过高或过低，可提前终止IEF和/或2DE实验，减少后续的损失。根据C.X.Cao, J.Chromatogr.A813 (1998) 153,等电聚焦电泳过程中电迁移和扩散阶段的电流形成机制为:在等点聚焦的起始阶段，离子i的电迁移电流
权利要求
1.一种基于电导率检测的等电聚焦电泳测试结果预评估的方法，其特征在于，通过采用固化PH梯度胶条或非固化pH梯度胶条对经过前处理的蛋白质样品进行等电聚焦处理，根据处理期间的电迁移阶段以及扩散阶段的电流计算得到电迁移阶段以及扩散阶段的电导与时间的关系，进而通过电导率变化衡量蛋白质样品前处理脱盐效果及操作正确与否。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的前处理的蛋白质样品是指:利用透析脱盐、凝胶过滤脱盐或超滤脱盐及其对应不同脱盐程度处理的样品，之后冷冻干燥备用。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的固化PH梯度胶条或非固化pH梯度胶条是指:采用被动水化方式，选择胶条长度为7cm，胶条pH为3-10，水化12h ;上样量为100 μ g/条，上样体积为125 μ L/条；环境温度:25度；测试控温:18度。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的等电聚焦处理是指:将固化PH梯度胶条或非固化PH梯度胶条浸溃于经过样本前处理的蛋白质样品后，两端与可控电压源的正负极相连组成回路，通过调整电压源的输出得到胶条两端的电压，通过串联电流计检测该过程中回路 中的电流。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的调整电压源的输出是指: 当采用固化PH梯度胶条时，按以下步骤调整电压: 1:电压:4000V，升压方式:快速升压，时间:15000Volt Hr ； 2:电压:500V，恒压，电压调节方式:快速； 当采用非固化PH梯度胶条时，按以下步骤调整电压: 1:电压:500V，升压方式:线性升压，时间:5h ； i1:电压:2000V，电压调节方式:快速，时间:5min ； ii1:电压:200V，恒压，电压调节方式:快速。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的电迁移阶段以及扩散阶段的电导与时间的关系是指: 当采用固化pH梯度胶条时:
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的通过电导率变化衡量蛋白质样品前处理脱盐效果及操作正确与否是指: 当采用固化PH梯度胶条时:标准条件下，蛋白质样品IPG-1EF对应的起始电导变化从0.008 μ S/cm到0.02 μ S/cm之间；当蛋白样品IPG-1EF起始电导超过0.02 μ S/cm,说明此样品中含有较高浓度的盐类，此时IEF的聚焦效果一般较差，成功率低；当蛋白样品IPG-1EF起始电导低于0.008 μ S/cm,则说明此测试胶条水化不完全，或/和电极接触不良，或/和上样成分漏加或误加等偶然原因，此时IEF成功率很低，应及时纠正或终止测试； 当采用非固化pH梯度胶条时:标准条件下，蛋白质样品non-1PG-1EF对应的起始电导变化从0.04 μ S/cm到0.2 μ S/cm之间;当蛋白样品non-1PG-1EF起始电导超过0.2 μ S/cm,说明此样品中含有较高浓度的盐类，此时IEF的聚焦效果一般较差，成功率低；当蛋白样品non-1PG-1EF起始电导低于0.04 μ S/cm,则说明此测试胶条水化不完全，或/和电极接触不良，或/和上样成分漏加 或误加等偶然原因，此时IEF成功率很低，应及时纠正或终止测试。
全文摘要
一种生物分离与分析技术领域的基于等电聚焦电泳电导率检测的蛋白样本前处理效果和实验操作是否正确评估方法，通过采用固化pH梯度胶条或非固化pH梯度胶条对经过前处理的蛋白质样品进行等电聚焦处理，根据处理期间的电迁移阶段以及扩散阶段的电流计算得到电迁移阶段以及扩散阶段的电导与时间的关系，进而通过电导率衡量蛋白质样品前处理脱盐效果和实验操作是否正确。本发明可有效识别在IEF过程中电迁移与扩散电导、蛋白质样本脱盐处理效果好坏、实验操作是否正确、以及基于固化pH梯度胶条或非固化pH梯度胶条的IEF实验，提升复杂蛋白质样品的IEF和双向凝胶电泳分析的成功率和稳定性。
文档编号G01N27/447GK103196981SQ20131010580
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月28日 优先权日2013年3月28日
发明者曹成喜, 郭陈刚, 李国庆, 刘小平 申请人:上海交通大学
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