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一种己烯雌酚快速检测卡的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种己烯雌酚快速检测卡,属于农产品违禁物质的检测领域。本发明所提供的己烯雌酚快速检测卡，包括外壳，测试条，检测窗孔，加样孔，支承背板，硝酸纤维素膜，荧光素颗粒膜，样品垫，吸水膜，检测带和质控带,检测带含己烯雌酚蛋白质偶联物；质控带含肌动蛋白。本发明的检测己烯雌酚具有敏度高、精确定量、特异性强、简单方便和检测时间短的优点。
【专利说明】一种己烯雌酚快速检测卡
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种己烯雌酚快速检测卡，是一种检测己烯雌酚的检测器具，属于农产品违禁物质的检测领域。
【背景技术】
[0002]天然雌激素主要包括雌二醇、雌酮、雌三醇，而合成雌激素主要有己烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚等，在农业中主要用作口服避孕药和家畜生长的同化激素，通过增强食欲、抑制发情、提高饲料转化率和控制性别等作用，能达到大幅度地提高动物养殖经济效益的目的，导致农产品中雌激素污染残留呈上升趋势。农产品中的雌激素可以通过扰乱内分泌、免疫、神经等系统的正常功能而对动物和人产生多种疾病，最主要表现在对生殖系统的影响:女性多出现子宫内膜异位、子宫肌瘤，卵巢癌、乳腺癌等疾病。男性多出现睾丸癌、前列腺癌、精子的数量与质量下降等症状。
[0003]外源雌激素在环境及农产品中含量很少(动物肌肉组织中类固醇激素以ng *kg-l到μ g.kg-1数量级存在)，加上本身化学性质差异较大以及内源性雌激素的影响，因此对检测方法的灵敏度要求较高。目前用于农产品中性激素检测的方法主要包括仪器分析法、生物活性法和免疫分析法。
[0004]仪器分析法主要包括气相色谱法、高效液相色谱法以及色谱-质谱联用法，已被广泛用于雌激素类等的测定。仪器分析法灵敏度高，能较准确地定性定量，是实验室进行确证的标准方法。但该方法仪器成本较高，分析时间较长、操作较复杂，因此只适合实验室确证用，并不适合基层普查使用。免疫层析技术具有成本低、速度快，特异性高等优点，目前已广泛应用于传染病诊断、生殖生育监测、药物滥用等领域。虽然免疫层析具有如此吸引人的优点，但其应用也受到了一定限制，主要是因为目前在免疫层析中应用的主要标记物是胶体金，一般通过肉眼观察进行判断结果，因此灵敏度不够高，也无法进行准确定量。因此对环境和农产品中含量很低的雌激素己烯雌酚测定来说，普通的胶体金免疫层析很难达到灵敏度及定量的要求。

【发明内容】

[0005]本发明的目的在于提供一种能检测己烯雌酚的检测器具，直接应用免疫学的方法检测样品中己烯雌酚的含量，克服现有色谱法检测的操作繁琐等缺点，建立基于免疫学特异性的高灵敏度的检测方法。
[0006]本发明的技术方案:一种己烯雌酹快速检测卡，其为在长条扁平薄壳状的检测卡外壳中设置测试条，检测卡外壳表面有检测窗孔和加样孔；测试条是由支承背板上通过不干胶在其上依次粘贴样品垫、荧光素颗粒膜、硝酸纤维素膜、和吸水膜所组成；支承背板中部叠置粘贴硝酸纤维素膜，支承背板一端叠置粘贴吸水膜，另一端叠置粘贴样品垫，吸水膜内端与样品垫内端各自分别与硝酸纤维素膜搭接，在样品垫与硝酸纤维素膜的搭接部，两者之间夹置粘贴一段荧光素颗粒膜；荧光素颗粒膜为含抗己烯雌酚抗体荧光素颗粒和荧光素颗粒标记的抗肌动蛋白抗体包被的玻璃纤维膜，硝酸纤维素膜上有一条检测带和一条质控带，依次是:含己烯雌酚蛋白质偶联物的检测带，含肌动蛋白质控带，测试条置入检测卡外壳内，样品垫正对加样孔，硝酸纤维素膜正对检测窗孔。
