用于进行结合测定的设备和方法【专利摘要】本文公开了用于进行结合测定的组合物、方法、设备和试剂盒。具体而言，本发明提供了用于插入到多孔装置的孔中的插入物、插入物阵列和包含它们的试剂盒。本文还提供了使用本文公开的各种设备、装置和试剂盒进行结合测定的方法。【专利说明】用于进行结合测定的设备和方法夺叉引用[0001]本申请要求提交于2012年5月25日的美国临时申请第61/652,102号的权益，该申请通过引用并入于此。【
背景技术：
】[0002]结合测定在生物和临床应用中得到广泛使用，用于检测和测量样品中存在的分析物的量。结合测定一般要求使用与感兴趣的分析物结合的结合配偶体和与该结合配偶体结合的检测试剂。在直接结合测定中，结合配偶体偶联至检测试剂，而间接结合测定涉及添加与结合配偶体相互作用的单独的检测试剂。一种广泛使用的结合测定形式为连接免疫吸附测定（LISA)，其中结合剂固定在固相上。通常，免疫吸附测定涉及通过将感兴趣的分析物与结合剂相结合而将该分析物捕捉到固相上。对能够与分析物结合的检测试剂的添加继而导致检测试剂到固相上的后续捕捉。通常在指示出感兴趣的分析物的存在或量的试剂的检测之前，在一系列一个或多个洗涤步骤中移除未结合的检测试剂。试剂的检测可以利用酶促反应（ELISA)或荧光检测（FLISA)。[0003]ELISA和FLISA通常在用于高通量筛选用途的多孔板（诸如96孔反应板）中进行。使用多孔板和装置使得能够进行对多个样品的并行处理，以供对一种或多种分析物的分析。例如，通常利用ELISA和FLISA来进行杂交瘤细胞系的抗体筛选。这些筛选测定一般涉及杂交瘤细胞培养基样品在用感兴趣的抗原包被的96孔板中的温育。在温育之后，必须在感兴趣的抗体的检测和阳性杂交瘤细胞系的鉴定之前进行涉及与二级和/或三级检测试剂的另外温育和洗涤步骤的多步过程。然而，这些多步测定是费时的，这限制了检测通量。减少这些检测所需的步骤并从而减少所需时间量的装置和方法将会大大提高检测通量和效率。【
发明内容】[0004]因此，本发明提供将会允许具有更高通量和效率的更强健的结合测定的设备和方法。本文提供的是提供此类优点和相关益处的组合物、方法、设备和试剂盒。在一方面，本发明提供了用于插入到多孔装置的孔中的插入物。在一些实施方式中，所述插入物包含基本上不含微孔的内表面和外表面；其中所述内表面和/或外表面在其上固定有结合剂；其中所述插入物的尺寸设置为小于所述孔，使得所述插入物可以插入到所述孔中。[0005]在另一实施方式中，所述插入物包含内表面和外表面，其中所述内表面和/或外表面在其上固定有结合剂，其中所述外表面具有的直径小于所述孔的直径，使得所述插入物可以插入到所述孔中；其中所述插入物向多孔装置的孔中的插入使得所述孔与所述装置的相邻孔在光学上隔离。[0006]在实施本发明的过程中，任何所述插入物可由不透明的材料制成，它们可以为圆柱形、中空的，或者可以包含多个空腔。[0007]在相关方面，本发明提供了用于插入到多孔装置的多个孔中的插入物阵列。在一些实施方式中，所述阵列被配置成使得每个单独的插入物被安装在连续的固体框架上，所述框架的尺寸设置为允许同时向所述多个孔的每个单独的孔中插入和任选地移除每个单独的插入物，其中所述单独的插入物包含内表面和外表面，该内表面和外表面中的任一个或两个在其上固定有结合剂，其中该内表面和/或外表面基本上不含微孔。[0008]在备选的实施方式中，所述阵列被配置成使得每个单独的插入物被安装在连续的固体框架上，所述框架的尺寸设置为允许同时向所述多个孔的每个单独的孔中插入和任选地移除每个单独的插入物，其中所述单独的插入物包含内表面和外表面，该内表面和外表面中的任一个或两个在其上固定有结合剂，其中所述单独的插入物向所述单独的孔中的插入使得所述孔与所述装置上的其他相邻孔在光学上隔离。[0009]在实施本发明的过程中，任何所述阵列可被塑造成使得所述框架的尺寸设置为允许同时向所述多孔装置的每个单独的孔中插入和移除所述每个单独的插入物。[0010]在一些实施方式中，本发明的插入物或阵列的结合剂包括蛋白质、抗体、单克隆抗体、抗原、配体、受体、亲和素、生物素、链霉亲和素或半抗原。[0011]在相关实施方式中，本发明提供了具有多个孔的多孔装置，所述多个孔中的至少一个包含本文所述的插入物，或者所述多个孔包含本文所述的插入物阵列。在进一步的实施方式中，所述多孔装置具有6、12、24、48、96、384、1536或3456个孔。[0012]相应地，本发明还提供了测量孔中液体样品中存在的分析物的方法。在一些实施方式中，所述方法包括向含有液体样品的孔中加入包含可检测标记的经标记的示踪物以形成混合物，其中所述孔中包含本发明的插入物；使所述分析物和所述结合剂竞争所述示踪物的结合一段充足的时间，以实现复合物的形成，该复合物包含在混合物中的该示踪物以及该分析物或该结合剂中之一，其中所述竞争导致第一量的所述可检测标记保留在所述混合物中而第二量的所述可检测标记被隔离（sequestered)到所述插入物的内表面和/或外表面上；以及测量所述孔中保留在所述混合物中的所述可检测标记的所述第一量，其中所述第一量与存在于该混合物中的所述分析物的量成比例。[0013]在其他实施方式中，所述方法包括向含有液体样品的孔中加入经标记的示踪物以形成混合物，其中所述孔中包含本发明的插入物；使得在所述插入物的内表面和/或外表面上形成复合物，其中该复合物包含（1)与所述分析物上的第一结合位点结合的经标记的示踪物，和（2)与同一分析物上的第二结合位点结合的结合剂，其中所述形成导致第一量的所述可检测标记保留在所述混合物中而第二量的所述可检测标记被隔离到所述插入物的内表面和/或外表面上；以及测量所述孔中保留在所述混合物中的所述可检测标记的所述第一量，其中所述第一量与存在于该混合物中的所述分析物的量成反比。[0014]在其他实施方式中，所述方法包括向含有液体样品的孔中加入包含可检测标记的经标记的示踪物以形成混合物，其中所述孔中包含本发明的插入物；使所述分析物和所述结合剂竞争所述示踪物的结合一段充足的时间，以实现复合物的形成，该复合物包含在混合物中的该示踪物以及该分析物或该结合剂中之一，其中所述竞争导致第一量的所述可检测标记保留在所述混合物中而第二量的所述可检测标记被隔离到所述插入物的内表面和/或外表面上；以及测量被隔离到所述插入物的内表面和/或外表面上的所述可检测标记的所述第二量，其中所述第二量与存在于该混合物中的所述分析物的量成反比。[0015]在其他实施方式中，所述方法包括向含有液体样品的孔中加入包含可检测标记的经标记的示踪物以形成混合物，其中所述孔中包含本发明的插入物；使得在所述插入物的内表面和/或外表面上形成复合物，其中该复合物包含（1)与所述分析物上的第一结合位点结合的经标记的示踪物，和（2)与同一分析物上的第二结合位点结合的结合剂，所述形成导致第一量的所述可检测标记保留在所述混合物中而第二量的所述可检测标记被隔离到所述插入物的内表面和/或外表面上；以及测量被隔离到所述插入物的内表面和/或外表面上的所述可检测标记的所述第二量，其中所述第二量与存在于该混合物中的所述分析物的量成比例。[0016]在相关实施方式中，本发明提供了在多孔装置中在分析物和包含可检测标记的经标记的示踪物的混合物中进行结合测定的方法，该方法包括：向本发明的阵列的多个插入物上添加所述经标记的示踪物；使所述分析物和所述结合剂竞争所述示踪物的结合一段充足的时间，以实现复合物的形成，该复合物包含在混合物中的该示踪物以及该分析物或该结合剂中之一，其中所述竞争导致第一量的所述可检测标记保留在所述混合物中而第二量的所述可检测标记被隔离到所述插入物的内表面和/或外表面上；以及测量所述多个孔中保留在所述混合物中的所述可检测标记的所述第一量，其中所述第一量与存在于该混合物中的所述分析物的量成比例。[0017]在备选的实施方式中，本发明提供了在多孔装置中在分析物和包含可检测标记的经标记的示踪物的混合物中进行结合测定的方法，该方法包括：向本发明的阵列的多个插入物上添加所述经标记的示踪物；使得在所述插入物的内表面和/或外表面上形成复合物，其中该复合物包含（1)与所述分析物上的第一结合位点结合的经标记的示踪物，和（2)与同一分析物上的第二结合位点结合的结合剂，所述形成导致第一量的所述可检测标记保留在所述混合物中而第二量的所述可检测标记被隔离到所述插入物的内表面和/或外表面上；以及测量所述多个孔中保留在所述混合物中的所述可检测标记的所述第一量，其中所述第一量与存在于该混合物中的所述分析物的量成反比。[0018]在另一实施方式中，本发明提供了鉴定表达分泌的异源多肽的细胞的方法，该方法包括：提供包含多个孔的多孔装置，其中所述多个孔中的每个孔中插有本发明的插入物，并且其中所述多个孔中的每个孔包含细胞培养基，在该细胞培养基中已培养有被怀疑表达所述多肽的细胞；向所述包含细胞培养基的多个孔中加入包含可检测标记的经标记的示踪物以形成混合物；使所述多肽和所述结合剂竞争所述示踪物的结合一段充足的时间，以实现复合物的形成，该复合物包含在混合物中的该示踪物以及该多肽或该结合剂中之一，其中所述竞争导致第一量的所述可检测标记保留在所述培养基中而第二量的所述可检测标记被隔离到所述插入物的内表面和/或外表面上；以及测量所述孔中保留在所述混合物中的所述可检测标记的所述第一量，其中所述第一量与存在于所述细胞培养基中的所述多肽的量成比例，由此鉴定表达分泌的异源多肽的细胞。[0019]在备选的实施方式中，本发明提供了鉴定表达分泌的异源多肽的细胞的方法，该方法包括：提供包含多个孔的多孔装置，其中所述多个孔中的每个孔中插有本发明的插入物，并且其中所述多个孔中的每个孔包含细胞培养基，在该细胞培养基中已培养有被怀疑表达所述多肽的细胞；向所述包含细胞培养基的多个孔中加入包含可检测标记的经标记的示踪物以形成混合物；使得在所述插入物的内表面和/或外表面上形成复合物，其中该复合物包含（1)与所述多肽上的第一结合位点结合的经标记的示踪物，和（2)与同一多肽上的第二结合位点结合的结合剂，所述形成导致第一量的所述可检测标记保留在所述培养基中而第二量的所述可检测标记被隔离到所述插入物的内表面和/或外表面上；以及测量所述孔中保留在所述培养基中的所述可检测标记的所述第一量，其中所述第一量与存在于该培养基中的所述多肽的量成反比；由此鉴定表达所述异源多肽的细胞。