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一种偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶，所述凝胶是将Stat3抗体偶联至琼脂糖凝胶载体上制成偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶；所述Stat3抗体是由Stat3抗原多肽经免疫反应后进行提取纯化而获得，所述Stat3抗原多肽的氨基酸序列为序列2、序列3、序列5、序列8和序列9之一所示；本发明所述Stat3抗体灵敏性好，效价高；本发明中所得到的偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶可以直接富集细胞中的Stat3蛋白及其Stat3结合蛋白，用于Stat3蛋白相关疾病中的功能研究；序列2：DFDFNYKTLKSQGC；序列3：PEADPGSAAPYLKT；序列5：LYPDIPKEEAFGKY；序列8：ESQEHPEADPGSAAPY；序列9：KVSYKGDPIVQHRP。
【专利说明】一种偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶及其应用 (一）

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种 Stat3 抗体（Signal Transducers and Activators of Transcription3)及其抗体填料制备方法与应用。具体而言，是基于Stat3氨基酸序列选择 多个位点的多肽免疫，筛选高效价的Stat3抗体，并制备成偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶。 (二）

【背景技术】
[0002] Stat3 抗体（Signal Transducers and Activators of Transcription3)为信号 传导与转录激活因子（Signal Transducers and Activators of Transcription，STAT)蛋 白家族的成员，在维持胚胎干细胞的全能性及调节免疫中发挥重要作用。Stat3基因敲除的 小鼠可引起胚胎致死，其异常表达与多种疾病密切相关。
[0003] Stat3执行生理功能具有多样性特点：（1)维持胚胎干细胞的自我更新；(2)刺激 T细胞增殖，诱导Thl7细胞生成；（3)保持外周神经细胞存活；（4)参与上皮组织中胸腺细 胞的发育及乳腺细胞的退化；（5)介导肝细胞的急性期损伤修复等。由于Stat3执行功能 的多样性，在多种肿瘤及免疫性疾病中均发现Stat3的异常表达（参见 ：Levy，D.E.，and Lee,C.K. (2002). What does Stat3 do ? The Journal of clinical investigation 109, 1143-1148. Yu, H. , Pardoll, D. , and Jove, R. (2009). STATs in cancer inflammation and immunity:a leading role for STAT3. Nature reviews Cancer 9,798-809·)。
[0004] Stat3在细胞内有两种异构体Stat3a和Stat3 0，Stat3a蛋白全长770个氨 基酸，由六个功能区组成（Becker S, Groner B, Muller CW. Three-dimensional structure of the Stat3beta homodimer bound to DNA. Nature 1998 ；394:145-151.Schaefer TS, Sanders LK, Nathans D. Cooperative transcriptional activity of Jun and Stat3 beta, a short form of Stat3. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:9097-9101.) ：(1)N 端的氨基酸保守序列（1-130);⑵螺旋区（Coil-coil Domain 130-320, CCD) ; (3)DNA 结 合域（DNA Binding Domain 320-494, DBD) ; (4)连接区（Linker Domain 495-583) ; (5) SH2 结构域（SH2 Domain 584-688) ; (6) C 端的转录激活区（Transactivation domain689_770， TAD)，见图I所示。
