专利名称：一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法
技术领域：
本发明涉及细胞分子生物学技术领域，具体涉及一种基于细胞爬片的快速经济的 免疫荧光方法，该方法用于细胞生物学、分子生物学、免疫学、微生物学、病理学及临床检验 中对完整细胞(包括微生物)目标抗原的可视化检测。
背景技术：
免疫荧光分析法(Immunofluorescence assay, IFA)是细胞、分子生物学常用的一 种实验方法。按照样品特性，免疫荧光分析法分为2大类一类用于标记固定在玻片(盖 玻片或载玻片)上的细胞(BhattacharyyaD，Hammond AT and Glick BS. High-quality immunofluorescence of cultured cells[J]. Methods Mol Biol, 2010,619 :403-410.)； 另一类即指流式细胞仪荧光分析细胞悬液(Cunningham RE. Indirect immunofluorescent labeling offixed cells [J]. Methods Mol Biol，2010，588 :335-339.)。前者的主要目 的是展示细胞结构(例如肌动蛋白丝)、胞内目标蛋白质的定位、细胞表面分子分布等 (Bhattacharyya D，Hammond AT and Glick BS. High-quality immunofluorescence of cultured cells[J]. Methods Mol Biol，2010，619 :403-410. ；Lee AWiHertel LiLouie RK, et al· Human cytomegalovirus alters localization of MHC class II and dendrite morphology in mature Langerhans cells[J]. J Immunol,2006，177 (6) :3960-3971.)。 后者的主要目的是分选细胞、统计细胞中标志性蛋白的阳性率。用于检测玻片样品的免 疫荧光分析有2种制备样品的方法(1)使细胞在特制的盖玻片(即细胞爬片)上生长， 使细胞自然贴附于玻片上；(2)将待检测的细胞(包括动/植物细胞和微生物MTaber LH, Brasier F, Couch RB, et al. Diagnosis of herpes simplex virus infection by immunofluorescence[J]. J ClinMicrobiol,1976,3(3) :309-312. ；Didier ES, Orenstein JM,Aldras A,et al. Comparison of three staining methods for detecting microsporidia in fluids [J], J Clin Microbiol, 1995,33(12) :3138-3145.)悬液滴到玻 片上，使其风干并贴附于玻片上。我们公开的是一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光 方法，属于分析细胞爬片样品(第一类)的免疫荧光分析方法。按照抗体的使用，免疫荧光分析分为间接免疫荧光分析和直接免疫荧光分析2 种。间接免疫荧光分析方法通过抗原特异性第一抗体(一抗)标记抗原，再用荧光分子耦 联的第二抗体(二抗)特异性标记一抗，从而使抗原所在位点发出荧光。而直接免疫荧光 分析是用荧光分子耦联的抗原特异性的抗体直接标记抗原的方法。无论是间接免疫荧光分 析还是直接免疫荧光分析，我们公开的一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法均适 用。与同类型的几种免疫荧光分析方法(Bhattacharyya D，Hammond AT and Glick BS. High-quality immunofluorescence of cultured cells[J]. Methods Mol Biol,2010, 619 :403-410. ；Taber LH, Brasier F，Couch RB, et al. Diagnosis of herpes simplex virus infection by immunofluorescence[J]. J Clin Microbiol，1976，3 (3) :309-312.