专利名称：灵敏快速的肝硬化和肝癌磁珠酶免法诊断试剂盒与磁珠的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及医学诊断试剂盒，特别涉及一种灵敏快速的肝硬化和肝癌磁珠酶
免法诊断试剂盒与磁珠
背景技术：
各类型肝炎病毒感染、过度摄入酒精和长期处于富含有机溶剂的环境中会导致肝 损伤，肝损伤的结果是发炎、组织硬化甚至是癌症的形成。在恶性肿瘤中肝癌的死亡率列在 肺癌、胃癌之后居第三位。肝癌已经严重危害了我国人民的生命安全，因此，非常有必要对 肝硬化及肝癌的早期诊断做深入的研究。 目前常用的诊断技术中，要么假阳性高，要么检测灵敏度不够，都会给患者带 来严重的影响，随着酶联免疫技术的发展，人们发现通过使用特定结合到自人原癌基因 HCCR-1和HCCR-2表达的蛋白的抗体进行的抗原_抗体结合反应可分别有效检测早期肝 癌和肝硬化，(狄东进，陈军浩等人，HCCR1和HCCR2可溶性蛋白在细菌中表达、纯化及在 早期肝癌诊断中的应用，中国现代医学杂志，2006年第16巻第10期)，在中国专利申请号 200480014598. 4，《包含特定针对人原癌基因蛋白的抗体的肝硬化诊断试剂盒》的中国专利 申请提供了一种传统的酶标板酶联免疫吸附化验法(ELISA)检测标本中HCCR-2抗原的方 法，而2006年(YoonSK， Lim NK， et The Human Cervical Cancer Oncogene Protein Is a Biomarker for HumanH印atocellular Carcinoma. Cancer Research 64,5434—5441， August 1，2004)，也采用传统的酶标板酶联免疫吸附化验法(ELISA)检测标本中HCCR-1 抗原，但传统板式ELISA检测方法有灵敏度不高、操作耗时长等缺点，这两个抗原蛋白是早 期检测肝硬化与肝癌提供了完美的标志物，但目前的检测方法限制了其检测灵敏度和准确 性。有研究表明在微粒磁珠上包被探针或抗体进行分离纯化等目的的实验，具有可定量，操 作方便且干扰因素少，灵敏度和特异性好等优点，但目前没有包被肝硬化及肝癌标志蛋白 的抗体的磁珠，也没有包括类似磁珠的适于检测肝硬化和肝癌的试剂盒。
实用新型内容根据上述领域的空白，本实用新型提供灵敏快速的肝硬化和肝癌磁珠酶免法诊断 试剂盒与磁珠，磁珠包被了抗肝硬化和肝癌患者血清中标志性抗原蛋白的抗体，该磁珠与 其他检测试剂以特定的空间位置放置在盒中，科学的设计使放置于其中的各种试剂在使用 过程中能够稳定保存活性，保证磁珠检测反应的灵敏度和准确性。 灵敏快速的肝硬化和肝癌磁珠酶免法诊断试剂盒与磁珠，包括盒体及与盒体内壁 贴合的试剂管支架，所述试剂管支架上表面设有若干试剂管槽，所述其中一个试剂管槽中 放置有盛有磁珠的磁珠管，另一个试剂管槽中放置酶标板，其特征在于，所述磁珠表面包被 有一层抗体，所述酶标板为磁珠与待测血清在其板孔中进行反应的空白微孔板，所述抗体 指肝硬化患者血清中标志性抗原蛋白HCCR-2特异结合的抗体，或指肝癌患者血清中标志 性抗原HCCR-1特异结合的抗体。
3[0006] 所述试剂管支架上设置的试剂管槽指显色底物管槽，标记物管槽，缓冲液管槽，反 应终止液管槽，对照液管槽和/或磁力架槽。 所述试剂管支架上的显色底物管槽中放置有显色底物管，标记物管槽中放置有标 记物管，缓冲液管槽中放置有缓冲液管，反应停止液管槽中放置有反应停止液管，对照液管 槽中放置有对照液管和/或磁力架槽中放置有磁力架。所述酶标板槽和磁珠管槽所在区域 位于试剂管支架的同一端，所述区域为一个与试剂管支架其它部分可拆式连接的托架。 —种磁珠，其特征在于所述磁珠表面覆盖有一层具有抗原识别活性的抗体。 本实用新型灵敏快速的肝硬化和肝癌磁珠酶免法诊断试剂盒，为早期检测肝硬化 和肝癌提供了一种便捷、高效且检测灵敏度高的途径，本试剂盒内酶标板不包被抗体，而是 用抗体来包被磁珠微粒，包被的磁珠微粒作为试剂使用，更利于定量操作，方便稳定，而且 灵敏度更高，在抗体抗原反应中干扰因素能降到最低。试剂盒中包括盛有磁珠的磁珠管和 酶标板，磁珠管和酶标板卡装在盒内的试剂管支架上，由于在检测中磁珠管与酶标板是同 时使用，缺一不可，且二者之间在外形上差异比较大，如果随便放置在盒子中，移动时及运 输过程中容易相互撞击导致磁珠性质不稳定，进而影响检测结果的可靠性，因此本实用新 型在盒内设置一个试剂管支架，试剂管支架上设有与试剂管和酶标板底部稳定卡合的凹 槽。