[0005] 精确的认识Stat3在不同组织、细胞中的功能有助于我们认识Stat3在疾病发生 中的作用。针对Stat3制备的抗体，在多个商业化的公司均有多种Stat3抗体在销售，如 SantaCruz 公司的 Stat3 抗体对应货号有 SC-482, SC-8019, SC-7179 等。Cell signaling technology公司的Stat3抗体对应货号有9319、4904等。公司关于使用哪一段多肽免疫产 生的Stat3抗体均属于商业机密，我们根据Stat3蛋白的氨基酸序列特性，合成了 10段候 选抗原多肽，并筛选到一个能高效制备Stat3抗体的抗原多肽。
[0006] NHS活化琼脂糖凝胶偶联抗体在检测细胞或者组织内的低丰度蛋白及筛选目的蛋 白的结合蛋白中应用广泛。关于偶联抗体的填料产品，目前有偶联标签抗体填料的商业化 产品如 c-Myc Tag IP/Co-IP kit (Thermo Scientific?#23610)，ANTI-FLAG M2Magnetic Beads(Sigma#A2220)，关于琼脂糖凝胶偶联Stat3抗体的产品未见销售。根据文献检索 表明目前筛选Stat3结合蛋白的方法有：将Stat3构建到带标签蛋白的表达载体中用偶 联标签抗体的琼脂糖凝胶进行筛选，这个方法牵涉到转染和载体构建的过程，方法复杂， 流程时间长，而且不能排除标签抗体自身拉下的结合蛋白的干扰。或者用传统的IP方法 利用Stat3 -抗联合ProteinA+G珠分离细胞内的Stat3结合蛋白，因为过程中要使用 ProteinA+G珠，因此这种方法不可避免会导致大量IgG及IgA的结合，极大的干扰了实验结 果的准确性。制备琼脂糖凝胶偶联的Stat3抗体对于研宄Stat3的功能会带来很多便捷， 实验的准确性和稳定性也能够得到很好的控制。 (三）
【发明内容】

[0007] 本发明目的是提供一种基于Stat3氨基酸序列合成10段免疫原性强的抗原肽，筛 选出一种新的高效价的Stat3抗体，并将其制备成偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶；该方法中 制备的抗体效价高、特异性强。所得到的偶联Stat3抗体琼脂糖凝胶稳定性好，特异性和敏 感性强。在研宄Stat3的功能及筛选其结合蛋白更加便捷、准确；可以做成商业化产品，用 于Stat3蛋白相关的疾病中的功能研宄。
[0008] 本发明采用的技术方案是：
[0009] 本发明提供一种偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶，所述凝胶是将Stat3抗体偶联至 琼脂糖凝胶载体上制成偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶；所述Stat3抗体是由Stat3抗原多 肽经免疫反应后进行提取纯化而获得，所述Stat3抗原多肽的氨基酸序列为序列2、序列3、 序列5、序列8和序列9之一；
[0010] 序列 2 :DFDFNYKTLKSQGC ;序列 3 :PEADPGSAAPYLKT ;
[0011] 序列 5 :LYPDIPKEEAFGKY ;序列 8 :ESQEHPEADPGSAAPY ;
[0012] 序列 9 :KVSYKGDPIVQHRP。
[0013] 进一步，所述制备Stat3抗体的最优抗原多肽的氨基酸序列为序列3所示。
[0014] 进一步，所述琼脂糖凝胶为NHS活化的琼脂糖凝胶FF，更优选购自北京韦氏博慧 色谱科技有限公司CS-A30。
[0015] 进一步，所述偶联方法为：将Stat3抗体用pH8. 0的0. 2M碳酸氢钠水溶液溶解制 成10mg/ml偶联溶液；将琼脂糖凝胶用ImM盐酸水溶液抽滤清洗后，获得载体；将载体加入 偶联溶液中，4°C，震荡反应12小时，抽滤，滤饼用pH8. 0的0. 2M碳酸氢钠水溶液清洗后浸 入IOmM乙醇胺溶液中，室温震荡过夜，抽滤后用pH8. 0,0. 2M碳酸钠缓冲液清洗，去除洗涤 液即获得偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶；所述IOmM乙醇胺溶液是由pH8. 0、0. 2M碳酸钠缓 冲液配制，所述的载体与偶联溶液的体积比为I :1. 5?2,所述琼脂糖凝胶为NHS活化的琼 脂糖凝胶FF。