[0020]在实施本发明的任何方法的过程中存在多个实施方式。在实施本文所述任何方法的过程中，保留在所述混合物中的所述可检测标记的所述第一量可以在不将所述混合物转移到孔外或调节所述混合物的内容物的情况下进行测量，或者可以在从所述孔中移除插入物后进行测量，或者可以通过将光引向所述孔中的观察体积来测量，其中所述观察体积基本上被所述第一量的所述可检测标记所占据，但基本上不含所述第二量的所述可检测标记。[0021]在实施本发明任何方法的过程中，所述可检测标记可以是放射性探针、光学可检测的标记或荧光染料。在本发明的任何方法的进一步实施方式中，所述分析物是分泌的蛋白质。[0022]在另一方面，本发明提供了用于测量孔中液体样品中存在的分析物的设备，该设备包含：多孔装置，其包含（i)其中插入一个或多个本发明的插入物的一个或多个孔，其中所述孔包含含有经标记的示踪物的混合物，该经标记的示踪物包含可检测标记；读板仪，其能够（i)从所述一个或多个孔检测所述标记。当期望时，所述读板仪包含被编程为产生与所述检测的标记相对应的信号的处理器。在一些实施方式中，所述读板仪可操作地连接到计算机，该计算机被配置成（i)从所述读板仪接收所述信号；并（ii)从所述信号生成定量测量数据；以及任选地（iii)将所述定量测量数据中继到云服务器。在一些实施方式中，所述读板仪能够被配置成从基本不含所述一个或多个插入物的限制的体积中检测所述标记。在一些实施方式中，所述读板仪能够检测放射性标记、光学可检测的标记、包含荧光染料的标记，或者发光标记。[0023]在另一方面，本发明提供了用于测量多孔装置的一个或多个孔中的液体样品中存在的分析物的试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒包含一个或多个本发明的插入物；以及关于使用所述一个或多个插入物进行结合测定以测量所述分析物的说明书。在一些实施方式中，所述试剂盒进一步包含含有可检测标记的经标记的示踪物。在一些实施方式中，所述经标记的示踪物能够与所述分析物或所述结合剂形成复合物。在其他实施方式中，所述结合剂能够与所述分析物在第一结合位点形成复合物。在其他实施方式中，所述经标记的示踪物能够与所述分析物在第二结合位点形成复合物。援引并入[0024]本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入于此，程度犹如具体地和单独地指定要通过引用而并入每个单独的出版物、专利或专利申请。【专利附图】【附图说明】[0025]本发明的新颖特征在随附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对其中利用到本发明原理的示例说明性实施方式加以详细阐述和附图，将会对本发明的特征和优点获得更好的理解，在附图中：[0026]图IA和图IB描绘了成形为包括多个空腔的插入物的示例性实施方式的示意图。[0027]图2描绘了位于多孔板的孔中的插入物的示例性实施方式的示意图，图中示出向板和孔中的自顶向下示图。[0028]图3A描绘了利用本发明的插入物的示例性直接竞争性结合测定的示意图。[0029]图3B描绘了利用本发明的插入物的直接竞争性结合测定的备选的实施方式的示意图。[0030]图4A描绘了利用本发明的插入物的示例性夹心结合测定的示意图。[0031]图4B描绘了利用本发明的插入物的夹心结合测定的备选的实施方式的示意图。[0032]图5描绘了用于进行结合测定的示例性设备。[0033]图6描绘了位于96孔多孔板中的本发明插入物的示例性实施方式的照片。[0034]图7描绘了利用本发明的插入物的竞争性结合测定的结果。图中描绘了荧光强度测量值相对于人γ球蛋白浓度的曲线图，对利用本发明插入物的孔与无插入物的孔作出比较。[0035]图8描绘了利用本发明的插入物的夹心结合测定的结果。图中描绘了荧光强度测量值相对于人γ球蛋白浓度的曲线图。【具体实施方式】[0036]总体上，本发明提供了用于在多孔装置中进行结合测定以供检测感兴趣的分析物的组合物、方法和试剂盒。插入物[0037]在一个方面，本发明提供了可插入至多孔装置的孔中的插入物。在本发明的一些实施方式中，插入物的尺寸设置为允许插入多孔装置的孔中并任选地从其中移除。在具体的实施方式中，插入物包含尺寸设置为小于允许插入和移除的孔而不使该孔变形或破裂的外表面。在更具体的实施方式中，插入物的外表面的尺寸为孔的尺寸的约99.9%或更小、约99.5%或更小、约99%或更小、约95%或更小、约90%或更小、约85%或更小、约80%或更小、约75%或更小、约70%或更小、约65%或更小、约60%或更小、约55%或更小、或约50%或更小。在其他更具体的实施方式中，插入物的外表面的尺寸为孔的尺寸的约50%-60%、55%-75%、60%-90%、75%-95%或80%-99.9%。[0038]在另一个实施方式中，插入物成形为具有底部以及另外的上唇部，该底部具有尺寸设置为小于孔以允许插入物的底部插入至孔中的外表面，该上唇部具有大于孔的尺寸的外尺寸以允许插入物位于孔内而不接触孔的底表面。在具体的实施方式中，插入物的底部具有尺寸为孔的尺寸的约99.9%或更小、约99.5%或更小、约99%或更小、约95%或更小、约90%或更小、约85%或更小、约80%或更小、约75%或更小、约70%或更小、约65%或更小、约60%或更小、约55%或更小、或约50%或更小的外表面。在其他更具体的实施方式中，插入物的底部的外表面具有为孔的尺寸的约50%-60%、55%-75%、60%-90%、75%-95%或80%-99.9%的尺寸。在一些实施方式中，插入物的上唇部具有为孔的直径的约100.1%或更高、约100.5%或更高、约101%或更高、约102%或更高、约103%或更高、约104%或更高、约105%或更高、约110%或更高、约115%或更高、约120%或更高、约125%或更高、约130%或更高、约135%或更高、约140%或更高、约145%或更高或约150%的外尺寸。在具体的实施方式中，插入物的上唇部具有为孔的直径的约100.1-110%、约101%-120%、约105%-130%、约110%-150%的尺寸。优选地，插入物的上唇部的尺寸设置为允许多个插入物位于相邻的孔内而这些插入物的上唇部基本不重叠。[0039]在一些实施方式中，插入物具有包含内表面和外表面的中空的形状，该内表面和外表面为将在液体溶液中进行的结合测定提供足够的容积，并允许光从多孔装置的孔中垂直地不受阻碍地通过到达检测器。在一些实施方式中，插入物的内表面具有为插入物的外表面尺寸的约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%、约99.5%、约99.9%的尺寸。插入物可采取多种形状，包括但不限于圆柱形、正方形、椭圆形、卵形和多面体。在一些实施方式中，多面体形状可具有3、4、5、6、7或8个或更多个侧面。在一些实施方式中，多面体形状为三角形、正方形、矩形、五边形、六面体、七面体、八面体、十二面体。[0040]在一些实施方式中，插入物成形为提供多个空腔。对于本发明而言，术语"空腔"指中空结构的内部空间。空腔可布置成多种构型。例如，插入物内的空腔可被线性壁分割以形成分离但相邻的隔室，或者被圆形壁分割以形成内部和外部环隔室。图IA和IB示出了具有多个空腔的示例性插入物的横截面。[0041]在一些实施方式中，插入物可插入至多孔装置的孔中并任选地从其中移除。多孔装置是本领域公知的，并且应当理解，插入物可配置用于插入至任何多孔装置中并从其中移除。然而，仅为了描述的目的，本文提供了可与本发明的插入物一起使用的多孔装置配置的实例。在一些实施方式中，多孔装置为多孔板，例如组织培养板或多孔测定板。在一些实施方式中，多孔装置包含6个孔、12个孔、24个孔、48个孔、96个孔、384个孔、1536个孔或3456个孔。需要时，每个板的各个孔可具有均一的尺寸。在备选的实施方式中，插入物可成形为用于插入至用于进行结合测定的其他装置（如单个小杯）中并任选地从其中移除。插入物的材料：[0042]术语"微孔"通常指在亚毫米范围内的孔洞。通常，用于多孔装置中的多孔或微孔插入物可在加入或移除液体时促进孔中不需要的气泡的形成，并因此可能对在该孔中进行的结合测定产生有害的影响。例如，这些气泡可干扰结合测定或提供某种阻碍经标记的结合剂的后续检测的光学干涉。在本发明的一些实施方式中，本发明的插入物基本上不含微孔。在一些实施方式中，插入物基本上不含直径在亚毫米范围内的微孔。在一些实施方式中，插入物基本上不含直径为约100微米或更小、90微米或更小、80微米或更小、70微米或更小、60微米或更小、50微米或更小、40微米或更小、30微米或更小、20微米或更小、10微米或更小、5微米或更小或1微米或更小的微孔。[0043]在具体的实施方式中，插入物基本上不含直径在约0.001-30微米范围内的微孔。在其他具体的实施方式中，插入物基本上不含直径在约〇.02-20微米范围内的微孔。在其他实施方式中，插入物基本上不含直径在约〇.5-10微米范围内的微孔。[0044]通常，基本上不含微孔的插入物由非微孔材料制成。非微孔材料对于本领域技术人员是公知的，并且应理解，任何非微孔材料均可用于制备本发明的插入物。非微孔材料的非限制性实例包括塑料聚合物、玻璃、纤维素或硝化纤维素、金属和半导电材料，诸如，例如，硅或锗。可用于制备本发明的插入物的塑料聚合物的非限制性实例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚氨酯、聚二甲基硅氧烷、聚氯乙烯、聚砜、聚甲基丙烯酸甲酯、聚酰亚胺、聚酰胺、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚丁烯、聚己内酰胺、聚三氟氯乙烯、聚乙烯聚四氟乙烯、聚对苯二甲酸二乙醋（polyethyleneterephathalate)、聚偏二氯乙稀、聚异丁稀、聚稀径、聚合的聚异氰酸醋（polymericpolyisocyanate)、聚氟乙稀。可用于制备插入物的非多孔材料的其他非限制性实例包括丙稀腈-丙稀酸剂-苯乙�。