[0007]采用上述己烯雌酚快速检测卡，检测样品为环境及农产品等，处理方法如下: 产品样品粉碎后加入适量的甲基叔丁基醚，垂直振荡15 m i η，于4 °C、1 O O O r P m离心
15min，取上清，氮气吹干，使用含10%甲醇的PBS缓冲液溶解，混匀即得待测样品。
[0008]荧光素颗粒选自异硫氰酸荧光素颗粒、四甲基异硫氰酸罗丹明颗粒、四乙基罗丹明颗粒或藻红蛋白颗粒。
[0009]在样品吸收垫上滴加样品，如果样品中有己烯雌酚，则己烯雌酚经层析作用移动到荧光素颗粒膜的时候就会和荧光素颗粒标记的抗己烯雌酚抗体结合形成复合物，并带动荧光素颗粒标记的质控抗体一起在层析作用下上行。当移动到检测带时，未被样品中己烯雌酚结合的游离的荧光素颗粒标记的抗己烯雌酚抗体就会和检测带上的偶联在载体蛋白上的己烯雌酚结合，而有荧光信号。荧光素标记的质控抗体则被质控带上的质控抗原捕获，而有荧光信号。而样品中己烯雌酚和荧光素标记的抗雌激素抗体形成的复合物则被层析到吸水纸上。样品中的己烯雌酚越多，则荧光素颗粒膜中剩余游离的荧光素标记的抗雌激素抗体越少，结合到检测带上的荧光素标记的抗雌激素抗体越少，荧光信号也就越弱，依此来检测样品中的己烯雌酚的含量。
[0010]本发明的检测雌激素的试纸具有灵敏度高、精确定量、特异性强、简单方便和检测时间短的优点。由于以荧光素代替了胶体金作为标记物，很少的荧光信号既可以通过仪器检测出来，因此大大提高了检测的灵敏度，检测雌激素灵敏度可达0.lng/ml。通过设置质控带(点)作为数据归一化方法，降低了不同纸条间不同操作人员乃至不同仪器扫描的实验误差，将不同纸条测得的样品值代入标准曲线，即可以达到精确定量的效果。
[0011]
【专利附图】

【附图说明】
[0012]图1己烯雌酚快速检测卡的测试条结构示意图。
[0013]图中:5、支承背板，6、硝酸纤维素膜，7、荧光素颗粒膜，8、样品垫，9、吸水膜，10、检测带，11、质控带。
[0014]图2己烯雌酚快速检测卡外壳及测试条在外壳内的安置图。
[0015]图中:1、外壳，2、测试条，3、检测窗孔，4、加样孔。
[0016]
【具体实施方式】
[0017]本发明结合具体实施例参见附图进一步说明如下:
实施例1
一种己烯雌酚快速检测卡，它是在检测卡外壳I中设置测试条2，检测卡外壳I的结构及测试条2的设置参见附图2，检测卡外壳I为长条扁平薄壳状外壳，长70_，宽20_，厚5mm,薄壳壁厚Imm,由工程塑料制成。检测卡外壳I由壳盖与壳座两半联接构成，在检测卡外壳I壳盖上有检测窗孔3和加样孔4。测试条2放置在检测卡外壳I的壳座内。测试条2是多层结构的窄条薄片，片长约60mm，片宽约4mm，厚度约2. 5mm。测试条2是多层结构：底层是支承背板5,为聚氯乙烯塑料薄片,厚约O. 5mm,长60mm,宽4_ ;支承背板5中部叠置粘贴硝酸纤维素膜6，硝酸纤维素膜厚O. 5mm,长20_25mm，宽4mm。硝酸纤维素膜6上有二条间隔开的横向显示印迹带，参见附图1，二条显示印迹带中，一条是检测带10，含己烯雌酚蛋白质偶联物；另一条是质控带11，含肌动蛋白。支承背板5 —端部上叠置粘贴吸水膜9，支承背板5另一端部上叠置粘贴样品垫8，吸水膜9内端与样品垫8内端各自分别与硝酸纤维素膜6 —端搭接，在样品垫8与硝酸纤维素膜6的搭接部，两者之间夹置粘贴一段荧光素颗粒膜7，荧光素颗粒膜是含抗己烯雌酚抗体荧光素颗粒和荧光素颗粒标记的抗肌动蛋白抗体包被的玻璃纤维膜。突光素颗粒膜7厚O. 5-0. 8mm,长5mm,宽4mm。样品垫8厚