；Cunningham RE. Indirect immunofluorescent labeling of fixed cells[J]. Methods Mol Biol,2010,588 :335-339. ；Rosner K， Mischke R and Schuberth HJ. Evaluation of a standard immunofluorescence assay and a new flow cytometric method for the detection of autoreactive antibodies in dogs with tumours[J]. Res Vet Sci， 2007,82(1) :27-33. ；Inoue N，Mar EC，Dollard SC, et al. New immunofluorescence assays for detection of Human herpesvirus 8-specific antibodies[J]. Clin Diagn Lab Immunol，2000，7(3) :427-435. ；Thomp son TA and Wilkinson HW. Evaluation of a solid-phase immunofluorescence assay for detection of antibodies to Legionella pneumophila [J]. J Clin Microbiol，1982，16 (1) :202-204.)相比，我们公幵的一种基于细 胞爬片的快速经济的免疫荧光方法至少节省40-70分钟(min)。我们公幵的这种新方法包 括15min封闭孵育和IOmin的抗体(一抗或二抗)孵育，而其它方法需要20-60min进行封 闭孵育(Bhattacharyya DiHammond AT and Glick BS. High-quality immunofluorescence of cultured cells[J]. Methods Mol Biol，2010，619 :403-410. ；Strang BL，Boulant S and Coen DM. Nucleolin associates with the human cytomegalovirus DNA polymerase accessory subunit UL44and is necessary for efficient viral replication [J]. J Virol，2010，84(4) :1771-1784. ；Thornton CR and Talbot NJ. Immunofluorescence microscopy and immunogold EM for investigating fungal infection of plants[J]. Nat Protoc，2006，1 (5) :2506-2511. ；Schneider Gasser EM,Straub CJ，Panzanelli P，et al. Immunofluorescence in brain sections -simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons [J]. Nat Protoc,2006，1 (4) 1887-1897.)以及0. 