专利名称：一种地沟油快速检测试纸的制备方法
技术领域：
本发明涉及地沟油检测技术领域，尤其涉及一种地沟油快速检测试纸的制备方法。
背景技术：
地沟油也被称为潲水油、泔水油或餐桌回收油脂，是人们对于各种劣质油脂的总称；地沟油经历了多次高温反复油炸与下水道的氧化腐败过程，质量、卫生极差，成分发生变化，产生了如黄曲霉毒素、苯并芘等多种有毒物质，并含有洗涤剂成分等后期污染物，如长期食用必然会引发身体的疾病。轻则引起消化不良、腹泻，严重的会引发贫血、中毒性肝病等症状，长期食用有诱发癌症的危险，�：螅唤昀吹毓涤褪录偶幌示萃臣疲磕暧�200-300万吨地沟油回流市场，其中大部分并没有用于炼制生物柴油等合法途径，而是回流到餐桌，地沟油占据的食用油市场份额比例高达10%，而且现在的“地沟油”精炼程度已经很高，一些肉眼可见污染物，完全可以通过精炼去掉。目前，根据地沟油的特征成分，地沟油的检测方法主要有水分含量测定法、酸价测定法、胆固醇含量测定法、近红外光谱法、电导率与极性物质测定法、重金属含量测定法；上述方法在应用上各有优势，一定程度上都能进行地沟油的定性定量检测，但也存在缺陷如食用油中掺入地沟油的比例普遍需要达到相对较高的程度才能被检出；电导率法的检出下限为地沟油添加量达20%以上，胆固醇法的缺陷在于其检出下限为地沟油的添加量在10%以上，而且在检测中出现假阳性的可能性比较大；薄层层析法对于一些未经纯化油和加入其他成分的油，容易出现假阳性；对于一些检测精度相对于上述方法比较高的，如深圳药检所，HPLC检测胆固醇含量，最低检测限20 μ g/ml ;深圳药检所，LC-MS法检测DBS (十二烷基苯磺酸钠)，检出限为20 μ g/ml ;清华大学，顺磁共振波谱法，检测自由基等，需要大型贵重检测仪器，并且耗时较长，更适用于实验室的确证检验而不适于现场快速筛查的使用；上海之江生物医药科技有限公司利用实时荧光定量PCR扩增动物特有基因片段定性检测地沟油，灵敏度高(可检测出最低1%。的含量)，但是整个操作过程繁琐，需要非常专业的人员去操作；广州市疾病预防控制中心利用免疫荧光学检测方法检测细菌脂溶性蛋白和脂多糖，但此法仅能从泔水中含有大量细菌方面对地沟油作出判断；因此，开发新的快速检测技术，用于食用油中地沟油的定性、定量检测迫在眉睫。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种地沟油快速检测试纸的制备方法，包括如下步骤:A)免疫彩色乳胶微球的制备(a)彩色乳胶微球的预处理分别取红色、黄色、蓝色、绿色四色乳胶微球溶液，用超声波处理后，用超纯水调节浓度，离心，取沉淀用MES缓冲液清洗两次，得到洗好的乳胶，用预冷的MES缓冲液分别将EDC和NHS配置成溶液加入到所述洗好的乳胶中，在室温下缓慢混匀，孵育结束后离心，取沉淀用MES缓冲液清洗两次，得到乳胶微球溶液；(b)抗体标记用MES缓冲液将鼠抗黄曲霉毒素单克隆抗体、鼠抗
3苯并芘单克隆抗体、鼠抗茴香胺单克隆抗体和鼠抗DBS单克隆抗体稀释，之后分别缓慢加入到用磁力搅拌器搅拌的红色、黄色、蓝色和绿色的所述乳胶微球溶液中，室温轻柔搅拌后用PBS离心洗涤，沉淀用PBS-TBN溶解，超声波处理后，加入PBS-TBN至标记前体积，置4°C保存备用；B)免疫彩色胶乳反应垫的制备将玻璃纤维膜浸泡于反应垫处理液中，水浴处理后平铺于纱网上干燥3-4h，将标记后的彩色乳胶微球按照效价实验匹配的结果，以体积比为红黄蓝绿=2 2 4 5混合均匀，按照每毫升乳胶溶液铺50cm2涂覆玻璃纤维膜，干燥16h后置4°C密封保存备用；C)NC膜的制备将抗原黄曲霉毒素-0VA，苯并芘-0VA，茴香胺-OVA和DBS-OVA用包被缓冲液分别稀释至O. 3,0. 4,0. 4和O. 2mg/ml，用喷膜仪按I. O、O. 8,0. 8和I. 5 μ 1/cm分别喷涂于同一条NC膜上的不同区域作为检测线，每条检测线相距4-10mm,将浓度为2. Omg/ml的兔抗鼠IgG用喷膜仪按O. 