这样能够保证本实用新型试剂盒中的包被有抗体的磁珠保持稳定的活性，从而保证抗 体抗原反应的灵敏度。 本实用新型试剂盒中的试剂管支架上还可以设置检测反应中需要用到的各种试 剂和设备的凹槽，便于在试剂盒中放入需要用到的各种试剂和设备，如显色底物，标记物， 缓冲液，反应停止液、对照液、磁力架等。设置这些凹槽是为了在使用中，方便实验人员根据 需要配置各种试剂放在试剂盒中，便于使用和携带。 本实用新型优选在试剂盒中的各管槽中配置检测反应所需的相应的试剂管，提高 本试剂盒的适用性与便捷度。 本实用新型优选所述酶标板槽和磁珠管槽所在区域位于试剂管支架的同一端，所 述区域与试剂管支架其它部分为可拆式连接。由于在检测反应中最先用到磁珠与酶标板， 且在抗体抗原反应的20 30分钟期间，试剂盒中的其他试剂都不用着，若将整个试剂盒从 冰箱中取出，容易因试剂反复冻融而破坏试剂的稳定性，因此，将磁珠管槽与酶标板槽独立 到一个区域，所述区域制成与试剂管支架之间可拆式连接的一个托架，进行检测反应的第 一步时，仅取出托架，而不影响盒内其它试剂。
1-盒体，2-试剂管支架，3-磁珠管，3A-磁珠管槽，4-酶标板，4A-酶标板槽，5_试 剂管槽，5A-试剂管，6-显色底物管槽，7-标记物管槽，8-缓冲液管槽，9-反应停止液管槽， 10-对照液，11-磁力架槽，12-托架。 图1.本实用新型试剂盒开盒盖后的俯视示意图。 图2.本实用新型试剂盒开盖后弃除其中的试剂管后的俯视示意图。 图3.盛装酶标板与磁珠管的与试剂管支架可拆式连接区域的俯视示意图。 图4.本实用新型试剂盒中磁珠包被抗体的结构示意图。
具体实施方式
实施例1. 如图1及图2所示，本实用新型灵敏快速的肝硬化和肝癌磁珠酶免法诊断试剂盒， 包括盒体1及与盒体内壁贴合的试剂管支架2，所述试剂管支架2上表面设有若干试剂管槽 5，所述其中一个试剂管槽为磁珠管槽3A中放置有盛有磁珠的磁珠管3，另一个试剂管槽及 酶标板槽4A中放置酶标板4，其特征在于，其特征在于，所述磁珠表面包被有一层抗体，所 述酶标板4为磁珠与待测血清在其板孔中进行反应的空白微孔板，所述抗体指肝硬化患者 血清中标志性抗原蛋白HCCR-2特异结合的抗体，或指肝癌患者血清中标志性抗原HCCR-1 特异结合的抗体。本实用新型试剂盒中包括盛有磁珠的磁珠管3和酶标板4，磁珠管3和 酶标板4卡装在盒内的试剂管支架2上，由于在检测中磁珠管3与酶标板4是同时使用的， 缺一不可，而二者之间在外形上差异比较大，如果随便放置在盒子中，移动时及运输过程中 容易相互撞击导致磁珠性质不稳定，进而影响检测结果的可靠性，因此本实用新型在盒内 设置一个试剂管支架2，试剂管支架2上设有与磁珠管3和酶标板4的底部稳定卡合的凹 槽。这样能够保证本实用新型试剂盒中的包被有抗体的磁珠保持稳定的活性，从而保证抗 体_抗原反应的灵敏度，设有与磁珠管3和酶标板4的底部稳定卡合的凹槽。这样能够保 证本实用新型试剂盒中的包被有抗体的磁珠保持稳定的活性，从而保证抗体-抗原反应的 灵敏度，磁珠上包被了抗标志肝硬化和肝癌的抗原蛋白的抗体，在抗体抗原反应中当作试 剂使用，便于定量和检测，其能够识别肝硬化或者肝癌患者血清中特有的标志抗原蛋白，从 而实现肝硬化及肝癌的早期检测。 本实用新型试剂盒中的磁珠管中的磁珠包被的抗体为抗标志肝硬化的抗原蛋白 HCCR-2蛋白的单抗，或抗标志肝癌的抗原蛋白HCCR-1的单抗。 本实用新型为了为检测工作人员提供更为便捷的试剂盒，在本试剂盒中，试剂管 支架2上设置的试剂管槽5还包括显色底物管槽6、标记物管槽7、缓冲液管槽8、酶促反应 停止液管槽9，对照液管槽10和/或磁力架槽11。在使用中，实验人员可以根据需要自己 配置各种试剂放在试剂盒中，便于使用和携带。 更进一步，本实用新型的试剂盒，所述试剂管支架上还有放置在显色底物管槽6 中的显色底物管，标记物管槽7中的标记物管，缓冲液管槽8中的缓冲液管，反应停止液管 槽9中的反应停止液管，对照液管槽10中的对照液管和/或放置于磁力架槽11中的磁力 架。直接为检测工作人员提供检测费用所需的检测试剂。 更进一步优选设计如图2、图3所示，所述酶标板槽4A和磁珠管槽3A所在区域位 于试剂管支架2的同一端，所述区域是一个与试剂管支架2的其它部分为可拆式连接的托 架12。由于在检测反应中最先 到磁珠管3与酶标板4，且在抗体抗原反应的20 30分 钟期间，试剂盒中的其他试剂都不用着，若将整个试剂盒从冰箱中取出，容易因试剂反复冻 融或温度变化而破坏试剂的稳定性，进行检测反应的第一步抗原抗体结合反应时，仅取出 托架12即可，而不用把这个盒子拿出来，因此不影响盒内其它试剂。 实施例2.检测人血清HCCR-2抗原 2. 1样本要求人血清，要求清亮、无沉淀、无黄疸；样本1周以内检测可在4t:条
