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一种恩诺沙星分子印迹整体柱的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种恩诺沙星分子印迹整体柱的制备方法，其步骤为：a、将模板分子恩诺沙星、功能单体和致孔剂混合，超声，反应，得复合物；b、在复合物中加入交联剂、引发剂，超声脱气，通氮气除氧，将所得混合液注入不锈钢柱内，封好，竖直静置水浴加热反应，得分子印迹整体柱；c、将合成的分子印迹整体柱连接高压输液泵上，用清洗液清洗除去致孔剂和模板分子，即得恩诺沙星分子印迹整体柱。本发明制得的整体柱具有较大的孔径结构、均匀而稳定的骨架以及较好的流体动力学特征，能够在较大的传质速率下具有较低的背压和稳定快速的传质能力，其柱内聚合物不容易收缩变形，不易于与柱壁剥离，使用寿命长，可循环利用，便于批量生产及推广应用。
【专利说明】一种恩诺沙星分子印迹整体柱的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物残留分析中固相萃取整体柱的制备方法，具体地说涉及一种对恩诺沙星抗生素具有特异性识别的分子印迹整体柱的制备方法。
【背景技术】
[0002]喹诺酮类(quinolones, QNs)抗菌药是指人工合成的含有4_喹酮母核的一类广谱抗微生物药，目前广泛使用的是第三代产品，如恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星。其中恩诺沙星(Enrofloxacin)，又名乙基环丙沙星、恩氟沙星，其化学系统命名为1-环丙基-7-(4-乙基-1-哌嗪基)-6-氟-1，4- 二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸,属于国家指定的氟奎诺酮类动物专用抑菌剂，是预防、诊断、治疗动物疾病的重要药物之一。兽药残留是给动物使用药物后蓄积或贮存在细胞、组织或器官内的药物原形和代谢产物，残留除了其毒副作用对人直接危害外，更为严重的是导致细菌产生较强的抗药性，病原体型和病型增多，新的疫病及复合感染不断增加，人畜共犯的疾病率升高。因此，欧盟、美国食品药品管理局(FDA)和中国农业部对这种可食性组织设立了最高药残限量。目前，对喹诺酮类药物残留的检测方法应用比较广泛的有酶联免疫法、化学发光法、毛细管电泳法、液相色谱法与液质联用等；而决定这些方法的准确性和精确度的关键步骤是样品的前处理，即从动物源性样品中萃取并富集所要测得药物。
[0003]分子印迹整体柱(molecularimprinting monolithic column)是分子识别机制和色谱制备技术的有机结合，它综合利用了分子印迹技术及整体柱的特性，以其具备制备简单、传质快、选择性高、易于分离富集等的优势，成为行业内萃取分离技术研究的热门课题。如CN101852791公开了一种离子液体中诺氟沙星分子印迹整体柱的制备方法，该方法将模板分子诺氟沙星、功能单体甲基丙烯酸超声溶解于由二甲基亚砜和N，N-二甲基甲酰胺组成的混合溶剂中超声溶解反应后，然后加入致孔剂1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐混合、超声，静置作用4-6小时形成复合物，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯、引发剂偶氮二异丁腈，超声脱气，注入不锈钢柱，水浴，清洗去除致孔剂和模板分子，得到诺氟沙星分子印迹整体柱。CN101246150公开了一种四环素分子印迹整体柱的制备，将四环素超声溶解于极性溶剂中，然后加入功能单体甲基丙烯酸、致孔剂环乙醇等混合反应后，再加入交联剂乙二醇二甲基烯酸酯、引发剂偶氮二异丁腈混合反应，超声脱气，注入不锈钢柱，水浴，清洗去除致孔剂和模板分子，得到四环素分子印迹整体柱。上述方法虽然制备简单、避免繁琐的研磨过程、分子识别性能好，能够实现对特定药残进行高效分离、富集和纯化，但是采用上述方法制备的分子印迹整体柱经使用发现，其耐压性差，连接到液相色谱高压泵上其流速一般限制在0.8 mL/min以内，分离效率较低，柱内聚合物骨架不稳定，在使用过程中受压容易收缩变形，容易与柱壁发生剥离，寿命较短。这些问题极大地限制了其在商业上的推广应用。

【发明内容】
[0004]本发明的目的就是提供一种对恩诺沙星抗生素具有特异性识别的分子印迹整体柱的制备方法，以解决现有方法制备的分子印迹整体柱存在聚合物骨架不稳定、容易收缩变形、容易与管壁剥离、耐压性差、分离效率低、寿命短、不可循环使用的问题。
[0005]本发明的目的是这样实现的:一种恩诺沙星分子印迹整体柱的制备方法，包括以下步骤:
a、将模板分子恩诺沙星、功能单体和致孔剂按摩尔体积比为Imol: 4 mol: 4.8 mL混合，超声，反应2 h，得复合物；其中所述功能单体是由甲基丙烯酸和甲基丙烯酸羟乙酯按摩尔比为1:1组成的混合物，所述致孔剂是由甲苯、十二醇和聚乙二醇-200按体积比为1:4:1组成；