5 μ 1/cm喷涂于质控区作为质控线，用封闭液封闭NC反应膜，再用PBST洗脱，然后室温晾干备用；D)彩色胶乳试纸条的的组装将样品垫放入处理液中处理后干燥备用，将干燥后的样品垫、反应垫、NC反应膜和吸水滤纸按顺序装配在PVC底板上，用带mark胶带绕背板覆盖在样品垫、反应垫及吸水滤纸上，然后用切条机切割成2-10mm宽的试纸条，制成地沟油彩色胶乳微球免疫层析检测试纸条。利用本发明制备的地沟油检测试纸在常温下可保质两年，有效延长保质期并降低保存条件；非专业人士用该检测试纸即可完成全程检测，操作简单，有利于该法的推广和普及；整个检测过程最快可以在IOmin内完成，更适合于现场快速筛选。作为本发明的进一步改进，所述步骤A)中乳胶微球的直径为lOOnm，变异系数< 10%，此时乳胶迁移速度及灵敏度均为最佳，且粒径接近，重现性好。作为本发明的进一步改进，所述超声波的频率为80Hz，经过超声波脱气处理后的乳胶颗粒会增加实验的准确度。作为本发明的进一步改进，所述地沟油彩色胶乳微球免疫层析检测试纸条各组分的尺寸为吸水滤纸2. 5cm, NC膜3. 5cm,反应垫Icm,样品垫3cm, PVC底板9cm,各部件比例适中，结果判读更可靠、清晰。与现有技术相比，本发明的有益效果是利用本发明制备的地沟油检测试纸检测灵敏度高，可以同时检测多个指标，为地沟油检测提供更全面、系统的检测方法，相对缩小检测成本；该检测试纸在常温下可保质两年，有效延长保质期并降低保存条件；非专业人士用该检测试纸即可完成全程检测，操作简单，有利于该法的推广和普及；整个检测过程最快可以在IOmin内完成，更适合于现场快速筛选。
图I为地沟油彩色胶乳微球免疫层析检测试纸条的组装示意图2为地沟油预处理装置示意图3为四条检测线均显色示意图4为黄曲霉毒素超标意图5为试纸失效不意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。实施例一免疫彩色乳胶微球的制备。I、彩色乳胶微球的预处理。分别取直径在IOOnm左右，颗粒大小均匀，变异系数< 10%的红色、黄色、蓝色、绿色四色乳胶微球溶液，用80Hz超声波处理5min后，用超纯水调节浓度为1%，IOOOOgX IOmin离心，取沉淀用25mM，pH6. O MES缓冲液清洗两次备用。分别用预冷的25mM，pH6. O MES缓冲液将EDC和NHS均配置成50mg/ml的溶液备用，按每毫升乳胶加入165 μ IDEC溶液和165 μ I NHS溶液将EDC和NHS加入到洗好的乳胶中。在室温下缓慢混匀30min ；孵育结束后IOOOOgX IOmin离心，取沉淀用等体积的25mM，pH6. O MES缓冲液清洗两次。2、抗体标记。用25mM，pH6. O MES缓冲液将抗体A (鼠抗黄曲霉毒素单克隆抗体)稀释至
O.6mg/ml,抗体B (鼠抗苯并花单克隆抗体)稀释至O. 8mg/ml,抗体C (鼠抗茴香胺单克隆抗体)稀释至1.0mg/ml，抗体D (鼠抗DBS单克隆抗体)稀释至O. 5mg/ml ;分别取上述四种颜色乳胶微球溶液用磁力搅拌器搅拌，在红色溶液中缓慢加入抗体A(每毫升乳胶加入O. 33ml抗体)使抗体终浓度为O. 6mg/ml，在黄色溶液中缓慢加入抗体B(每毫升乳胶加入O. 33ml抗体)使抗体终浓度为O. 8mg/ml，在蓝色溶液中缓慢加入抗体C (每毫升乳胶加入O. 33ml抗体)使抗体终浓度为O. 8mg/ml，在绿色溶液中缓慢加入抗体D (每毫升乳胶加入O. 33ml抗体)使抗体终浓度为O. 4mg/ml ;室温轻柔搅拌2h后用O. IM pH7. O PBS 4次离心洗涤，每次分别用IOOOOgX IOmin离心；沉淀用PBS-TBN溶解，80Hz超声波5min处理后，加入PBS-TBN使达到标记前体积，置4°C保存备用。实施例二彩色胶乳微球免疫层析检测试纸条的性能评价。I、试纸条最低检出限的测定。
室温条件下，将黄曲霉毒素BI标准品、苯并芘标准品、茴香胺标准品和DBS标准品分别配成系列浓度(l_243ng/ml)的溶液，取100 μ I加入酶标板微孔中，用地沟油彩色胶乳微球免疫层析检测试纸条进行依次分析，重复3次；通过肉眼观察，检测条检测线颜色明显浅于阴性对照条检测线颜色时的最小标准品浓度，即为该试纸条的肉眼判定检测限；其中黄曲霉毒素检测限为7ppb,苯并花检测限为9ppb,茴香胺检测限为9ppb, DBS检测限为5ppb。结果如表一所示+表示微显色，++表示显色，+++表示显著显色，一表示不显色。