[0016] 进一步，所述Stat3抗体按如下方法制备：（1)将Stat3抗原多肽与载体偶联，制 成Stat3抗原多肽复合物；所述Stat3抗原多肽的氨基酸序列为序列2、序列3、序列5、序 列8和序列9之一所示；（2)用Stat3抗原多肽复合物进行免疫反应，收集含Stat3抗体的 血清，分离提取Stat3抗体，获得Stat3抗体。
[0017] 进一步，优选步骤（1)所述载体为钥孔血蓝蛋白。
[0018] 本发明所述抗原多肽的合成方法为本领域公知技术，但是关于抗原多肽的免疫原 性的情况未知，在本发明中我们通过后期检测筛选表明序列2、序列3、序列5、序列7、序列 8、序列9多肽序列制备的抗体通过ELISA检测和点杂检测表明结果阳性。蛋白免疫印迹鉴 定表明序列2、序列3、序列5、序列8、序列9多肽制备的抗体结果阳性。进一步通过检测细 胞内源性Stat3蛋白表明3号多肽序列制备的Stat3抗体效价和敏感性均为最优。3号多 肽为最优的制备Stat3抗体的抗原肽。
[0019] 本发明还涉及一种偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶在富集细胞中Stat3及其结合蛋 白中的应用。通过实验我们得到了偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶富集细胞中Stat3蛋白的 条件：IO 6个细胞加入500 μ 1的IP裂解液（P0013碧云天生物技术有限公司），4°C旋转Ih 使其充分裂解，20, OOOg离心20min，取上清，加入2 μ g偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶，4°C 混合过夜。之后用裂解液洗涤填料一次，再用PBS洗涤填料三次。该偶联Stat3抗体的琼 脂糖凝胶上可以富集细胞中的Stat3蛋白及其Stat3结合蛋白。该方法可用于相关的疾病 中Stat3功能的研宄。
[0020] 与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明所述Stat3抗体灵敏性好， 效价高；关于偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶，目前市场上没有看到销售，当前多通过在细胞 内过表达带标签的Stat3蛋白来筛选Stat3的结合蛋白，方法复杂流程长，而且没有直接筛 选内源性的Stat3结合蛋白真实可信；本发明中所得到的偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶可 以直接富集细胞中的Stat3蛋白及其Stat3结合蛋白，目前在市场上尚未发现同类产品，可 以做成商业化产品，用于Stat3蛋白相关疾病中的功能研宄。 (四）【专利附图】

【附图说明】
[0021] 图1为Stat3蛋白的结构示意图。
[0022] 图2为10条抗原多肽在Stat3蛋白中的位置。
[0023] 图3为抗原多肽的HPLC鉴定，A为1号抗原多肽，B为2号抗原多肽，C3号抗原多 肽，D为4号抗原多肽，E为5号抗原多肽，F为6号抗原多肽，G为7号抗原多肽，H为8号 抗原多肽，I为9号抗原多肽，J为10号抗原多肽。
[0024] 图4为抗原多肽的质谱鉴定，A为1号抗原多肽，B为2号抗原多肽，C3号抗原多 肽，D为4号抗原多肽，E为5号抗原多肽，F为6号抗原多肽，G为7号抗原多肽，H为8号 抗原多肽，I为9号抗原多肽，J为10号抗原多肽的HPLC鉴定。
[0025] 图5为ELISA鉴定抗血清效价图，2、3、4、5、7、8、9分别表示2、3、4、5、7、8、9号抗原 多肽制备的含Stat3抗体血清的抗体效价结果。
[0026] 图 6 为 Dot-Blot 鉴定 Stat3 抗体，2、3、4、5、7、8、9 分别表示 2、3、4、5、7、8、9 号抗 原多肽制备的Stat3抗体鉴定结果。
[0027] 图7为Stat3抗体检测过量表达的Stat3, 2、3、4、5、7、8、9分别表示2、3、4、5、7、8、 9号抗原多肽制备的Stat3抗体检测结果，其中泳道A表示293T细胞未转染Myc-Stat3表 达载体蛋白样本；泳道B表示293T细胞转染Myc-Stat3表达载体蛋白样本，蛋白内含有高 丰度的Stat3蛋白；泳道M为Marker，从上之下的前三条带依次为170kd、130kd、95kd。箭 头指示位置为Stat3蛋白被抗体识别到的阳性信号的位置。