5-3 小时(h)用于抗体(一抗或二抗)孵育(Bhattacharyya DiHammond AT and Glick B S. High-quality immunofluorescence of cultured cells[J]. Methods Mol Biol，2010，619 :403-410. ；Thornton CR and Talbot NJ. Immunofluorescence microscopy and immunogold EM for investigating fungal infection of plants[J]. Nat Protoc,2006,1 (5) :2506-2511. ；Schneider Gasser EM, Straub CJ, Panzanelli P，et al. Immunofluorescence in brain sections :simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons[J]. Nat Protoc, 2006，1(4) :1887-1897. ；Rogers SL and Rogers GC. Culture of Drosophila S2cells and their use for RNAi—mediated loss一of一function studies and immunofluorescence microscopy [J]. Nat Protoc, 2008, 3 (4) :606-611.)。此外，我们釆用的速效漂洗方法能快 速(每次漂洗一片爬片需时不到lmin)有效地漂洗掉细胞爬片上的反应溶液和未结合的抗 体，所需时间比同类方法更短(Bhattacharyya DiHammond AT and Glick BS. High-quality immunofluorescence of cultured cells[J]. Methods Mol Biol,2010,619 :403-410.； Taber LH，Brasier F，Couch RB,et al. Diagnosis of herpes simplex virus infection by immunofluorescence[J]. J Clin Microbiol，1976，3(3) :309-312. ；Rosner KiMischke R and Schuberth HJ. Evaluation of a standard immunofluorescence assay and a new flow cytometric method for the detection of autoreactive antibodies in dogs with tumours[J]. Res Vet Sci，2007，82 (1) :27-33. ；Thompson TA and Wilkinson HW. Evaluation of a solid-phase immunofluorescence assay for detection ofantibodies to Legionella pneumophila[J]. J Clin Microbiol,1982,16(1) :202-204.)。 另一方面，我们的方法对抗体溶液的需求为25 μ l/254mm2 (按照Φ 18mm规格的爬片计算)； 而按照传统方法抗体溶液的用量约为150 μ l/22mm2 (Rogers SL and Rogers GC. Culture of Drosophila S2cells and their use for RNAi—mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy [J]. Nat Protoc，2008，3 (4) :606-611.)。经检索未 发现一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法被公开或使用。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法，该方 法在保持标记细胞的免疫荧光质量(包括抗原识别灵敏度、准确性、荧光图像清晰度等)不 下降的前体下，明显缩短免疫荧光染色操作的时间，并明显削减了一抗和二抗的使用量，所 需抗体的体积约为传统方法需要量的1. 5%，从而达到快速、经济之目的。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施—种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法，其步骤是A、细胞培养并固定于盖玻片上，制备细胞爬片(即可以贴附细胞的圆形盖玻片)， 使免疫荧光染色操作更加方便。