╝crylonitrile-acryloid-styrene)、丙稀腈-氯化乙稀-苯乙稀和丙稀腈-丁二稀-苯乙稀。在一些情况下，用于制备插入物的材料可被改性以包含交联或其他用于固定结合剂的连接体部分。在一个具体的实施方式中，插入物由购自Graingers(目录号2vdn6和2vdp4)的外径为6mm且内径为4mm的塑料管制成。[0045]多孔装置中结合测定的分析通常涉及对来自多个或相邻孔的信号（例如，光）的检测。阻止孔之间的串扰将会改善结合测定测量的精确度。在本发明的一些实施方式中，插入物基本上阻止光通过插入物材料的透射。在一些实施方式中，插入物基本上阻止可见光的透射。在其他实施方式中，插入物基本上阻止紫外线的透射。在其他实施方式中，插入物基本上阻止红外线的透射。在更具体的实施方式中，插入物基本上阻止可见光、紫外线和红外线的透射。需要时，在一些实施方式中，插入物是不透明的。[0046]在一些实施方式中，由于将一种或多种色素引入插入物材料中，因此插入物是不透明的。可通过将色素附着至插入物的任何已知的方法将一种或多种色素引入插入物材料中。色素的附着可为通过共价键、非共价相互作用，或者通过将一种或多种色素沉积到插入物的内表面和/或外表面上。在一些实施方式中，所述色素为染料。不透明的色素和染料是本领域技术人员已知的，可通过多个供应商商购获得，诸如，例如，由Epolin，Inc.提供的Epolight7276FVisibleOpaqeDye。常用的色素的其他非限制性实例包括提供白色色素沉着的二氧化钛，以及提供黑色色素沉着的碳黑、炭黑、乌木、象牙黑和缟玛瑙（onyx)。插入物的阵列[0047]多孔装置通常用于对单个样品进行的多个结合测定、或对多个样品进行的单个结合测定、或对多个样品进行的多个测定的平行处理。在另一方面，本发明提供了本文所述的插入物的阵列，其可向多孔装置的多个孔中同时插入并任选地从其中移除。在一些实施方式中，将阵列中的每个单独的插入物安装至连续的固体框架上。在一些实施方式中，该框架为具有与多孔装置的外尺寸基本相同的外尺寸的、基本上是平的框架。在一些实施方式中，该框架包含尺寸设置为基本上与多孔装置的孔的尺寸匹配的均匀的孔洞。在一些情况下，当框架正好位于多孔装置的顶部时，该框架的均匀的孔洞与该装置的孔对准。在一些情况下，插入物的尺寸设置为稳定地适配于框架的孔洞中。例如，单独的插入物将具有尺寸设置为适配通过框架的孔并插入至多孔装置的孔中的底部，并且还将具有尺寸设置为大于框架的孔洞的尺寸以使插入物能够位于框架内的上唇部。在这种示例性的配置中，各个单独的插入物可同时插入至孔中，并任选地从孔中移除。在一些情况下，插入物牢固地附接至框架，以使插入物和框架作为可插入至多孔装置并任选地从其中移除的一个单元起作用。分析物[0048]在本发明的另一个方面，插入物具有固定于其上用于液体样品中分析物的检测的结合剂。该分析物可以是，但不限于蛋白质、糖蛋白、多肽（包括其片段）、多糖、脂质、核酸、生物颗粒、细胞区室、细胞、合金金属或其他元件，或它们的任意组合。分析物还可以是，例如，药物、前药、药剂、药物代谢物、生物标志物（例如，表达的蛋白质或细胞标志物、抗体或抗体片段、血清蛋白质、细胞表面受体、受体配体或其功能性基序）。在一些实施方式中，分析物为分泌的蛋白质。分泌的蛋白质的非限制性实例包括激素、生长因子、神经递质、抗体、分泌的酶、分泌的毒素或任何包含将蛋白质靶向至内质网的信号序列的分泌的蛋白质。激素的非限制性实例包括褪黑激素、甲状腺激素、肾上腺素、缪勒氏管抑制激素（antimullerianhormone)、脂联素、促肾上腺皮质激素、血管紧张素、抗利尿激素（加压素）、心房钠尿肽（atrial-natriureticpeptide)、降妈素、缩胆囊素、促肾上腺皮质激素释放激素（cortocotropin-releasinghormone)、促红细胞生成素、促卵泡激素、胃泌素、生长素释放肽（ghrelin)、胰高血糖素、促性腺激素释放激素、生长激素、人绒毛膜促性腺激素、生长激素、人胎盘催乳素、抑制素、胰岛素、胰岛素样生长因子、瘦素、黄体生成素(leutenizinghormone)、黑素细胞刺激激素、食欲肽（orexin)、催产素、甲状旁腺激素、催乳素、松弛素、促胰液素（secretin)、促生长素抑制素、血小板生成素、促甲状腺激素、促甲状腺激素释放激素、皮质醇、醛固酮、睾酮、脱氢表雄酮、双氢睾酮、雌激素、孕酮、前列腺素、白三烯、内皮素、肾素。生长因子的非限制性实例包括脑源性神经营养因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胶质细胞系源性神经营养因子、肝细胞生长因子、神经生长因子、血小板源性生长因子、转化生长因子α或β、肿瘤坏死因子α、血管内皮生长因子、胎盘生长因子、白细胞介素1-7等。分泌的酶的非限制性实施包括消化酶，如蛋白酶、肽酶、脂肪酶、糖酶、核酸酶、I型分泌的蛋白质、II型分泌的蛋白质、III型分泌的蛋白质、IV型分泌的蛋白质、V型分泌的蛋白质、VI型分泌的蛋白质、植物分泌的蛋白质等。分泌的毒素的非限制性实例包括耐热肠毒素（heat-stableenterotoxin)、溶血素、胆固醇依赖型溶细胞素、RTX毒素、白喉毒素、霍乱毒素、百日咳毒素、透明质酸酶、胶原酶等。在具体的实施方式中，分泌的蛋白质是分泌的抗体。在更具体的实施方式中，分泌的抗体是单克隆抗体。结合剂[0049]多种结合剂可用于本发明。结合剂的选择可取决于所测定的分析物。结合剂可以是，但不限于蛋白质、糖蛋白、多肽、蛋白质或肽片段、多糖、脂质、核酸、生物颗粒、细胞区室、细胞或其任意组合。结合剂也可以是，例如，药物、前药、药剂、药物代谢物、生物标志物(例如，表达的蛋白质或细胞标志物、抗体或抗体片段、血清蛋白质、细胞表面受体、受体配体或其功能性基序）、配体、受体或半抗原。在一些情况下，结合剂包含亲和素、生物素或链霉亲和素。在一些实施方式中，结合剂是分泌的蛋白质。本文提供了分泌的蛋白质的非限制性实例。[0050]通常，结合剂的选择将取决于用户的需要和将要采用的结合测定的类型。一种常见的结合测定类型是夹心测定，其中结合剂与分析物结合，而分析物进一步与经标记的示踪物结合。在一些实施方式中，结合剂基于其选择性结合所研宄的分析物的能力而被选择。例如，如果分析物是抗体，则结合剂包含能够与该抗体选择性相互作用的抗原。对于另一个例子，如果分析物是分泌的蛋白质（例如，胰岛素），则结合剂是能够与该分泌的蛋白质结合的抗体（例如，抗胰岛素抗体）。[0051]另一种常见的结合测定类型是竞争性测定，其中结合剂与分析物竞争结合经标记的示踪物。因此，在一些实施方式中，结合剂被选择为包含与分析物具有类似的结合经标记的示踪物的能力的基序、分子、生物颗粒、物质或其他结构。在其他实施方式中，示踪物用作参考来指导比参考化合物更好地结合的化合物的选择。在特定实施方式中，结合剂是与分析物相同的物质。例如，如果分析物是抗体，则抗原包含相同的抗体。在其他实施方式中，结合剂是与分析物不同的物质，但与分析物具有类似的针对经标记的示踪物的结合亲和力。结合剂向插入物上的固定[0052]用于将结合剂固定在固体表面上的方法是本领域技术人员已知的。通常，任何合适的固定方法可以用于将结合剂固定至本发明的插入物上。例如，已知许多技术用于通过共价键、非共价键或吸附将核酸和/或肽固定至固体表面上，或固定至连接体部分，或固定至被固定的部分。这类技术在以下文献中有描述，例如，Beier等人，NucleicAcidsRes.27:1970-1-977(1999)，Joos等人，Anal.Chem.247:96-101(1997)，Guschin等人，Anal.Biochem.250:203-211(1997)，Bhatia等人1998,AnalyticalBiochemistry,178408-13，Tedeschi等人2003,BiosensorsandBioelectronics，（19)85-93，MethodsMol.Biol.Vol.20(1993)，Tischer和Wedekind.,TopicsinCurrentChemistry200:95-126(1999)，所有这些文献均通过引用并入本文。[0053]在一些实施方式中，通过交联剂将结合剂固定到插入物上。在一些实施方式中，该交联剂是具有至少两个反应性末端以将结合剂连接至固体支持材料上的分子。通常，适当的交联剂的选择通过将交联剂的反应性末端与固体支持材料的官能团并且与结合剂的官能团进行匹配来获知。在一些情况下，交联剂包含对蛋白质上共同的官能团具有特异性的反应性基团，例如，羧基、胺、巯基或羟基。这些反应性基团可用来将蛋白质性结合剂交联至固体支持物，例如本发明的插入物。交联剂反应性基团的非限制性实例包括η-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS酯）、亚氨酸酯、马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、五氟苯基酯、羟甲基膦、硫代磺酸酯、乙烯基磺酸酯、酰肼、烷氧基胺、芳基叠氮化物、异氰酸酯、二琥珀酰亚胺基辛二酸醋和双B丫丙啶（diazirines)。[0054]在其他实施方式中，如果结合剂是糖蛋白，则可以使用为了固定目的利用碳水化合物基团将糖蛋白（即，包含碳水化合物侧链的蛋白质）固定到插入物上的方法。例如，凝集素在本领域中是已知的，并用来将碳水化合物基团固定到固体支持物上。在一个实施方式中，插入物由凝集素修饰的非微孔性材料制成，用于糖蛋白结合剂的固定。[0055]在另外其他的实施方式中，结合剂包含亲和结合标签。亲和标签的非限制性实例包括IgG结合域、组氨酸标签、精氨酸标签、纤维素结合域、链霉亲和素、链霉亲和素结合域、生物素、谷胱甘肽-S-转移酶（GST)标签等等。[0056]在其他实施方式中，通过将插入物与包被缓冲液和结合剂一起温育而将结合剂固定到插入物上。在结合剂包含交联剂或亲和结合标签的一些情况下，包被缓冲液包含对该交联剂或结合标签具有亲和力的试剂。例如，如果亲和结合标签包含GST，则包被缓冲液中的试剂包含GST结合试剂，例如，抗-GST抗体或谷胱甘肽。