b、在所述复合物中加入交联剂和引发剂,超声脱气10min,通氮气除氧20 min,将所得混合液注入不锈钢柱内，封好，竖直静置在55°C水浴环境中反应24 h，得分子印迹整体柱；所述交联剂与模板分子的摩尔比为15: 1，其中交联剂是由乙二醇二甲基丙烯酸酯和三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯按摩尔比为2:1组成的混合物；所述引发剂为偶氮二异丁腈，所述引发剂的用量为模板分子、功能单体、混合溶剂、致孔剂和交联剂添加总质量的1% ;
C、将步骤b所合成的分子印迹整体柱连接在高压输液泵上，用清洗液清洗去除致孔剂和模板分子，即得恩诺沙星分子印迹整体柱。
[0006]本发明步骤c所述清洗液为体积比为4:1的甲醇/冰醋酸溶液；也可按照现有技术中常规用料和用量选用。
[0007]本发明选择了最佳组分及特定组分比例的功能单体、致孔剂、交联剂以及引发剂，通过功能单体(甲基丙烯酸和甲基丙烯酸羟乙酯按摩尔比为1:1)和交联剂(乙二醇二甲基丙烯酸酯和三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯按摩尔比为2:1)的协同作用，制备了对恩诺沙星具有特异性识别的分子印迹整体柱，该整体柱不仅制备简单易行，重现性好，可直接在不锈钢柱中合成，无需研磨就可应用为色谱固定相，而且所制得的整体柱亲和力强，选择性好，具有多功能基团和较好的分子专一性识别位点；更重要的是，该分子印迹整体柱具有较大的孔径结构、均匀而稳定的骨架以及较好的流体动力学特征，连接到液相色谱高压泵上能够承受的流速可达2.0 mL/min,并能实现在较大的传质速率下具有较低的背压和稳定快速的传质能力，从而使得整体柱在分离富集有效成分时聚合物不容易收缩变形以及与柱壁剥离。此外，由于该整体柱在使用之后完好无损，所以使用后的整体柱经过洗脱处理，可以循环利用。
[0008]本发明制备的分子印迹整体柱可作为预分离富集柱，在线固相萃取-液相色谱联用来分析食物中抗生素类药物残留，其制备方法重现性好，分离效率高，使用寿命长，便于批量生产及推广应用。
【专利附图】

【附图说明】
[0009]图1为实施例1制备的分子印迹整体柱MIPl的SEM图。
[0010]图2为对比例I制备的分子印迹整体柱MIP2的SEM图。
[0011]图3-8分别为对比例6-11制备的分子印迹整体柱MIP7-MIP12的SEM图。
[0012]图9中a和b分别为对比例12和实施例1制备的分子印迹整体柱的耐压测试图。【具体实施方式】
[0013]实施例1
在锥形瓶中，称取0.5 mmol的恩诺沙星,加入0.4 mL甲苯，1.6 mL十二醇和0.4 mL聚乙二醇-200 (PEG-200)，超声混合后，加入功能单体甲基丙烯酸(MAA) 1.0 mmol和甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA) 1.0 mmol，使之相互作用2 h以形成复合物。再加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)5.0 mmol和三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TMPTA)2.5 mmol，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)30 mg,溶液经过超声脱气10 min,通氮气除氧20 min,然后将此混合液注入到不锈钢色谱柱(50 mmX4.6 mm)中，密封。竖直静止在55°C水浴中反应24 h。当反应结束后，冷却到室温，取出合成的色谱柱，去掉密封头，将其连接到液相色谱泵上，用甲醇/冰醋酸(4:1，v/v)溶液清洗除去致孔剂和模板分子，得到聚合物为MIP1，见图1。
[0014]对比例I
加入功能单体MAA (2.0 mmol)，不加入HEMA，其它同实施例1，可得MIP2，见图2。
[0015]对比例2
加入功能单体HEMA (2.0 mmol)，不加入MAA，其它同实施例1，可得MIP3。
[0016]对比例3
加入功能单体MAA (0.5 mmol)和HEMA (1.5 mmol)，其它同实施例1，可得MIP4。
[0017]对比例4
加入功能单体MAA (1.5 mmol)和HEMA (0.5 mmol)，其它同实施例1，可得MIP5。
[0018]对比例5
加入致孔剂十二醇(2.0 mL)，不加聚乙二醇-200，其它同实施例1，可得MIP6。
[0019]对比例6
加入致孔剂十二醇(1.4 mL)、甲苯(0.6 mL)和PEG-200 (0.4 mL)，其它同实施例1，可得MIP7，见图3。
[0020]对比例7
加入致孔剂十二醇(1.4 mL)、甲苯(0.4mL)和PEG-200 (0.6 mL)，其它同实施例1，可得MIP8，见图4。
[0021]对比例8