[0028] 图8为Stat3抗体检测Pc-9细胞中内源性Stat3,2、3、5、8、9分别为2、3、5、8、 9号抗原多肽制备的Stat3抗体，对照为商业化的Stat3抗体（Santa Cruz公司，货号为 sc-482);其中泳道M为Marker，从上之下的前三条带依次为170kd、130kd、95kd ;泳道S为 人肺癌细胞PC9总蛋白样本。
[0029] 图9为Stat3抗体填料纯化过量表达的Stat3蛋白，A为用细胞总蛋白进行鉴定 的图：泳道1为293T细胞总蛋白，泳道2为Myc纯化柱纯化后的蛋白（箭头指示位置为 Myc-Stat3蛋白）；B为用细胞浆蛋白和细胞核蛋白两种细胞组分蛋白鉴定：泳道1为293T 细胞的细胞浆总蛋白，泳道2为293T细胞的细胞核总蛋白，泳道3为Stat3抗体填料纯化 细胞衆中Myc_Stat3蛋白，泳道4为偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶纯化细胞核中Myc_Stat3 蛋白，泳道M为Marker从上之下的分子量（kd)依次为：170、130、95、70、55、40、35、25。
[0030] 图10为偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶纯化内源性的Stat3蛋白电泳图，泳道1为 人肺癌细胞PC9总蛋白；泳道2为偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶纯化人肺癌细胞PC9总蛋 白中内源性Stat3蛋白，泳道M为Marker从上之下的分子量（kd)依次为：170、130、95、70、 55、40、35、25,箭头指示位置为Stat3蛋白。
[0031] 图11为Stat3抗体填料纯化内源性的Stat3及其结合蛋白的质谱鉴定，A为Stat3 蛋白质谱鉴定分析；B为PKC质谱鉴定分析。 (五）【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0033] 如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《Making and Using Antibodies: A Practical Handbook》（CRC Press，Florida，2006)、《抗体制备与使用实验 指南》（科学出版社，北京，2010年）等手册以及本文所引用的参考文献中所列的方法来实 施。另外，实施例中所使用的材料除有特别说明外，均可通过商业途径从市场上购买。
[0034] 实施例1 :基于Stat3蛋白序列的新型抗Stat3抗体及其偶联载体的制备
[0035] 1、多肽的合成及偶联
[0036] 通过对Stat3蛋白序列（序列11所示，结构见图1)进行对比分析，委托杭州聚成 生物技术有限公司合成10条多肽，10条多肽序列为序列1-10所示，其在Stat3蛋白中的位 置如图2所示。
[0037] Stat3蛋白序列（序列11):
[0038] MAQWNQLQQLDTRYLEQLHQLYSDSFPMELRQFLAPWIESQDWAYAASKESHATLVFHNLLGEIDQQ YSRFLQESNVLYQHNLRRIKQFLQSRYLEKPMEIARIVARCLWEESRLLQTAATAAQQGGQANHPTAAVVTEKQQ MLEQHLQDVRKRVQDLEQKMKVVENLQDDFDFNYKTLKSQ⑶MQDLNGNNQSVTRQKMQQLEQMLTALDQMRRSI VSELAGLLSAMEYVQKTLTDEELADWKRRQQIACIGGPPNICLDRLENWITSLAESQLQTRQQIKKLEELQQKVS YKGDPIVQHRPMLEERIVELFRNLMKSAFVVERQPCMPMHPDRPLVIKTGVQFTTKVRLLVKFPELNYQLKIKVC IDKDS⑶VAALRGSRKFNILGTNTKVMNMEESNNGSLSAEFKHLTLREQRCGNGGRANCDASLIVTEELHLITFE TEVYHQGLKIDLETHSLPVVVISNICQMPNAWASILWY匪LTNNPKNVNFFTKPPIGTWDQVAEVLSWQFSSTTK RGLSIEQLTTLAEKLLGPGVNYSGCQITffAKFCKENMAGKGFSFffVffLDNIIDLVKKYILALffNEGYIMGFISKE RERAILSTKPPGTFLLRFSESSKEGGVTFTWVEKDISGKTQIQSVEPYTKQQLNNMSFAEIIMGYKIMDATNILV SPLVYLYPDIPKEEAFGKYCRPESQEHPEADPGAAPYLKTKFICVTPTTCSNTIDLPMSPRTLDSLMQFGNNGEG AEPSAGGQFESLTFDMELTSECATSPM