在亲和结合标签包含链霉亲和素的一些情况下，包被缓冲液中的试剂是生物素。在亲和结合标签是组氨酸标签的其他情况下，包被缓冲液中的试剂是与组氨酸相互作用的金属，例如，铜或镍。对于另一个例子，如果结合剂包含交联剂，则包被缓冲液包含与该交联剂结合的试剂。例如，在交联剂包含巯基的一些情况下，包被缓冲液包含与巯基形成稳定的硫酯键的活化的马来酰亚胺。[0057]用于将结合剂固定到固体表面上的非特异性包被缓冲液也是本领域已知的，并且包括，例如，碱性碳酸盐缓冲液、碱性磷酸盐缓冲液或基于tris的碱性缓冲液。在一些实施方式中，包被缓冲液是具有摩尔浓度为约0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M、0.IM或0.2M碳酸钠的碳酸盐缓冲液。在一些实施方式中，该碳酸盐缓冲液是碳酸钠缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液或碳酸氢钠缓冲液。在一些实施方式中，包被缓冲液具有约7.5或更高、约8.O或更高、约8.5或更高或者约9.O或更高的pH。在其他实施方式中，包被缓冲液具有约7.5-9、约8-9.5或约9-10的pH。在特定实施方式中，包被缓冲液是pH约9-10的碳酸钠缓冲液。在其他实施方式中，包被缓冲液是磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水、基于tris的缓冲液或tris-缓冲盐水。包被缓冲液的非限制性实例包括0.2M碳酸氢钠，pH9.4;PBS-50mM磷酸盐，pH0,0·15MNaCl;碳酸盐-碳酸氢盐；含有L7mMNaH2P04、98mMNa2HPO4.7H20、0·1%NaN3的磷酸盐缓冲液，pH8·5;TBS-50mMTRIS，pH8·0,0·15MNaCl。[0058]图2描绘了用于插入到多孔装置（200)的孔中的插入物的特定实施方式的示意图。该插入物可用于进行结合测定。插入物210的尺寸设置为用于插入并任选地从孔（220)中移除，并且进一步在内表面和外表面上已固定有结合剂（230)。液体样品[0059]在本发明的另一方面，利用插入物在含有液体样品的孔中进行结合测定。通常，该液体样品可以是被怀疑含有感兴趣的分析物的任何液体。在一些实施方式中，该液体样品是体液样品，例如，血液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水、房水、玻璃体液、胆汁、乳汁、脑脊髓液、耵聍、内淋巴、外淋巴、精液、女性射出液、胃液、粘液、腹膜液、胸膜液、皮脂、汗液、泪液、阴道分泌物或呕吐物。在其他实施方式中，该液体样品是蛋白质样品或DNA样品。在其他实施方式中，该液体样品是裂解的细胞样品。在特定的实施方式中，该液体样品是被怀疑携带分析物的细胞培养基。经标记的示踪物[0060]进行结合测定的一般方法利用包含可检测标记的经标记的示踪物。对于本发明而言，术语"经标记的示踪物"被定义为能够在结合测定中用于检测分析物的实体，其中示踪物另外包含可检测标记。对标记的检测和测量可用来确定分析物的存在、不存在或量。在结合测定是竞争性测定的一些实施方式中，经标记的示踪物能够与分析物结合或与结合剂结合。在特定实施方式中，经标记的示踪物能够以类似的亲和力与分析物或结合剂结合。仅举例来说，如果分析物和结合剂是特定的抗体，则示踪物包含能够结合该抗体的标记的抗原。举另一个例子，如果分析物和结合剂是特定的抗原，则示踪物包含能够结合该抗原的标记的抗体。[0061]在结合测定是夹心测定的一些实施方式中，如果结合剂能够在第一位点结合分析物，则选择经标记的示踪物以使其能够与分析物在第二位点结合。在其他实施方式中，经标记的示踪物能够与分析物在第二位点结合，并且对结合剂没有或几乎没有亲和力。仅举例来说，如果分析物是抗原，并且结合剂是能够在特定表位处结合该抗原的抗体，则经标记的示踪物是能够在不同的表位处结合该抗原的第二抗体。在任一种情况下，经标记的示踪物均可包含但不限于蛋白质、糖蛋白、多肽、多糖、脂质、核酸或其任意组合。经标记的示踪物还可包含，例如，药物、前药、药剂、药物代谢物、生物标志物（例如，表达的蛋白质或细胞标志物、抗体或抗体片段、血清蛋白质、细胞表面受体、受体配体或其功能性基序）。在一些实施方式中，经标记的示踪物是分泌的蛋白质。在本文中描述了分泌的蛋白质的例子。[0062]在一些实施方式中，经标记的示踪物是偶联至可检测标记的分子。有多种标记可用于本发明，标记的选择取决于所需的灵敏度、偶联的难易程度、稳定性需要、可获得的仪器和检测方法以及处置的提供。[0063]在一些实施方式中，可检测标记包含荧光染料。通常，荧光染料包含吸收第一波长范围的光能并且重新发射第二波长范围内的光的荧光团。在一些实施方式中，该荧光染料是氧杂蒽类衍生物，诸如，例如，荧光素、若丹明、TRITC、X_若丹明、丽丝胺若丹明B、俄勒冈绿或德克萨斯红。在其他实施方式中，该荧光染料是花菁衍生物，诸如，例如，花菁、吲哚羰花菁、氧杂羰花菁、硫杂羰花菁（thiacarbocyanine)或部花青。在另外其他的实施方式中，该荧光染料是萘衍生物，诸如，例如，丹酰或drodan衍生物。在其他实施方式中，该荧光染料是香豆素衍生物。在其他实施方式中，该荧光染料是噁二唑衍生物，诸如，例如，吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑或苯并噁二唑。在其他实施方式中，该荧光染料是噁嗪衍生物，诸如，例如，尼罗红、尼罗蓝或噁嗪170。荧光染料的其他例子包括，例如，CF染料（Biotium-参见，例如，美国专利号8148518、8092784、7803943、7601498、7776567,均通过引用而并入）、BODIPY(Invitrogen)、DyLightFluor(Thermoscientific)、Atto和Tracy(SigmaAldrich)、FluoProbes(Interchim)、DY和MegaStokes染料（Dyomics)、Seatau和Square染料（SETABioMedicals)、Quasar和CalFluor染料（BiosearchTechnologies)、太平洋蓝（PacificBlue)、太平洋橙（PacificOrange)、萤光黄或别藻蓝蛋白。[0064]在另外其他的实施方式中，所述荧光染料包含吲哚鑰环体系，其中吲哚鑰环的3-碳上的取代基包含化学反应性基团或偶联的物质。在更具体的实施方式中，该荧光染料是AlexaFluor染料，诸如，例如，AlexaFluor350、AlexaFluor405、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor610、AlexaFluor633、AlexaFluor635、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor.700、AlexaFluor750或AlexaFluor790〇[0065]在其他实施方式中，可检测标记包含荧光蛋白。荧光蛋白是本领域公知的。荧光蛋白的非限制性实例包括Y66H、Y66F、EGFP、EGFP2、Azurite、GFP、T-Sapphire、Cerulean、CFP、TagCFP、TurboCFP、ECFP、CyPet、Y66W、mKeima-Red、AmCyanl、TFPl、Midori-ishiCyan、GFP、TurboGFP、TagGFP、EGFP、S65C、S65L、Emerald、S65T、AzamiGreen、ZsGreenl、YFP、TagYFP、EYFP、TurboYFP、Topaz、Venus、mCitrine、m0range、RFP、TagRFP、TurboRFP、DsRecUmStrawberry、R-藻红蛋白、B-藻红蛋白、mCherry、Pe;ridininChlorophyll(PerCP)、mPlum、mOrange或mRaspberry。[0066]在其他实施方式中，可检测标记包含发光或化学发光标签。常见的发光/化学发光标签包括但不限于过氧化物酶，如辣根过氧化物酶（HRP)、大豆过氧化物酶（SP)、碱性磷酸酶和萤光素酶。只要给予适当的底物（例如，氧化试剂加化学发光化合物），这些蛋白质标签能够催化化学发光反应。已知许多化合物家族在多种条件下提供化学发光。化学发光化合物家族的非限制性实例包括2,3-二氢-1，4-酞嗪二酮鲁米诺，5-氨基-6,7,8-三甲氧基-和二甲基氨基[ca]苯并类似物。这些化合物在碱性过氧化氢或次氯酸妈和碱的存在下能够发光。化学发光化合物家族的其他实例包括，例如，2,4,5-三苯基咪唑，对二甲基氨基和-甲氧基取代基，草酸酯，如草酰活性酯，对硝基苯基，N-烷基吖啶酯，萤光素，光泽精(Iucigenins)，或吖啶酯。化学发光蛋白质标签的许多底物是本领域公知且可商购获得的，并且应当理解，化学发光反应的任何合适的底物都可以在本发明中使用。[0067]用于将可检测标记偶联或耦合到分子上的方法是本领域技术人员熟知的，并且可用来制备经标记的示踪物。在一些实施方式中，标记通过间接手段连接。在特定实施方式中，标记通过以下步骤连接：（1)配体分子与聚合物共价结合。（2)配体与抗配体分子结合，该抗配体分子可以是本身可检测的，或者可以共价地结合至信号系统。许多配体/抗配体组合是本领域中已知并可获得的，例如，生物素/链霉亲和素、甲状腺素/甲状腺素结合球蛋白、半抗原/抗体或抗原/抗体。信号系统的例子包括，例如，可检测的酶或化学发光化合物。在其他实施方式中，可检测标记与分子的偶联涉及分子克�。纾刈镈NA技术。进行结合测定的方法[0068]在另一方面，本发明提供了使用本文所述的单独的插入物或插入物阵列来测量存在于多孔装置的一个孔或多个孔中的液体样品中的分析物的方法。在一个方面，本发明提供了一种在竞争性结合测定中使用插入物或插入物阵列的方法。图3A提供了使用本发明的插入物或插入物阵列（300)的示例性竞争性结合测定的示意图。在一些实施方式中，该方法包括向包含液体样品320的孔中加入包含可检测标记的经标记的示踪物310。