加入交联剂EDMA (7.5 mmol)，不加入TMPTA，其它同实施例1，可得MIP9，见图5。
[0022]对比例9
加入交联剂EDMA (10 mmol)，不加入TMPTA，其它同实施例1，可得MIP10，见图6。
[0023]对比例10
加入交联剂TMPTA (7.5 mmol)，不加入EDMA，其它同实施例1，可得MIP11，见图7。
[0024]对比例11
加入交联剂TMPTA (10 mmol)，不加入EDMA，其它同实施例1，可得MIP12，见图8。
[0025]对比例12
加入功能单体(MAA, 2.0 mmol)、交联剂EDMA (7.5 mmol),致孔剂甲苯(0.40 mmol)和十二醇(2.0 mmol)，不加入其它功能单体、交联剂和致孔剂，其它步骤同实施例1，可得MIP13。
[0026]本发明的实施例1及对比例1-12的原料组成如表I所示，制备方法同实施例1。[0027]本发明中实施例与对比例制得产品经测试，其技术指标如表2和图9所示。
[0028]实施例2分子印迹整体柱的性能检测
(I)动态吸附容量的检测方法:将实施例和对比例制备的分子印迹整体柱连接到色谱仪上，以乙腈/水(25/75, v/v)为流动相在0.8 mL/min的流速下冲洗柱子,并在280 nm下监测，直到基线稳定；然后将整体柱从HPLC系统中撤出，以含有恩诺沙星1.0 mg/mL的乙腈/水(25/75，v/v)溶液为流动相，充分冲洗从流动相入口至色谱柱的管路；再将整体柱接回到色谱系统中，继续以恩诺沙星的乙腈/水(25/75)溶液为流动相，仍然在0.8 mL/min的流速下进行色谱实验，记录检测信号就可以得到动态穿透。通过穿透曲线可以计算得到动态吸附容量，其计算公式如下:
Q = (Wt0) FC/m
其中，t5(W为穿透50%所需时间，t0为死时间，F为体积流速，C为上样液的浓度，m为吸附介质的质量。
[0029](2)耐压性的检测方法:按照对比例12的方法制备的整体柱，并将实施例1制备的分子印迹整体柱分别连接到液相色谱高压泵上，在流速2.0 mL/min下，进行长时间的耐压性测试，记录柱子压力发生明显波动的时间点，以背压为纵坐标，耐压时间为横坐标作图。
[0030]检测结果:
从表2可以看出:实施例1的骨架很稳定，通透性好，其吸附容量较对比例1-5更高。同时，由于对比例6-12骨架稳定性差、通透性差、柱内聚合物容易变形收缩，所以无法对其进行吸附能力测试；此外，从实施例1及部分对比例的耐压测试实验数值可以得出:本发明在众多功能单体、交联剂、致孔剂以及引发剂类型中选择了最佳的组分及组分比例，制备得到的分子印迹整体柱，其背压值最小，能够在流速2.0 mL/min下，耐压时间达到120 h以上，且骨架稳定，传质能力好，其各项指标性能明显优于现有技术。
[0031]由图9中b显示可知:实施例1制备的分子印迹整体柱在2.0 mL/min的流速下60h的耐压测试中，其背压变化较小，未出现任何异常波动，说明其柱内聚合物骨架稳定，传质能力好。而图9中a (对比例12制备的分子印迹整体柱)在0-35 h内背压稳定，在35_37h时，柱内聚合物构架发生塌陷变形，柱内聚合物与柱壁发生剥离，背压迅速增大，整体柱已经损坏。
[0032]本发明所有实施例所用的原材料均为市售产品，所用的分析仪器为岛津LC-20A液相色谱仪。
[0033]表I实施例及对比例制备过程中部分物质的添加用量
【权利要求】
1.一种恩诺沙星分子印迹整体柱的制备方法，其特征是，包括以下步骤: a、将模板分子恩诺沙星、功能单体和致孔剂按摩尔体积比为Imol: 4 mol: 4.8 mL混合，超声，反应2 h，得复合物；其中所述功能单体是由甲基丙烯酸和甲基丙烯酸羟乙酯按摩尔比为1:1组成的混合物，所述致孔剂是由甲苯、十二醇和聚乙二醇-200按体积比为1:4:1组成； b、在所述复合物中加入交联剂和引发剂,超声脱气10min,通氮气除氧20 min,将所得混合液注入不锈钢柱内，封好，竖直静置在55°C水浴环境中反应24 h，得分子印迹整体柱；所述交联剂与模板分子的摩尔比为15: 1，其中交联剂是由乙二醇二甲基丙烯酸酯和三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯按摩尔比为2:1组成的混合物；所述引发剂为偶氮二异丁腈，所述引发剂的用量为模板分子、功能单体、混合溶剂、致孔剂和交联剂添加总质量的1% ; C、将步骤b所合成的分子印迹整体柱连接在高压输液泵上，用清洗液清洗去除致孔剂和模板分子，即得恩诺沙星分子印迹整体柱。
2.根据权利要求1所述恩诺沙星分子印迹整体柱的制备方法，其特征是，步骤c所述清洗液为体积比为4:1的甲醇/冰醋酸溶液。
【文档编号】G01N30/56GK103884803SQ201410140078
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月9日 优先权日:2014年4月9日
【发明者】秦新英, 张利萍, 吕运开, 杨磊 申请人:河北大学