[0039] 1-10号抗原多肽序列：
[0040] I ：KVSYKGDPIVQHR ；2 ：DFDFNYKTLKSQGC ；
[0041] 3 ：PEADPGSAAPYLKT ；4 ：SKERERAILSTKP ；
[0042] 5 ：LYPDIPKEEAFGKY ；6 ：PESQEHPEADPGS ；
[0043] 7 ：LHQLYSDSFPMELR ；8 ：ESQEHPEADPGSAAPY ；
[0044] 9 ：KVSYKGDPIVQHRP ；10 ：TLKSQGDMQDLNGNN〇
[0045] 将10条抗原多肽序列进行HPLC和质谱的鉴定，结果如图3、4所示。
[0046] 条件为采用反相高效液相色谱测定合成的多肽，色谱柱为Boston Crest ODS, 4. 6*250mm, 5um。流速为 I. Oml/min，检测波长为 220nm，进样量为 IOul.流动相 Solvent A(0. I % Trif luoroacetic in 100% Acetonirile), Solvent B(0. I % Trif luoroacetic in 100% Water)，A和B等体积混合作为流动相。
[0047] 表1质谱检测条件

【权利要求】
1. 一种偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶，其特征在于所述凝胶是将Stat3抗体偶联至琼 脂糖凝胶载体上制成偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶；所述Stat3抗体是由Stat3抗原多肽 经免疫反应后进行提取纯化而获得，所述Stat3抗原多肽的氨基酸序列为序列2、序列3、序 列5、序列8和序列9之一所示； 序列 2 :DFDFNYKTLKSQGC ;序列 3 :PEADPGSAAPYLKT ; 序列 5 :LYPDIPKEEAFGKY ;序列 8 :ESQEHPEADPGSAAPY ; 序列 9 :KVSYKGDPIVQHRP。
2. 如权利要求1所述偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶，其特征在于所述琼脂糖凝胶为 NHS活化的琼脂糖凝胶FF。
3. 如权利要求1所述偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶，其特征在于所述Stat3抗原的氨 基酸序列为序列3所示。
4. 如权利要求1所述偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶，其特征在于所述偶联方法为：将 Stat3抗体用pH8. 0的0. 2M碳酸氢钠水溶液溶解制成10mg/ml偶联溶液；将琼脂糖凝胶用 ImM盐酸水溶液抽滤清洗后，获得载体；将载体加入偶联溶液中，4°C，震荡反应12小时，抽 滤，滤饼用PH8. 0的0. 2M碳酸氢钠水溶液清洗后浸入10mM乙醇胺溶液中，室温震荡过夜， 抽滤后用PH8. 0,0. 2M碳酸钠缓冲液清洗，去除洗涤液即获得偶联Stat3抗体的琼脂糖凝 胶；所述1〇禮乙醇胺溶液是由PH8. 0、0. 2M碳酸钠缓冲液配制，所述的载体与偶联溶液的体 积比为1 :1. 5?2,所述琼脂糖凝胶为NHS活化的琼脂糖凝胶FF。
5. 如权利要求1所述偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶，其特征在于Stat3抗体按如下方 法制备：（1)将Stat3抗原多肽与载体偶联，制成Stat3抗原多肽复合物；（2)用Stat3抗原 多肽复合物进行免疫反应，收集含Stat3抗体的血清，分离提取Stat3抗体，获得Stat3抗 体。
6. 如权利要求5所述偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶，其特征在于步骤（1)所述载体为 钥孔血蓝蛋白。
7. -种权利要求1所述偶联Stat3抗体的琼脂糖凝胶在富集Stat3蛋白及其结合蛋白 中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK104479023SQ201410457680
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年9月10日 优先权日:2014年9月10日
【发明者】徐莉, 秦樾, 季巾君, 程胤凯, 王鑫 申请人:浙江中医药大学