在使用插入物阵列的一些实施方式中，该方法包括向包含多个液体样品320的多个孔中加入包含可检测标记的经标记的示踪物310。在一些实施方式中，液体样品被怀疑含有分析物330，分析物330以浅灰色圆形示出。在一些实施方式中，所述孔包含其上固定有结合剂350的插入物340。在使用插入物阵列的一些实施方式中，所述多个孔包含其上固定有结合剂350的插入物340的阵列。在一些实施方式中，经标记的示踪物能够与分析物结合并且另外能够与结合剂结合。在特定实施方式中，经标记的示踪物能够以类似的亲和力与分析物和结合剂结合。在特定实施方式中，结合剂与分析物是相同类型的分子，因此，经标记的示踪物能够与两者以基本相等的亲和力结合。在更具体的实施方式中，分析物本身不具有对结合剂的显著的结合亲和力。在一些实施方式中，向液体样品中加入经标记的示踪物形成了包含液体样品320、分析物330和经标记的示踪物310的混合物。[0069]在一些实施方式中，所述方法进一步包括将混合物温育足够的一段时间，从而允许分析物和结合剂竞争经标记的示踪物的结合。在一些实施方式中，该温育步骤包括温育约0、0·5、1、1·5、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时或更长。在需要时，该温育步骤包括温育约24小时或更长。该温育步骤也可进行不到约24小时、不到约20小时、不到约16小时、不到约12小时、不到约8小时、不到约4小时、不到约2小时、不到约1.5小时、不到约1小时、不到约0.5小时。在另外其他的实施方式中，该温育步骤包括温育约0.5-2小时、约1-4小时、约2-8小时、约4-12小时、约8-24小时或更长。温育可在任何适合于给定测定的温度，例如约37摄氏度、约室温或约20-25摄氏度下进行。在另外其他的实施方式中，该温育步骤包括在约4摄氏度下温育。在一些实施方式中，该温育步骤包括振荡和/或摇动。在其他实施方式中，该温育步骤不需要振荡或摇动。在特定的实施方式中，该温育步骤包括在进行或不进行振荡和/或摇动的情况下，在约37摄氏度下温育0.5-2小时。在另一个特定的实施方式中，该温育步骤包括在进行或不进行振荡和/或摇动的情况下，在室温（例如，20-25摄氏度）下温育约1-12小时。在另一个特定的实施方式中，该温育步骤包括在进行或不进行振荡和/或摇动的情况下，在约4摄氏度下温育约8-24小时或更长。在一些实施方式中，所述竞争导致形成一个或多个包含经标记的示踪物和分析物的复合物360。在其他实施方式中，所述竞争导致形成一个或多个包含经标记的示踪物和结合剂的复合物370。在另外其他的实施方式中，所述竞争导致形成一个或多个复合物360和一个或多个复合物370。在一些实施方式中，一个或多个复合物370被隔离到或结合到插入物的内表面和/或外表面上，而一个或多个复合物360保留在混合物中。对于本发明而言，短语"保持在混合物中"或"保留在混合物中"是指在混合物中基本保持自由漂浮并且未结合到插入物上。[0070]在一些实施方式中，所述方法进一步包括测量孔中保留在混合物中的可检测标记的量。在一些情况下，保留在混合物中的可检测标记的量与存在于液体样品中的分析物的量成比例。在特定实施方式中，对保留在混合物中的可检测标记的量的测量基本上排除了测量被隔离到或结合到插入物的内表面和/或外表面上的可检测标记的量。在更具体的实施方式中，通过在不含插入物的检测区380中进行测量而排除了测量被隔离到插入物上的标记的量。在另外其他的【具体实施方式】中，通过在测量步骤之前移除插入物而排除了测量被隔离到插入物上的标记的量。[0071]在图3B所示的备选的实施方式301中，所述方法与如上描述的方法基本相同，不同之处在于，该方法并非测量保留在溶液中的可检测标记的量，而是包括通过在包含插入物的检测区390中进行测量而测量孔中被隔离到插入物上的可检测标记的量。在特定的备选的实施方式中，在检测区390中进行测量基本上排除了保留在混合物中的可检测标记的量。在这些备选的实施方式中，被隔离到插入物上的可检测标记的量与存在于液体样品中的分析物的量成反比。在一些实施方式中，在温育步骤后，包含孔的装置在约4摄氏度下储存任意合适的一段时间，之后进行分析物的测量。[0072]在另一方面，本发明提供了在夹心型测定中使用单独的插入物或插入物阵列的方法。图4A提供了使用本发明的插入物或插入物阵列（400)的示例性夹心型结合测定的示意图。在一些实施方式中，该方法包括向包含液体样品420的孔中加入包含可检测标记的经标记的示踪物410。在使用插入物阵列的实施方式中，该方法包括向包含多个液体样品420的多个孔中加入包含可检测标记的经标记的示踪物410。在一些实施方式中，液体样品被怀疑含有分析物430,分析物430以浅灰色新月形示出。在一些实施方式中，所述孔包含其上固定有结合剂450的插入物440。在使用插入物阵列的一些实施方式中，所述多个孔包含其上固定有结合剂450的插入物440的阵列。在一些实施方式中，向液体样品中加入经标记的示踪物形成了包含液体样品420、分析物430和经标记的示踪物410的混合物。在一些实施方式中，经标记的示踪物410能够与分析物430在第一位点结合。在一些实施方式中，结合剂450能够与分析物430在第二位点结合。在特定实施方式中，经标记的示踪物不具有对结合剂450的显著的结合亲和力。在一些实施方式中，向液体样品中加入经标记的示踪物形成了包含液体样品420、分析物430和经标记的示踪物410的混合物。[0073]在一些实施方式中，所述方法进一步包括将混合物温育足够的一段时间，从而允许形成包含经标记的示踪物、分析物和结合剂的复合物，其中经标记的示踪物与分析物在第一位点结合而结合剂与分析物在第二位点结合。本文中描述了温育步骤的各种实施方式。在一些实施方式中，所述温育导致一定量的未复合的经标记的示踪物460保留在混合物中。在其他实施方式中，所述温育导致形成一个或多个复合物470,该复合物470包含经标记的示踪物410、分析物430和结合剂450。在另外其他的实施方式中，所述竞争产生一定量的未复合的经标记的示踪物460和一个或多个复合物470。在一些实施方式中，一个或多个复合物470被隔离到或结合到插入物的内表面和/或外表面上，而未复合的经标记的示踪物460保留在混合物中。[0074]在一些实施方式中，所述方法进一步包括测量孔中保留在混合物中的可检测标记的量。在一些情况下，保留在混合物中的可检测标记的量与存在于液体样品中的分析物的量成反比。在特定实施方式中，对保留在混合物中的可检测标记的量的测量基本上排除了测量被隔离到或结合到插入物的内表面和/或外表面上的可检测标记的量。在更具体的实施方式中，通过在不含插入物的检测区480中进行测量而排除了测量被隔离到插入物上的标记的量。在另外其他的【具体实施方式】中，通过在测量步骤之前移除插入物而排除了测量被隔离到插入物上的标记的量。在图4B所示的备选的实施方式401中，所述方法与以上描述的方法基本相同，不同之处在于，该方法并非测量保留在溶液中的可检测标记的量，而是包括通过在包含插入物的检测区490中进行测量而测量孔中被隔离到插入物上的可检测标记的量。在特定的备选的实施方式中，在检测区490中进行测量基本上排除了保留在混合物中的可检测标记的量。在这些备选的实施方式中，被隔离到插入物上的可检测标记的量与存在于液体样品中的分析物的量成正比。在一些实施方式中，包含孔的装置可以在温育步骤后、在测量前在4摄氏度下储存不定的一段时间。[0075]本文公开的方法特别适合于以线性检测测量大范围的分析物浓度。在一些实施方式中，所述方法可以测量约0-100μg/ml的分析物、约0-90μg/ml的分析物、约0-80μg/ml的分析物、约0-70μg/ml的分析物、约0-60μg/ml的分析物、约0-50μg/ml的分析物、约0-40μg/ml的分析物、约0-30μg/ml的分析物、约0-20μg/ml的分析物、约0-10μg/ml的分析物、约0-5μg/ml的分析物或约0-2.5μg/ml的分析物。[0076]在实施上述方法时，可以调节经标记的示踪物、结合剂和/或分析物的相对量以提高结合测定的效率和/或准确度。在一些实施方式中，相对于结合剂的结合容量调节经标记的示踪物的相对浓度。在特定实施方式中，经标记的示踪物的相对浓度为结合剂的相对结合容量的约100%、约95%、约90%、约85%、约80%、约75%、约70%、约65%、约60%、约55%、约50%、约45%、约40%、约35%、约30%、约25%、约20%、约15%、约10%或约5%。在一些实施方式中，经标记的示踪物的相对浓度为结合剂的相对结合容量的约10-90%、约20-80%、约30-70%、约40%-60%或约45%-55%。在特定的实施方式中，经标记的示踪物的相对浓度为结合剂的相对结合容量的约50%。[0077]在其他实施方式中，相对于分析物的结合容量调节经标记的示踪物的相对浓度。在特定实施方式中，经标记的示踪物的相对浓度为分析物的相对结合容量的约100%、约95%、约90%、约85%、约80%、约75%、约70%、约65%、约60%、约55%、约50%、约45%、约40%、约35%、约30%、约25%、约20%、约15%、约10%或约5%。在一些实施方式中，经标记的示踪物的相对浓度为分析物的相对结合容量的约10-90%、约20-80%、约30-70%、约40%-60%或约45%-55%。在特定的实施方式中，经标记的示踪物的相对浓度为分析物的相对结合容量的约50%。[0078]在另外其他的实施方式中，相对于分析物和结合剂的总结合容量调节经标记的示踪物的相对浓度。在特定实施方式中，经标记的示踪物的相对浓度为分析物和结合剂的总结合容量的约100%、约95%、约90%、约85%、约80%、约75%、约70%、约65%、约60%、约55%、约50%、约45%、约40%、约35%、约30%、约25%、约20%、约15%、约10%或约5%。在一些实施方式中，经标记的示踪物的相对浓度为分析物和结合剂的总结合容量的约10-90%、约20-80%、约30-70%、约40%-60%或约45%-55%。在特定的实施方式中，经标记的示踪物的相对浓度为分析物和结合剂的总结合容量的约50%。检测方法[0079]通常，以上描述的方法包括涉及标记的检测的测量步骤。