所述的细胞爬片样品的制备过程是1)细胞爬片样品的制备过程a 在接种细胞前，先将灭菌后的爬片(coverslip)放入培养皿，再加入培养基和 细胞，使细胞均勻地贴附在爬片上表面和未被爬片覆盖的培养皿底部。待细胞贴壁后按各 自的实验计划培养和处理细胞。在细胞贴附及生长过程中尽量不要使爬片相互重叠。本法 适用于所有贴壁细胞，所用的培养基随细胞培养特性而变化，实施例中所用细胞为成纤维 细胞，培养基为MEM。b 将含有待检测细胞的悬液滴加在爬片上，使其风干。2)收集细胞爬片用镊子将细胞培养皿中的爬片样品取出，放入12孔板中(预先 在每个孔中注入Uml PBS)，爬片正面(贴附细胞的一面)向上。3)漂洗吸除12孔板中的PBS，再次加入PBS并吸除。4)细胞固定向每个孔加入Iml固定剂3% (M/V)甲醛溶液或其他固定剂，如多聚 甲醛、甲醇、戊二醛、丙酮等，室温O0-25°C，以下相同)放置lOmin。所述的固定剂为甲醛、 多聚甲醛、甲醇、戊二醛、丙酮等溶液中的任意一种。5)漂洗吸除固定剂，用PBS洗2次。所述的固定剂为甲醛、多聚甲醛、甲醇、戊二 醛、丙酮等溶液的任意一种。6)细胞穿透每孔加入Iml穿透剂(1% Triton-X-100，其他效果较好的穿透剂还 包括NP-40、皂角苷、土温、洋地黄皂苷等)，室温放置5-lOmin。所述的穿透剂为NP-40、皂 角苷、土温、洋地黄皂苷等中的任意一种。7)漂洗吸除穿透剂，用PBS洗1次。B.免疫荧光染色1)预备封口膜和PBS。2)封闭配制(将30 μ 1胎牛血清与70 μ 1预先配好的无血清封闭液混合，无血清 封闭液配制见“B.试剂 无血清封闭液”)并点加封闭液；爬片的漂洗与浙干(用镊子夹住爬片，快速、反复15-35次地使爬片浸/出PBS进行漂洗，依次在3个量杯中进行漂洗；然后 把爬片的一边放纸巾上吸去多余PBS)；爬片(正面向下)盖于封闭液上，室温孵育15min; 终止封闭(用1000 μ 1的移液枪向爬片的边缘注入PBS，使爬片浮起)；速效漂洗与浙干。3) 一抗孵育配制一抗溶液(一抗原液用无血清封闭液稀释，稀释比例因所使用 的抗体而异，并参见“B.试剂 抗体”部分)；爬片(正面向下)盖于一抗溶液上，室温孵育 IOmin ；终止一抗孵育(用1000 μ 1的移液枪向爬片的边缘注入PBS，使爬片浮起)；速效漂 洗与浙干(用镊子夹住爬片，快速、反复15-35次地使爬片出/入PBS进行漂洗，依次在3 个量杯中进行漂洗；然后把爬片的一边放纸巾上吸去多余PBS)。4) 二抗孵育配制二抗溶液(二抗原液及细胞核染料用无血清封闭液稀释，稀释 比例因所使用的抗体而异，并参见“B.试剂 抗体”部分)；爬片(正面向下)盖于二抗溶 液上，室温孵育IOmin ；终止二抗孵育(用1000 μ 1的移液枪向爬片的边缘注入PBS，使爬片 浮起)；速效漂洗与浙干(用镊子夹住爬片，快速、反复15-35次地使爬片出/入PBS进行 漂洗，依次在3个量杯中进行漂洗；然后把爬片的一边放纸巾上吸去多余PBS)。5)装载爬片准备爬片；点加抗荧光衰退剂(含抗荧光衰退剂配方)；清洁爬片； 将爬片盖于载玻片上的抗荧光衰退剂上(正面向下)，用镊子轻压爬片以尽量贴紧载玻片； 用吸除爬片周围多余的抗荧光衰退剂；在爬片边缘点上2-3滴指甲油以辅助固定；观察或 保存样品。所述的抗荧光衰退剂配方为IOmg对苯二胺溶解入Iml PBS，再与9ml甘油混合， 配制成含lmg/ml对苯二胺和90% (V/V)甘油的溶液。C.荧光显微镜下观察荧光及拍照。荧光激发光经相应的荧光滤光片后看到目的分 子显示清晰、特异的红色、绿色、蓝色荧光。荧光染色的靶分子特异荧光强，而且染色不同的 靶分子(UL44与细胞核，IE-l、aCtin与细胞核)的荧光无明显相互干扰现象，结构、图像清 晰，定位准确。(具体结果见图1、图2，以及“实验结果说明”)本发明与现有技术相比，具有下列优点1)使用细胞爬片(样品)覆盖试剂的方式进行封闭、一抗、二抗的孵育，结合独特 的细胞爬片漂洗方法，达到省时间、省贵重试剂(一抗、二抗)的效果(Thornton CR and Talbot NJ. Immunofluorescence microscopy and immunogold EM for investigating fungal infection of plants[J]. Nat Protoc,2006,1 (5) :2506-2511. ；Rogers SL and Rogers GC. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss—of—function studies and immunofluorescence microscopy[J]. Nat Protoc,2008, 3(4) :606-611.)。2)质量/效果好。能准确地定位抗原的位置和显示相对量，所标记靶分子的荧光 清晰而背景荧光很低。3)简便易行。操作简便，容易掌握；除样品、试剂的保藏以外，所有操作在室温下 进行。
图IA人巨细胞病毒(AD169)图IB人巨细胞病毒(AD169)图IC人巨细胞病毒(AD169)感染后24h细胞核内形成的点状复制中心。 感染后4 细胞核内形成的小型复制中心。 感染后60h细胞核内形成的中型复制中心。
图ID人巨细胞病毒(AD169)感染后细胞核内形成的单个巨大复制中心。图IE图IA的细胞核。图IF图IB的细胞核。图IG图IC的细胞核。图IH图ID的细胞核。图1中人巨细胞病毒(AD169株)感染成纤维细胞后病毒复制中心的形成与发展。 A、B、C、D红色荧光分别为人巨细胞病毒(AD169株)感染后24h、48h、60h、96h复制中心。 E、F、G、H蓝色荧光显示相应的A、B、C、D的细胞核。图中标尺=10 μ m。图2A阴性对照细胞核。图2B阴性对照细胞骨架(actin)。图2C阴性对照细胞中人巨细胞病毒IE-I蛋白为阴性。图2D人巨细胞病毒感染细胞核。图2E人巨细胞病毒感染后12h细胞骨架(actin)变化。图2F人巨细胞病毒感染后12h细胞核中IE-I蛋白阳性。图2中为人巨细胞病毒(Towne株)感染成纤维细胞后(12h)细胞骨架的变化。蓝 色荧光显示细胞核，绿色荧光显示细胞的肌动蛋白(actin)，红色荧光标记的是人巨细胞病 毒IE-I蛋白。图中标尺=20 μ m。
具体实施例方式下面结合附图对本发明进一步阐述—种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法，其步骤是I、细胞爬片样品的制备I. 1细胞贴附方法A 在接种细胞(贴壁细胞)前，先将灭菌后的盖玻片(coverslip)放入培养 皿，再加入MEM培养基和成纤维细胞(适用于各种贴壁细胞，培养时根据细胞要求使用相应 的培养基)，使细胞均勻地贴于盖玻片表面(获得爬片)和未被盖玻片覆盖的培养皿。待 细胞贴壁后，以感染复数为5(MI0 = 5)的病毒量感染，对照组不接种病毒(用等体积的条 件培养基替代)，根据研究目的之要求在指定的时间点收集爬片(具体时间见“实验结果说 明”部分)。在细胞贴附及培养过程中尽量避免爬片相互重叠。方法B 将含有特定浓度(5 X 105/ml 5 X 106/ml)的待检细胞的细胞悬液滴加在 盖玻片上，使其风干。此法适用于悬浮细胞、胰酶消化的贴壁细胞、微生物等。I. 2收集细胞爬片根据研究要求在所需时间点，用无菌镊子从细胞培养皿中 取出爬片样品，放入12孔板中(预先在每个孔中注入aiil PBS)，爬片的正面(即细胞 贴附的一面)必须向上。所用细胞爬片是能够使细胞较牢固贴附于其上的盖玻片，厚度 0. 15-0. 22mm，首选圆形且直径为1. 5-2. 2cm，方形亦可使用且长度为1. 5-2. 2cm。I. 3除去样本表面的培养液吸除12孔板中的PBS ；再次加入PBS并吸除以洗去样 本表面的培养液。I. 4细胞固定每孔加入Iml固定剂(3% V/V甲醛溶液)，室温(20_25°C以下相 同)固定lOmin。其他固定剂，所述的固定剂为多聚甲醛、甲醇、戊二醛、丙酮等任意一种。