件下贮存；样本1周以上检测需在_201:条件下冻存，且避免反复冻融。 2. 2从试剂盒中取出托架6，并取出托架上的磁珠管3与酶标板4即微孔板，将一个磁珠管3中的包被有HCCR-2单抗的磁珠如图4迅速加入到微孔板中，每个孔加90ul，并 分别加入待测血清10ul，2-8t:震荡孵育30分钟。 2. 3洗涤把微孔板放在磁板上2分钟至磁珠吸附于管壁，吸掉上清。使用一个缓
冲液管中的PBS缓冲液清洗磁珠三次，操作同普通生物素标记的磁珠，用了一个缓冲液管
中的lOOul缓冲液A(O. 1M Na-phosphate buffer pH 7.4)重悬磁珠。 2. 4打开标记物管，吸取标记物HRP ( 二抗)，每个微孔中加lOOul HRP标记HCCR-2
单抗，在37t:温箱或水浴震荡反应15分钟。 2. 5重复2. 3洗涤。 2. 6显色取出底物液管吸出能使上一步标记物显色的底物液，每孔加入底物液
50ul，保持震荡，室温避光准确反应10分钟(从第一孔加入时开始计时)。 2. 7终止取出反应终止液管，微孔板上每反应孔加入50ul终止液。轻微震荡混匀。 2. 8将微孔板放于磁板上，使磁珠吸于板条侧壁。 2. 9读值轻轻取下微孔板，将酶标仪设定在双波长450nm/630nm，测量各孔A值， 在终止反应后15分钟内读值。
权利要求灵敏快速的肝硬化和肝癌磁珠酶免法诊断试剂盒，包括盒体及与盒体内壁贴合的试剂管支架，所述试剂管支架上表面设有若干试剂管槽，所述其中一个试剂管槽中放置有盛有磁珠的磁珠管，另一个试剂管槽中放置酶标板，其特征在于，所述磁珠表面包被有一层抗体，所述酶标板为磁珠与待测血清在其板孔中进行反应的空白微孔板，所述抗体指肝硬化患者血清中标志性抗原蛋白HCCR-2特异结合的抗体，或指肝癌患者血清中标志性抗原HCCR-1特异结合的抗体。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂管支架上设置的试剂管槽指显色底物管槽，标记物管槽，缓冲液管槽，反应终止液管槽，对照液管槽和/或磁力架槽。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂管支架上的显色底物管槽中放置有显色底物管，标记物管槽中放置有标记物管，缓冲液管槽中放置有缓冲液管，反应停止液管槽中放置有反应停止液管，对照液管槽中放置有对照液管和/或磁力架槽中放置有磁力架。
4. 根据权利要求1或2或3所述的试剂盒，其特征在于所述酶标板槽和磁珠管槽所在区域位于试剂管支架的同一端，所述区域为一个与试剂管支架其它部分可拆式连接的托架。
5. —种磁珠，其特征在于所述磁珠表面覆盖有一层具有抗原识别活性的抗体，所述抗体指肝硬化患者血清中标志性抗原蛋白HCCR-2特异结合的抗体，或指肝癌患者血清中标志性抗原HCCR-1特异结合的抗体。
专利摘要本实用新型“灵敏快速的肝硬化和肝癌磁珠酶免法诊断试剂盒与磁珠”，属于医学诊断领域，包括盒体及与盒体内壁贴合的试剂管支架，所述试剂管支架上表面设有若干试剂管槽，所述其中一个试剂管槽中放置有盛有磁珠的磁珠管，另一个试剂管槽中放置酶标板，其特征在于，所述磁珠表面包被有一层抗体，所述酶标板为磁珠与待测血清在其板孔中进行反应的空白微孔板，所述抗体指肝硬化患者血清中标志性抗原蛋白HCCR-2特异结合的抗体，或指肝癌患者血清中标志性抗原HCCR-1特异结合的抗体。
文档编号G01N33/574GK201477095SQ200920222340
公开日2010年5月19日 申请日期2009年9月2日 优先权日2009年9月2日
发明者吴凡, 焦守恕 申请人:同昕生物技术(北京)有限公司
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