检测方法是本领域技术人员所熟知的，并且任何合适的检测方法均可用于本发明。本领域技术人员将会理解，检测方法的选择取决于用户的需求和所使用的可检测标记的类型。[0080]在可检测标记是荧光染料或荧光蛋白质的一些实施方式中，测量步骤包括荧光检测方法的使用。荧光检测方法是本领域技术人员所熟知的。在一些实施方式中，荧光检测包括通过用源光照射目标区域来激发荧光染料或蛋白质，该源光的波长范围足以激发染料或蛋白质中的荧光团。源光可以由许多合适的光源提供，该光源包括，例如，激光、激光二极管和高强度灯，如氙弧灯或汞蒸汽灯。源光的波长范围可以使用例如光滤波器或单色仪系统来选择。[0081]通常，荧光团的激发导致响应光的发射。在一些实施方式中，响应光的波长范围比激发波长范围具有更高的波长。在一些实施方式中，荧光检测包括响应光的检测。例如，可以使用数码相机、电荷耦合器件（CCD)、光电倍增管、光电管或CMOS图像传感器来完成检测。[0082]荧光偏振代表一种荧光检测方法，其能够进一步区分结合的或未结合的经标记的示踪物。通常，荧光偏振使用分子的翻滚动作来定量结合事件。例如，如果小荧光染料或蛋白质与大得多的分子结合（例如，在经标记的示踪物与分析物、结合剂，或者结合剂和分析物形成复合物的情况下），则与未结合的小荧光染料或蛋白质（例如，如果经标记的示踪物仍未结合）相比，荧光染料或蛋白质的翻滚速度将会下降。荧光染料或蛋白质分子的翻滚速度可通过用平面偏振光激发荧光团来测定。如果荧光团具有较低的翻滚速度（例如，在经标记的示踪物已与另一种结合配偶体形成复合物的情况下），则发射的响应光将倾向于在同一平面中保持偏振，相反，具有更高翻滚速度的荧光团（例如，在经标记的示踪物仍未结合的情况下）将倾向于在激发步骤中失去偏振，并因此发射相对于激发光平面具有更低偏振的响应光。在特定实施方式中，测量步骤包括荧光偏振方法的使用。在更具体的实施方式中，测量保留在混合物中的可检测标记的量采用荧光偏振方法，该荧光偏振方法使得用户能够区分已与分析物形成复合物的经标记的示踪物以及未结合的经标记的示踪物。[0083]在可检测标记包含发光或化学发光标签的一些实施方式中，测量步骤包括发光检测方法。发光检测方法是本领域技术人员已知的（参见，例如，BiomedicalChromatography17:83-95(2003)，ComplementaryImmunoAssays，Ch.14,1988年版，CanadianJournalofChemistry,1987,65(6):1392-1396)、美国专利RE39047,所有这些均通过引用并入本文）。在一些实施方式中，测量步骤包括加入化学发光化合物和活化剂，其中化学发光标签催化该反应。化学发光化合物是本领域公知的，并且在上述参考文献中描述。在化学发光化合物选自2,3-二氢-1，4-酞嗪二酮鲁米诺，5-氨基-6,7,8_三甲氧基-和二甲基氨基[ca]苯并类似物的一些实施方式中，测量步骤包括加入碱性过氧化氢或次氯酸钙和碱，它们诱导标记发光。在化学发光化合物为2,4,5-三苯基咪唑族或草酸酯族化合物（例如，草酰活性酯）的其他实施方式中，测量步骤包括加入含有氧化试剂的碱性缓冲液，其诱导该化合物发出绿光。在发光标签包含萤光素酶的另外其他的实施方式中，测量步骤包括加入萤光素以诱导发光。在化学发光化合物是吖啶酯族化合物的再进一步的实施方式中，测量步骤包括在中性-碱性条件下加入超氧阴离子。[0084]在本文所述方法的一些实施方式中，分开测量保留在混合物中的可检测标记与被隔离到插入物上的可检测标记使得用户能够在温育步骤后立即进行该测量步骤，而不需要任何对混合物的中间调节或将混合物转移到孔外（例如，不需要中间洗涤步骤）。在一些实施方式中，在不调节混合物的内容物或将混合物转移到孔外的情况下测量可检测标记的量。在特定实施方式中，分开测量保留在混合物中的标记与被隔离到插入物上的标记包括将插入物移至新的孔。在更具体的实施方式中，测量原始孔中保留在混合物中的可检测标记的量可以与测量新的孔中被隔离到插入物上的标记的量的相结合，以指示液体样品中的分析物的量（例如，通过比率测量分析）。[0085]使用本文所述的插入物阵列的方法可以用于众多的高通量、多重分析。例如，插入物阵列可用于测量多个液体样品中的感兴趣的分析物，或者用于测量分配到多个孔中的液体样品中的多种分析物，或者测量多个液体样品中的多种分析物。在特定实施方式中，插入物阵列用于高通量细胞筛选目的。在更具体的实施方式中，插入物阵列用于利用以上描述的方法鉴定表达分泌的多肽的细胞。在更具体的实施方式中，该分泌的多肽是异源多肽。在这些实施方式中，该一种或多种液体样品包含细胞培养基，在该细胞培养基中已培养有被怀疑表达所述多肽的细胞。设备[0086]在另一方面，本发明提供适合用于进行本文所述的结合测定的设备。在一些实施方式中，该设备包括读板仪器械，所述读板仪器械能够检测和/或测量来自含有本发明的插入物的多孔板的一个或多个孔的信号。在一些实施方式中，读板仪器械可配置用于检测和/或测量来自6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板或3456孔板的信号。读板仪是本领域技术人员所熟知的，并且很容易购得。例如，市售读板仪的实例包括例如Perkin-ElmerLS55发光光谱仪、LJLBiosystemsAnalystPlateReader(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)、CytoFluor.TM.2300机器（Millipore)〇[0087]在一些实施方式中，读板仪器械包括光源、检测器以及光中继结构，所述光中继结构被配置用于将光从光源引向与多孔装置的孔相对应的目标区域。[0088]合适的光源包括例如高强度灯、白炽灯、焚光灯、电致发光器件、激光器、激光二极管以及发光二极管（LED)等。在一些实施方式中，光源被配置用于提供连续照射。在其他实施方式中，光源被配置用于提供时变照射，例如，脉冲激光器。光源可被配置用于产生相干和/或非相干光。光源还可被配置用于提供偏振和/或非偏振光。示例性光源包括Q开关YAG激光器、Nd:V04激光器、Nd:玻璃激光器、Nd:YAG激光器、氮激光器、Q开关氩激光器、Ti:蓝宝石激光器、光纤激光器，或者任何合适的激光器或单色光源。[0089]在一些实施方式中，读板仪包括光导引器，所述光导引器将源光引向与多孔装置的一个或多个孔相对应的一个或多个目标区域。在特定实施方式中，光导引器被配置用于向与单个孔相对应的单个目标区域提供源光，以及在孔与孔之间移动，并且在每个孔处存在停留时间，在此期间光导引器将源光引向孔的目标区域。在这些情况下，将会一次一个地照射多孔装置的孔。[0090]在其他实施方式中，光导引器包括光图案发生器，该光图案发生器能够将源光引向与多孔装置的多个孔相对应的多个目标区域。光图案发生器通常包括能够将光操纵成预选光图案的任何机制。该图案可以使用衍射、折射、反射和/或其他机制，或者它们的组合来创建。光图案发生器可用于生成光的任何期望的图案，包括一维或二维图案（或阵列）。例如，光图案发生器可被配置用于创建任何尺寸的规则形状的子束阵列。例如，所期望的图案可以是被定位成与多孔装置的一个或多个目标孔的间距相对应的基本上相等的目标区域的阵列。在一些情况下，光图案发生器提供跨每个目标区域的均一的光强度。在其他实施方式中，所期望的图案对应于多孔装置的孔内的多个目标区域（例如，对应于多个空腔）。在一些实施方式中，所期望的图案对应于基本上包括混合物体积但不包括插入物的孔的区域，或反之亦然。[0091]在一些实施方式中，读板仪附加地包括检测器设备，该检测器设备检测来自多孔装置的多个孔的响应光，并由所述响应光生成与可检测标记有关的信号。在【具体实施方式】中，检测器设备包括单个检测器，该单个检测器被配置用于检测来自与多孔装置的单个孔相对应的单个目标区域的光。在更具体的实施方式中，在孔与孔之间移动所述单个检测器，并且在每个孔处存在停留时间，在此期间来自响应光的信号被数字化并存储到存储器中。[0092]在其他实施方式中，检测器设备包括光中继结构，该光中继结构被配置用于将来自多个孔的响应光引向与所述多个孔中的单独的孔相对应的多个光检测器。在具体实施方式中，多个光检测器同时检测来自所述多个孔的响应光。在更具体的实施方式中，检测器设备通过使用CCD相机或其他成像设备（例如，基于CMOS芯片的相机）拍摄整个板的快照来同时检测来自所述多个孔的响应光。[0093]在一些实施方式中，该设备可任选地包括处理器，该处理器适于与读板仪通信和处理来自读板仪的数据。在一些实施方式中，读板仪向处理器通信由检测器设备所生成的信号。处理器可以将该信号转换成指示出可检测标记在目标区域中的存在或量的测量值。在一些实施方式中，处理器还被配置用于向读板仪通信用户定义的实验设置。例如，用户可以设定读板仪是进行对板的顶部读取还是底部读�。梢匝≡袼�/她希望从中获得数据的孔，可以设定测定的类型（例如，荧光测定还是发光测定），可以定义荧光测定的激发/发射设置，或者可以定义用于将源光引向特定孔中的特定目标区域的预选光图案。本文所描述的处理器可以集成到读板仪或作为体现在可操作地连接至读板仪的计算机中的单独的组件。在优选实施方式中，由于孔的底部表面可能提供降低测量精确度的光学干涉，因此用户选择顶部读取。[0094]在一些实施方式中，读板仪能够检测来自单个孔内的多个限定的目标子区域（扫描点）的信号。在一些实施方式中，读板仪能够从来自多孔板的多个孔的相同的多个限定的目标子区域检测信号。在其他实施方式中，该设备包括软件，该软件能够图形地显示来自每个目标子区域的信号以创建每个孔的图谱（map)。在其他实施方式中，该设备包括处理器，该处理器能够使用户能够选择或移除孔的单独的目标子区域或整个部分以便进行分析，从而限定孔的检测区。在一些实施方式中，用户选择基本上不包括插入物的检测区。在其他实施方式中，用户选择通过基本上排除插入物的空腔而选择包括插入物的检测区。