I. 5漂洗吸除甲醛溶液，加入PBS再吸除，如此操作2次以洗去残留的甲醛。(至 此，可以继续下面的实验；也可以将爬片保存在适量PBS中，储存于4°C条件下，保质期3个 月，但切勿让PBS干掉。)I. 6细胞穿透每孔加入Iml穿透剂(1 % Triton-X-100)，室温放置5-lOmin。所 述的穿透剂为NP-40、皂角苷、土温、洋地黄皂苷等任意一种。I. 7漂洗吸除穿透剂，加PBS漂洗1次。(至此，可以继续下面的实验；也可以加 PBS后放4°C冰箱中存放，保质期3个月，但切勿让PBS干掉。)所述的穿透剂为NP-40、皂 角苷、土温、洋地黄皂苷等任意一种。II免疫荧光染色II. 1准备染色在实验台上滴几滴水，剪一张适当长度(根据爬片数决定膜的长 度)的paraf ilm膜贴在台面上，用记号笔在paraf ilm膜上划分区域；放置3个盛满PBS的 IOOml塑料量杯，取出存放爬片的12孔板。II. 2 封闭:II. 2. 1配制封闭液以无血清封闭液(见“B.试剂·无血清封闭液”)为基础配 制含30% (V/V)胎牛血清的封闭液(将30 μ 1胎牛血清与70 μ 1预先配好的无血清封闭液 混合)，在每个预定的样品区域内加入30 μ 1该封闭液。II. 2. 2漂洗与浙干用镊子取出爬片，把持爬片浸于PBS中稍稍漂洗，洗后让爬片 一边的边缘接触纸巾，吸去爬片上的PBS。II. 2. 3封闭将爬片盖在预先点于paraf ilm膜上的含30% (V/V)胎牛血清的封 闭液上(正面朝下)，室温下孵育15min。II. 2. 4终止封闭用1000 μ 1的移液枪向爬片的边缘注入PBS，使爬片浮起。II. 2. 5速效漂洗与浙干用镊子把持爬片，快速、上下反复地使爬片浸/出PBS多 次(10次)进行漂洗。洗后让爬片一边的边缘接触纸巾，吸去爬片上的PBS。II. 3 —抗孵育II. 3. 1配制一抗在封闭孵育期间，用无血清封闭液稀释一抗(稀释比例见 “B.试剂·抗体”)；在封闭孵育即将结束时，在每个预定位点加上25 μ 1 —抗溶液。II. 3. 2 一抗孵育将步骤II. 2. 5洗好浙干的爬片盖在预先点于paraf ilm膜上的 25 μ 1 一抗溶液上(正面朝下)，室温下孵育lOmin。II. 3. 3终止一抗孵育用1000 μ 1的移液枪向爬片的边缘注入PBS，使爬片浮起。II. 3. 4速效漂洗与浙干用镊子把持爬片，快速、上下反复地使爬片浸/出PBS多 次(30次)进行漂洗。洗后让爬片一边的边缘接触纸巾，吸去爬片上的PBS。II. 4 二抗孵育II. 4. 1配制二抗溶液在一抗孵育期间，将二抗及细胞核染料在同一份无血清封 闭液里稀释混勻(具体的稀释比例见“B.试剂 抗体”)；在一抗孵育即将结束时，在每个 预定位点加上25 μ 1该溶液。II. 4. 2 二抗孵育将步骤II. 3. 4洗好浙干的爬片盖在预先点于paraf ilm膜上的 25 μ 1 二抗溶液上(正面朝下)，室温下孵育lOmin。II. 4. 3终止二抗孵育用1000 μ 1的移液枪向爬片的边缘注入PBS，使爬片浮起。II. 4. 4速效漂洗与浙干用镊子把持爬片，快速、上下反复地使爬片浸/出PBS多次(30次)进行漂洗。洗后让爬片一边的边缘接触纸巾，吸去爬片上的PBS。所述的步骤II. 2、11.3、II. 4中速效漂洗具体方法是，用镊子把持爬片，快速、上 下反复地使爬片浸/出PBS多次(15-35次)，依次在3个量杯中进行漂洗。洗后让爬片一 边的边缘接触纸巾，吸去爬片上的PBS。II. 5装载爬片II. 5. 1准备载玻片在二抗孵育期间，准备干净的载玻片(如果不够干净用70% (V/V)酒精擦洗干净)，用记号笔标注必要的信息。II. 5. 2准备抗荧光衰退剂在二抗孵育期间，从-20°C冰箱中取出、融化抗荧光衰 退剂，在载玻片上加上一滴溶液(每个载玻片能放3个爬片，每个爬片需要一滴抗荧光衰退 剂)。抗荧光衰退剂除对苯二胺外，还可用Ι-4-DiazabicycloQ，2，2)-octane (DABCO)或 η-propyl gallate (NPG)。II. 5. 3清洁爬片用Kimwipes纸巾擦拭步骤II. 4. 4洗好浙干爬片的背面。II. 5. 4装载爬片将爬片盖于载玻片上的抗荧光衰退剂上(正面向下)，用镊子 轻压爬片使其贴紧载玻片；用连接电动吸引器的巴斯德管吸除爬片周围多余的抗荧光衰退 剂；在爬片边缘涂少许指甲油以辅助固定。II. 5. 5观察或储存染好的样本制备好的样品可以直接在荧光显微镜下观察，也 可以4°C避光保存1周。III显微镜观察及拍照使用荧光显微镜可以观察样品的明视野和荧光显影的显微结构，同时可以利用荧 光显微镜配套的摄像系统拍照。根据各自的需求，可选择20X、40X、60X、100X物镜，使 用油镜与镜油效果更佳。观察后，样品可以在4°C下避光存放，或者回收载玻片。