O.5-0. 8mm,长20_，宽4_。吸水膜9厚O. 5-0. 8mm,长16-20_，宽4_。荧光素颗粒膜7、样品垫8及吸水膜9与硝酸纤维素膜搭接长度为1-2_。吸水膜9材料是吸水纸，样品垫8材料是吸水玻璃纤维膜。
[0018]荧光素颗粒选自异硫氰酸荧光素颗粒、四甲基异硫氰酸罗丹明颗粒、四乙基罗丹明颗粒或藻红蛋白颗粒。
[0019]实施例2
本发明己烯雌酚检测卡用于牛奶样品中的己烯雌酚的检测。
[0020]在牛奶中加入适量的甲基叔丁基醚，垂直振荡15min,于4 °C、IOOOOrpm离心15min，取上清，氮气吹干，使用含10%甲醇的PBS缓冲液溶解，混匀即得待测样品。
[0021]取150ul待测样品加入注样孔，在毛细管作用下待测样品沿吸水垫方向移动，样品溶解荧光素颗粒膜上的包被物质，并带动包被物质一起向吸水垫方向移动。在样品吸收垫上滴加样品，如果样品中有己烯雌酚，则己烯雌酚经层析作用移动到荧光素颗粒膜的时候就会和荧光素颗粒标记的抗己烯雌酚抗体结合形成复合物，并带动荧光素颗粒标记的质控抗体一起在层析作用下上行。当移动到检测带时，未被样品中己烯雌酚结合的游离的荧光素颗粒标记的抗己烯雌酚抗体就会和检测带上的偶联在载体蛋白上的己烯雌酚结合，而有荧光信号。荧光素标记的质控抗体则被质控带上的质控抗原捕获，而有荧光信号。而样品中己烯雌酚和荧光素标记的抗雌激素抗体形成的复合物则被层析到吸水纸上。样品中的己烯雌酚越多，则荧光素颗粒膜中剩余游离的荧光素标记的抗雌激素抗体越少，结合到检测带上的荧光素标记的抗雌激素抗体越少，荧光信号也就越弱，依此来检测样品中的己烯雌酚的含量。通过测定标准不同浓度的标准品和对质控带上的荧光浓度进行归一化比较（T/C)，可以构建标准曲线，进而可以定量样品中己烯雌酚的浓度。很少的荧光信号既可以通过仪器检测出来，因此大大提高了检测的灵敏度。
【权利要求】
1.一种己烯雌酚快速检测卡，其特征在于长条扁平薄壳状的检测卡外壳中设置测试条，检测卡外壳表面有检测窗孔和加样孔；测试条是由支承背板上通过不干胶在其上依次粘贴样品垫、荧光素颗粒膜、硝酸纤维素膜、和吸水膜所组成；支承背板中部叠置粘贴硝酸纤维素膜，支承背板一端叠置粘贴吸水膜，另一端叠置粘贴样品垫，吸水膜内端与样品垫内端各自分别与硝酸纤维素膜搭接，在样品垫与硝酸纤维素膜的搭接部，两者之间夹置粘贴一段荧光素颗粒膜；荧光素颗粒膜为含抗己烯雌酚抗体荧光素颗粒和荧光素颗粒标记的抗肌动蛋白抗体包被的玻璃纤维膜，硝酸纤维素膜上有一条检测带和一条质控带，依次是:含己烯雌酚蛋白质偶联物的检测带，含肌动蛋白质控带，测试条置入检测卡外壳内，样品垫正对加样孔，硝酸纤维素膜正对检测窗孔。
2.如权利要求1所述己烯雌酚快速检测卡，其特征在于，检测时检测样品的前处理方法为产品样品粉碎后加入适量的甲基叔丁基醚，垂直振荡15min，于4°C、1000rpm离心15min，取上清，氮气吹干，使用含10%甲醇的PBS缓冲液溶解，混匀即得待测样品。
3.如权利要求1所述己烯雌酚快速检测卡，其特征在于，所述荧光素颗粒选自异硫氰酸荧光素颗粒、四甲基异硫氰酸罗丹明颗粒、四乙基罗丹明颗粒或藻红蛋白颗粒。
【文档编号】G01N33/74GK104034905SQ201410284470
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】李永锋, 陈国勇, 傅汝毅, 陶玲云, 蓝文苑 申请人:广西博士海意信息科技有限公司