能够以本文所述的方式对孔进行扫描的读板仪是本领域已知的，并且可商购自多个供应商，例如，PHERAstarFS(BMGLabtech)、EnSpireMultimodePlateReader(PerkinElmer)、GeminiEMFluorescenceMicroplateReader(MolecularDevices)等。[0095]在一些实施方式中，计算机附加地包括接口，该接口通信地耦合至云，该云可以包括用于数据存储和/或进一步处理的一个或多个外部服务器。[0096]图5提供了本发明的示例性设备（500)的示意图。该设备包括：多孔设备，其具有一个或多个孔，所述一个或多个孔在其中插入有本发明的插入物（510);读板仪（520)，其能够检测与可检测标记有关的信号并将所述信号通信至计算机（530)，该计算机能够将所述信号转换成指示出可检测标记的存在或量的测量数据，并且任选地能够将数据中继到云(540)。当需要时，读板仪本身或者可操作地连接的计算机包含被检测的给定分析物的参考或标准图表，以实现对测试样品中该分析物的定量分析。试剂盒[0097]在另一方面，本发明提供用于测量多孔装置的孔中的液体样品中存在的分析物的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包括一个或多个本文所述的插入物，其中所述插入物在其上固定有结合剂。在一些实施方式中，试剂盒还包括关于使用该插入物进行结合测定以测量分析物的说明书。[0098]在其他实施方式中，试剂盒包括经标记的示踪物。在一些实施方式中，选择经标记的示踪物和结合剂，使得经标记的示踪物对分析物和对结合剂具有相似的结合亲和力。在进一步的实施方式中，选择结合剂使得其不具有明显的对分析物的结合亲和力。在进一步的实施方式中，使用说明书指导用户测量保留在混合物中的可检测标记的量，其中所述量与液体样品中的分析物的量成正比。在其他实施方式中，使用说明书指导用户测量被隔离到所述一个或多个插入物上的可检测标记的量，其中所述量与液体样品中分析物的量成反比。[0099]在备选的实施方式中，选择经标记的示踪物和结合剂，使得所述结合剂能够与分析物在第一位点结合，并且经标记的示踪物能够与分析物在第二位点结合。在进一步的实施方式中，经标记的示踪物不具有明显的对结合剂的结合亲和力。在进一步的实施方式中，使用说明书指导用户测量保留在混合物中的可检测标记的量，其中所述量与液体样品中分析物的量成反比。在其他实施方式中，使用说明书指导用户测量被隔离到所述一个或多个插入物上的可检测标记的量，其中所述量直接与液体样品中分析物的量成正比。[0100]在一些实施方式中，试剂盒进一步包括标准，例如，用于在本发明的测定中使用的标准。标准的实例例如包括包含已知浓度的分析物的储备溶液，其中所述储备溶液可以连续稀释以产生标准曲线。[0101]本文提供了本发明的插入物和方法的其他示例性实施方式。实施例1:利用本发明的插入物的竞争性FLISA测定[0102]为了制备插入物，外径为6mm且内径为4mm的塑料管购自Graingers(目录号2vdn6和2vdp4)并切成约6mm高的、具有锋利刀片的圆柱体。将这些圆柱体在INNaHCCV^液中煮沸约10分钟，用去离子水漂洗5遍，并风干。然后将这些圆柱体浸没于在包被缓冲液(0·INNaHCO3,pH9.0)中制备的5微克/ml山羊抗人IgG(H+L)(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.，目录号109-005-003)中，并在约4-9°C下温育过夜。将包被的环在PBS中漂洗3遍，备用。包被的漂洗物可以风干并贮存以供以后使用。将制备的免疫吸附性插入物插入到96孔板的孔中。图6描绘了插入到96孔板中的插入物的示例性照片。[0103]将人γ球蛋白（JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.，目录号009-000-002)和AlexaFluor⑧488偶联的ChromoPure人IgG(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.，目录号009-540-003)在FLISA缓冲液（含有0·I%吐温20和I%BSA的PBS)中稀释。以1:2的比例从5微克/ml的起始浓度制备人γ球蛋白的一系列稀释液。一式两份，将人γ球蛋白溶液以100微升/孔添加到具有免疫吸附性插入物的96孔板中，或者添加到已用5微克/ml山羊抗-人IgG(H+L)包被的96孔板中。然后，除了只接受150微升FLISA缓冲液的空白对照孔外，向各孔添加50微升的45微克/mlAlexaFluor⑧488偶联的ChromoPure人IgG。然后将板在振荡器上短时混合，并在37°C下温育2小时或在约4-9°C下温育过夜，之后用PerkinElmerEnvision读板仪读取。使用493nm的激发光照射各孔，并从各孔检测519nm的发射光。将数据作为重复试验的平均值来作图，并通过曲线拟合进行分析。图7描绘了作为人γ球蛋白浓度的函数的荧光强度的图。数据表明，在具有插入物（包被的环）的孔中，荧光强度随人γ球蛋白浓度的增加（其范围为0.08至2.5微克/ml)而线性增加。相反，不同的人γ球蛋白组的荧光强度在直接用抗体包被的板中保持为平线。实施例2:利用本发明的插入物的夹心FLISA测定[0104]为了制备插入物，外径为1/4"的尼龙管购自Graingers(目录号2vdn6和2ν4)并切成约3mm高的、具有锋利刀片的圆柱体。将这些圆柱体在IMNaHCO3溶液中煮沸10分钟，用去离子水漂洗5遍，并风干。然后将这些圆柱体浸没于在包被缓冲液（0.INNaHCO3,pH9.0)中制备的5微克/1111山羊抗人]^61〇轻链（5〇111:1161'1113;[(^6(311，目录号2060-01)中，并在4-9°C下温育过夜。包被的环在PBS中漂洗3遍，通过在PBS中与0.5%牛白蛋白一起温育而封闭，备用。将制备的环插入到96孔板（E&KScientific，EK-25076)的孔中。[0105]将人γ球蛋白（JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.，目录号009-000-002)在样品缓冲液（含有0.I%吐温20和I%BSA的PBS)中稀释。从1微克/ml的浓度开始，以稀释倍数2制备人γ球蛋白的一系列稀释液。一式两份，将人γ球蛋白溶液以100微升/孔添加到96孔板的孔中，该96孔板具有用上述抗-人κ轻链抗体包被的圆柱形插入物。在室温下温育60分钟后，采用洗板器，用300微升/孔含有0.1%吐温20的PBS洗板3次。然后，除了只接受100微升Probe缓冲液（含有0.1%吐温20和0.1%BSA的PBS)的空白对照孔外，以100ng/ml的浓度添加（100微升/孔）在Probe缓冲液中稀释的AlexaFlu〇?488偶联的AffiniPure抗-人IgGFc特异性抗体（JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.，目录号109-545-098)。将板在室温下在轻轻振摇下温育45分钟，之后用PerkinElmerEnvisionMultipurpose读板仪读�。し�493nm，发射519nm)。将数据作为重复试验的平均值来作图，并采用MicrosoftExcel通过曲线拟合进行分析。如图8所示，荧光强度随人γ球蛋白浓度的增加而线性降低。[0106]虽然本文已经显示和描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员将会明白，这些实施方式仅以实例的方式提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将会想到许多变更、变化和替换。应当理解，本文描述的本发明实施方式的各种备选的方式可用于实施本发明。下面的权利要求旨在限定本发明的范围，因此由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。【权利要求】1.一种用于插入到多孔装置的孔中的插入物，所述插入物包含基本上不含微孔的内表面和外表面；其中所述内表面和/或外表面在其上固定有结合剂；其中所述插入物的尺寸设置为小于所述孔，使得所述插入物可以插入到所述孔中。2.-种用于插入到多孔装置的孔中的插入物，所述插入物包含内表面和外表面，其中所述内表面和/或外表面在其上固定有结合剂，其中所述外表面具有的直径小于所述孔的直径，使得所述插入物可以插入到所述孔中；其中所述插入物向多孔装置的孔中的所述插入使得所述孔与所述装置的相邻孔在光学上隔离。3.如权利要求1或2所述的插入物，其中所述插入物由不透明的材料制成。4.如权利要求1或2所述的插入物，其中所述插入物在形状上为圆柱形。5.如权利要求1或2所述的插入物，其中所述插入物是中空的。6.如权利要求1或2所述的插入物，其中所述插入物包含多个空腔。7.如权利要求1或2所述的插入物，其中所述插入物的尺寸设置为可从所述孔中移除。8.如权利要求1或2所述的插入物，其中所述结合剂包含抗体。9.如权利要求1或2所述的插入物，其中所述结合剂包含抗原。10.-种用于插入到多孔装置的多个孔中的插入物阵列，其中每个单独的插入物被安装在连续的固体框架上，所述框架的尺寸设置为允许同时向所述多个孔的每个单独的孔中插入和任选地移除每个单独的插入物，其中所述单独的插入物包含内表面和外表面，所述内表面和外表面中的任一个或两个在其上固定有结合剂，其中所述内表面和/或外表面基本上不含微孔。11.一种用于插入到多孔装置的多个孔中的插入物阵列，其中每个单独的插入物被安装在连续的固体框架上，所述框架的尺寸设置为允许同时向所述多个孔的每个单独的孔中插入和任选地移除每个单独的插入物，其中所述单独的插入物包含内表面和外表面，所述内表面和外表面中的任一个或两个在其上固定有结合剂，其中所述单独的插入物向所述单独的孔中的插入使得所述孔与所述装置上的其他相邻孔在光学上隔离。12.如权利要求10或11所述的插入物阵列，其中所述框架的尺寸设置为允许同时向所述多孔装置的每个单独的孔中插入和移除所述每个单独的插入物。13.-种多孔装置，其包含如权利要求10或11所述的插入物阵列。14.