权利要求
1.一种地沟油快速检测试纸的制备方法，其特征在于包括如下步骤 A)免疫彩色乳胶微球的制备(a)彩色乳胶微球的预处理分别取红色、黄色、蓝色、绿色四色乳胶微球溶液，用超声波处理后，用超纯水调节浓度，离心，取沉淀用MES缓冲液清洗两次，得到洗好的乳胶，用预冷的MES缓冲液分别将EDC和NHS配置成溶液加入到所述洗好的乳胶中，在室温下缓慢混匀，孵育结束后离心，取沉淀用MES缓冲液清洗两次，得到乳胶微球溶液；(b)抗体标记用MES缓冲液将鼠抗黄曲霉毒素单克隆抗体、鼠抗苯并芘单克隆抗体、鼠抗茴香胺单克隆抗体和鼠抗DBS单克隆抗体稀释，之后分别缓慢加入到用磁力搅拌器搅拌的红色、黄色、蓝色和绿色的所述乳胶微球溶液中，室温轻柔搅拌后用PBS离心洗涤，沉淀用PBS-TBN溶解，超声波处理后，加入PBS-TBN至标记前体积，置4°C保存备用； B)免疫彩色胶乳反应垫的制备将玻璃纤维膜浸泡于反应垫处理液中，水浴处理后平铺于纱网上干燥3 4h，将标记后的彩色乳胶微球按照效价实验匹配的结果，以体积比为红黄蓝绿=2 2 4 5混合均匀，按照每毫升乳胶溶液铺50cm2涂覆玻璃纤维膜，干燥16h后置4°C密封保存备用； ONC膜的制备将抗原黄曲霉毒素-0VA，苯并芘-0VA，茴香胺-OVA和DBS-OVA用包被缓冲液分别稀释至O. 3、0. 4、0. 4和O. 2mg/ml，用喷膜仪按I. O、O. 8、O. 8和I. 5 μ I /cm分别喷涂于同一条NC膜上的不同区域作为检测线，每条检测线相距4-10mm，将浓度为2. Omg/ml的兔抗鼠IgG用喷膜仪按O. 5 μ 1/cm喷涂于质控区作为质控线，用封闭液封闭NC反应膜，再用PBST洗脱，然后室温晾干备用； D)彩色胶乳试纸条的的组装将样品垫放入处理液中处理后干燥备用，将干燥后的样品垫、反应垫、NC反应膜和吸水滤纸按顺序装配在PVC底板上,用带mark胶带绕背板覆盖在样品垫、反应垫及吸水滤纸上，然后用切条机切割成2-10mm宽的试纸条，制成地沟油彩色胶乳微球免疫层析检测试纸条。
2.根据权利要求I所述的一种地沟油快速检测试纸的制备方法，其特征在于步骤A)中所述乳胶微球的直径为lOOnm，变异系数< 10%。
3.根据权利要求I所述的一种地沟油快速检测试纸的制备方法，其特征在于步骤A)中所述超声波的频率为80Hz。
4.根据权利要求I所述的一种地沟油快速检测试纸的制备方法，其特征在于步骤B)中所述水浴的温度为37°C，处理时间为30min。
5.根据权利要求I所述的一种地沟油快速检测试纸的制备方法，其特征在于步骤D)中所述地沟油彩色胶乳微球免疫层析检测试纸条各组分的尺寸为吸水滤纸2. 5cm, NC膜.3.5cm,反应垫Icm,样品垫3cm, PVC底板9cm。
全文摘要
本发明提供一种地沟油快速检测试纸的制备方法，包括如下步骤A)免疫彩色乳胶微球的制备；B)免疫彩色胶乳反应垫的制备；C)NC膜的制备；D)彩色胶乳试纸条的的组装。利用本发明制备的地沟油检测试纸检测灵敏度高，可以同时检测多个指标，为地沟油检测提供更全面、系统的检测方法，相对缩小检测成本；该检测试纸在常温下可保质两年，有效延长保质期并降低保存条件；非专业人士用该检测试纸即可完成全程检测，操作简单，有利于该法的推广和普及；整个检测过程最快可以在10min内完成，更适合于现场快速筛选。
文档编号G01N33/577GK102928600SQ20121044031
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月7日 优先权日2012年11月7日
发明者李攀, 谈宇清 申请人:深圳市宝凯仑科技有限公司
专业数控铣床产品供应商
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