一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法，其特征是所用细胞爬片是能够 使细胞较牢固贴附于其上的盖玻片，厚度0. 15-0. 22mm,首选圆形且直径为1. 5-2. 2cm,方 形亦可使用且长度为1. 5-2. 2cm。一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法，其特征是所述的(步骤II. 2、 II. 3,11. 4中)速效漂洗，具体方法是用镊子把持爬片，快速、上下反复地使爬片浸/出PBS 多次(15-35次)，依次在3个量杯中进行漂洗。洗后让爬片一边的边缘接触纸巾，吸去爬片 上的PBS。一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法，其特征是所述的在封闭孵育、一 抗孵育、二抗孵育中的孵育方式是把爬片正面向下覆盖孵育溶液。一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法，其特征是所述的抗荧光衰退剂 配方为IOmg对苯二胺溶解入Iml PBS,再与9ml甘油混合，配制成含lmg/ml对苯二胺和 90% (V/V)甘油的溶液。实验结果说明实验1 巨细胞病毒(AD169株)感染成纤维细胞(5 X IO5细胞/IOOmm培养皿，15片盖玻 片)，在感染后Mh-96h间，在细胞核内形成点状复制中心、小型复制中心、中型复制中心， 以及最终的单个大型单复制中心。(图1A、图1B、图1C、图1D、图1E、图1F、图1G、图1H)实验2:
巨细胞病毒(Towne株)感染成纤维细胞1 后，阴性对照细胞(IE-1阴性的细 胞)中正常的肌动蛋白丝结构与分布；病毒感染细胞中IE-I阳性，肌动蛋白丝解聚并伴随 细胞形态改变。(图2A、图2B、图2C、图2D、图2E、图2F)实施例中所实验用的主要材料如 下A.材料·细胞爬片(Fisherbrand)，直径 18mm，厚度 0. 2mm。·标准载玻片(Fisherbrand)，厚度 1_。·其它12孔板、IOOml塑料量杯3个、眼科镊子、parafilm封口膜。B.试剂· 10XPBS 禾口 IX PBS。. 3% (M/V)甲醛溶液用 82ml 蒸馏水、IOml 10XPBS、8. 5ml 37% (M/V)甲醛溶 液(湖北奥生新材料科技有限公司)配制成IOOml的溶液，4°C存放。· 1% Triton-X-IOO 溶液将 Iml Triton-X-100 (购自荟萃生物公司)溶入 99ml PBS，配成 100ml 1 % Triton-X-100 溶液，室温存放。 无血清封闭液即含有1% (M/V)牛血清白蛋白(BSA) (Biosciences PTY Ltd.) 和0· 01 % (V/V)吐温-20 (Tween-20)(购自飞羿科技公司)的PBS溶液，4°C存放。· 30% (V/V)胎牛血清封闭液胎牛血清(杭州四季青)与无血清封闭液按照 3 7比例配制，4°C存放。·抗荧光衰退剂10mg对苯二胺(购自上海山浦化工有限公司)溶解于Iml PBS 中，再与9ml甘油混合。以Iml/管分装，-80°C长期储存。常用的则储存于_20°C。 细胞核染料Hoechst，l 5000稀释使用。·抗体a)标记巨细胞病毒复制中心的抗体(图1A、图IB、图1C、图ID)—抗为抗UL44的 单克隆抗体(IgGl，购自Rumbaugh-Goodwin癌症研究所，美国)，1 1000稀释使用；二抗 为TRITC耦联的羊抗鼠IgGl单克隆抗体(Southern Biotech公司，美国)，1 250稀释使用。b)标记微丝蛋白的抗体(图2B、图2E)—抗为鼠抗aCtin(pan Ab_5)的单克隆 抗体(IgGl，购自 NeoMarkers，Frement，CA，USA)，1 100 稀释使用；二抗为 Alexa488 耦联 的羊-抗鼠IgGl单克隆抗体(购自Molecular Probes，美国)，1 5000稀释使用。c)标记人巨细胞病毒IE-I的抗体(图2C、图2F)—抗为抗IE-I的单克隆抗体 (IgGh，由美国阿拉巴马大学的Bill Britt教授赠送)，1 25稀释使用；二抗为TRITC耦 联的羊抗鼠IgG^i单克隆抗体(购自Molecularfrobes，美国)，1 250稀释使用。10