如权利要求13所述的多孔装置，其中所述多孔装置是具有6、12、24、96、384、1536或3456个孔的多孔板。15.-种包含多个孔的多孔装置，所述多个孔中的至少一个孔包含如权利要求1或2所述的插入物。16.如权利要求15所述的多孔装置，其中所述多孔装置是具有6、12、24、96、384、1536或3456个孔的多孔板。17.-种测量孔中液体样品中存在的分析物的方法，其包括：(a)向含有液体样品的孔中加入包含可检测标记的经标记的示踪物以形成混合物，其中所述孔中包含如权利要求1或2所述的插入物；(b)使所述分析物和所述结合剂竞争所述示踪物的结合一段充足的时间，以实现复合物的形成，该复合物包含在混合物中的该示踪物以及该分析物或该结合剂中之一，其中所述竞争导致第一量的所述可检测标记保留在所述混合物中而第二量的所述可检测标记被隔离到所述插入物的内表面和/或外表面上；以及(C)测量所述孔中保留在所述混合物中的所述可检测标记的所述第一量，其中所述第一量与存在于该混合物中的所述分析物的量成比例。18.-种测量孔中液体样品中存在的分析物的方法，其包括：(a)向含有液体样品的孔中加入经标记的示踪物以形成混合物，其中所述孔中包含如权利要求1或2所述的插入物；(b)使得在所述插入物的内表面和/或外表面上形成复合物，其中该复合物包含（1)与所述分析物上的第一结合位点结合的经标记的示踪物，和（2)与同一分析物上的第二结合位点结合的结合剂，所述形成导致第一量的所述可检测标记保留在所述混合物中而第二量的所述可检测标记被隔离到所述插入物的内表面和/或外表面上；以及(c)测量所述孔中保留在所述混合物中的所述可检测标记的所述第一量，其中所述第一量与存在于该混合物中的所述分析物的量成反比。19.如权利要求17或18所述的方法，其中在不将所述混合物转移到孔外或调节所述混合物的内容物的情况下测量保留在所述混合物中的所述可检测标记的所述第一量。20.如权利要求17或18所述的方法，其中在从所述孔中移除插入物后测量保留在所述混合物中的所述可检测标记的所述第一量。21.如权利要求17或18所述的方法，其中所述方法能够以3.9至1000ng/ml的线性检测范围测量所述分析物。22.-种测量孔中液体样品中存在的分析物的方法，其包括：(a)向含有液体样品的孔中加入包含可检测标记的经标记的示踪物以形成混合物，其中所述孔中包含如权利要求1或2所述的插入物；(b)使所述分析物和所述结合剂竞争所述示踪物的结合一段充足的时间，以实现复合物的形成，该复合物包含在混合物中的该示踪物以及该分析物或该结合剂中之一，其中所述竞争导致第一量的所述可检测标记保留在所述混合物中而第二量的所述可检测标记被隔离到所述插入物的内表面和/或外表面上；以及(c)测量被隔离到所述插入物的内表面和/或外表面上的所述可检测标记的所述第二量，其中所述第二量与存在于该混合物中的所述分析物的量成反比。23.-种测量孔中液体样品中存在的分析物的方法，其包括：(a)向含有液体样品的孔中加入包含可检测标记的经标记的示踪物以形成混合物，其中所述孔中包含如权利要求1或2所述的插入物；(b)使得在所述插入物的内表面和/或外表面上形成复合物，其中该复合物包含（1)与所述分析物上的第一结合位点结合的经标记的示踪物，和（2)与同一分析物上的第二结合位点结合的结合剂，所述形成导致第一量的所述可检测标记保留在所述混合物中而第二量的所述可检测标记被隔离到所述插入物的内表面和/或外表面上；以及(c)测量被隔离到所述插入物的内表面和/或外表面上的可检测标记的所述第二量，其中所述第二量与存在于该混合物中的所述分析物的量成比例。24.如权利要求22或23所述的方法，其中在不将所述混合物转移到孔外或调节所述混合物的内容物的情况下测量保留在所述混合物中的所述可检测标记的第二量。25.如权利要求22或23所述的方法，其中在从所述孔中移除插入物后测量所述可检测标记的所述第二量。26.-种在多孔装置中在分析物和包含可检测标记的经标记的示踪物的混合物中进行结合测定的方法，该方法包括：(a)向如权利要求10或权利要求11所述的阵列的多个插入物上添加所述经标记的示踪物；(b)使所述分析物和所述结合剂竞争所述示踪物的结合一段充足的时间，以实现复合物的形成，该复合物包含在混合物中的该示踪物以及该分析物或该结合剂中之一，其中所述竞争导致第一量的所述可检测标记保留在所述混合物中而第二量的所述可检测标记被隔离到所述插入物的内表面和/或外表面上；以及(c)测量所述多个孔中保留在所述混合物中的所述可检测标记的所述第一量，其中所述第一量与存在于该混合物中的所述分析物的量成比例。27.-种在多孔装置中在分析物和包含可检测标记的经标记的示踪物的混合物中进行结合测定的方法，该方法包括：(a)向如权利要求10或权利要求11所述的阵列的多个插入物上添加所述经标记的示踪物；(b)使得在所述插入物的内表面和/或外表面上形成复合物，其中该复合物包含（1)与所述分析物上的第一结合位点结合的经标记的示踪物，和（2)与同一分析物上的第二结合位点结合的结合剂，所述形成导致第一量的所述可检测标记保留在所述混合物中而第二量的所述可检测标记被隔离到所述插入物的内表面和/或外表面上；以及(c)测量所述多个孔中保留在所述混合物中的所述可检测标记的所述第一量，其中所述第一量与存在于该混合物中的所述分析物的量成反比。28.-种鉴定表达分泌的异源多肽的细胞的方法，其包括：(a)提供包含多个孔的多孔装置，其中所述多个孔中的每个孔中插有如权利要求1或2所述的插入物，并且其中所述多个孔中的每个孔包含细胞培养基，在该细胞培养基中已培养有被怀疑表达所述多肽的细胞；(b)向所述包含细胞培养基的多个孔中加入包含可检测标记的经标记的示踪物以形成混合物；(c)使所述多肽和所述结合剂竞争所述示踪物的结合一段充足的时间，以实现复合物的形成，该复合物包含在混合物中的该示踪物以及该多肽或该结合剂中之一，其中所述竞争导致第一量的所述可检测标记保留在所述培养基中而第二量的所述可检测标记被隔离到所述插入物的内表面和/或外表面上；以及(d)测量所述孔中保留在所述混合物中的所述可检测标记的所述第一量，其中所述第一量与存在于所述细胞培养基中的所述多肽的量成比例，由此鉴定表达分泌的异源多肽的细胞。29.-种鉴定表达分泌的异源多肽的细胞的方法，该方法包括：(a)提供包含多个孔的多孔装置，其中所述多个孔中的每个孔中插有如权利要求1或2所述的插入物，并且其中所述多个孔中的每个孔包含细胞培养基，在该细胞培养基中已培养有被怀疑表达所述多肽的细胞；(b)向所述包含细胞培养基的多个孔中加入包含可检测标记的经标记的示踪物以形成混合物；(C)使得在所述插入物的内表面和/或外表面上形成复合物，其中该复合物包含（1)与所述多肽上的第一结合位点结合的经标记的示踪物，和（2)与同一多肽上的第二结合位点结合的结合剂，所述形成导致第一量的所述可检测标记保留在所述培养基中而第二量的所述可检测标记被隔离到所述插入物的内表面和/或外表面上；以及(d)测量所述孔中保留在所述培养基中的所述可检测标记的所述第一量，其中所述第一量与存在于该培养基中的所述多肽的量成反比；由此鉴定表达所述异源多肽的细胞。30.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可检测标记是放射性探针。31.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可检测标记是光学可检测的标记。32.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可检测标记包含荧光染料。33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分析物是分泌的蛋白质。34.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测量包括将光引向所述孔中的观察体积，其中所述观察体积基本上被所述第一量的所述可检测标记所占据，但基本上不含所述第二量的所述可检测标记。35.-种用于测量孔中液体样品中存在的分析物的设备，其包含：(a)多孔装置，其包含（i)其中插入一个或多个如权利要求1或2所述的插入物的一个或多个孔，其中所述孔包含含有经标记的示踪物的混合物，该经标记的示踪物包含可检测标记；(b)读板仪，其能够（i)从所述一个或多个孔检测所述标记。36.如权利要求35所述的设备，其中所述读板仪包含被编程为产生与所述检测的标记相对应的信号的处理器，并且其中所述读板仪可操作地连接到计算机，该计算机被配置成（i)从所述读板仪接收所述信号；并（ii)从所述信号生成定量测量数据；以及任选地(iii)将所述定量测量数据中继到云服务器。37.如权利要求35所述的设备，其中所述读板仪能够被配置成从基本不含所述一个或多个插入物的限制的体积中检测所述标记。38.如权利要求35所述的设备，其中所述读板仪能够检测放射性标记。39.如权利要求35所述的设备，其中所述读板仪能够检测光学可检测的标记。40.如权利要求39所述的设备，其中所述光学可检测的标记包含荧光染料。41.如权利要求40所述的设备，其中所述光学可检测的标记包含发光标记。42.-种用于测量多孔装置的一个或多个孔中液体样品中存在的分析物的试剂盒，其包含：(a)-个或多个如权利要求1或2所述的插入物；(b)关于使用所述一个或多个插入物进行结合测定以测量所述分析物的说明书。43.如权利要求42所述的试剂盒，其进一步包含含有可检测标记的经标记的示踪物，其中所述经标记的示踪物能够与所述分析物或所述结合剂形成复合物。44.如权利要求43所述的试剂盒，其中所述结合剂能够与所述分析物在第一结合位点形成复合物。45.如权利要求43所述的试剂盒，其进一步包含含有可检测标记的经标记的示踪物，其中所述经标记的示踪物能够与所述分析物在第二结合位点形成复合物。【文档编号】G01N1/36GK104520690SQ201380039736【公开日】2015年4月15日申请日期:2013年3月13日优先权日:2012年5月25日【发明者】李荣皓申请人:珠海恺瑞生物科技有限公司(中国)
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