权利要求
1.一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法，其步骤是A.细胞培养并固定于盖玻片上，制备细胞爬片1)细胞爬片的制备过程是a 在接种细胞前，先将灭菌后的爬片放入培养皿，再加入培养基和细胞，使细胞均勻地 贴附在爬片上表面和未被爬片覆盖的培养皿底部，待细胞贴壁后按各自的实验计划培养和 处理细胞，在细胞贴附及生长过程中不要爬片相互重叠，所用细胞为成纤维细胞，培养基为 MEM ；b 将含有待检测细胞的悬液滴加在爬片上，使其风干2)收集细胞爬片用镊子将细胞培养皿中的爬片取出，放入12孔板中，爬片正面向上；3)漂洗吸除12孔板中的PBS，再次加入PBS并吸除；4)细胞固定向每个孔加入Iml固定剂3%M/V甲醛溶液，室温放置IOmin ；5)漂洗吸除固定剂，用PBS洗2次；6)细胞穿透每孔加入Iml穿透剂，Triton-X-100，室温放置5-lOmin；7)漂洗吸除穿透剂，用PBS洗；B.免疫荧光染色1)预备封口膜和PBS;2)封闭配制并点加封闭液，将30μ1胎牛血清与70μ 1的无血清封闭液混合，爬片的 漂洗与浙干，夹住爬片，使爬片浸/出PBS进行漂洗，然后把爬片的一边放纸巾上吸去多余 PBS，爬片盖于封闭液上，室温孵育15min ；终止封闭，用1000 μ 1的移液枪向爬片的边缘注 入PBS，爬片浮起，漂洗与浙干；3)一抗孵育配制一抗溶液，爬片盖于一抗溶液上，室温孵育IOmin ；终止一抗孵育，用 1000 μ 1的移液枪向爬片的边缘注入PBS，爬片浮起，漂洗与浙干；4)二抗孵育配制二抗溶液，爬片盖于二抗溶液上，室温孵育IOmin ；终止二抗孵育，用 1000 μ 1的移液枪向爬片的边缘注入PBS，爬片浮起，漂洗与浙干；5)装载爬片准备爬片，点加抗荧光衰退剂，清洁爬片，将爬片盖于载玻片上的抗荧光 衰退剂上，用镊子轻压爬片贴紧载玻片；用吸除爬片周围多余的抗荧光衰退剂，在爬片边缘 点上指甲油固定，观察或保存样品；C.荧光显微镜下观察荧光及拍照。
2.根据权利要求1所述的一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法，其特征是 所述的细胞爬片是贴附于其上的盖玻片，厚度0. 15-0. 22mm,直径为1. 5-2. 2cm,长度为 1. 5-2. 2cm。
3.根据权利要求1所述的一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法，其特征是 所述的抗荧光衰退剂为IOmg对苯二胺溶解入Iml PBS,再与9ml甘油混合，配制成含Img/ ml对苯二胺和90% V/V甘油的溶液。
4.根据权利要求1所述的一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法，其特征是 所述的固定剂为甲醛、多聚甲醛、甲醇、戊二醛、丙酮溶液中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法，其特征是 所述的穿透剂为NP-40、皂角苷、土温、洋地黄皂苷中的任意一种。
全文摘要
本发明公开了一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法，其步骤是A.细胞培养并固定于盖玻片上，制备细胞爬片a在接种细胞前，先将灭菌后的爬片放入培养皿，再加入培养基和细胞；b将含有待检测细胞的悬液滴加在爬片上，使其风干；收集细胞爬片；漂洗；细胞固定；漂洗；细胞穿透；漂洗吸除穿透剂；B.免疫荧光染色预备封口膜和PBS；封闭；一抗孵育；二抗孵育；装载爬片；C.荧光显微镜下观察荧光及拍照。简便易行。操作简便，容易掌握，所有操作在室温下进行。达到省时间、省贵重试剂，质量/效果好。能准确地定位抗原的位置和显示相对量，所标记靶分子的荧光清晰而背景荧光很低。
文档编号G01N33/543GK102043047SQ20101052901
公开日2011年5月4日 申请日期2010年11月2日 优先权日2010年11月2日
发明者伊丽莎白福尔图那托, 段莹亮, 罗敏华 申请人:中国科学院武汉病毒研究所
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