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专利名称：一种脂联素浓度的测定方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种脂联素浓度的测定方法及其应用。
背景技术：
脂联素(APN)是一种由脂肪细胞合成、分泌的细胞因子，1995年由Scherer等在小鼠3T3脂肪细胞中首次发现。编码脂联素基因在人类定位于染色体3q27，大小为17kb，包含3个外显子和2个内含子。全基因组扫描显示该区域存在2型糖尿病和代谢异常综合征的易感位点。脂联素在人体是一个在胰岛素敏感性和炎性通路中起重要作用的脂肪组织分泌的蛋白质。临床研究发现脂联素与肥胖、糖尿病、冠心病、胰岛素抵抗密切相关，具有抗动脉粥样硬化形成、抗炎症和血管损伤后抗内膜增生的特性。目前的体外细胞培养及组织培养实验证实脂联素可能通过以下几种机制直接作用于动脉粥样硬化的形成(I)脂联素通过激活环磷酸腺苷-蛋白激酶A(cAMP-PKA)信号通路来调控内皮细胞的炎症反应。(2)抑制巨噬细胞的功能，可抑制前体巨噬细胞的生长，抑制内皮细胞粘附因子的表达，抑制巨噬细胞对胆固醇酯的摄取，从而抑制巨噬细胞向泡沫细胞的转化。(3)抑制内皮细胞、平滑肌细胞的分化、增殖与迁移[41-43]。(4)脂联素通过减少血浆游离脂肪酸以及肌肉和肝脏内的甘油三脂含量减弱了胰岛素抵抗，改善糖、脂代谢紊乱。由此可见脂联素既可直接作用于冠状动脉粥样硬化的形成过程，又可通过引起与冠状动脉硬化形成有关的一系列危险因素的变化而间接影响血管病变的发生与发展。人体实验已证实，APN与机体胰岛素敏感性之间存在很强的相关性RI程度越高，APN血浆水平越低；反过来，APN水平升高可明显改善RI，APN可能是通过以下机制来改善胰岛素敏感性(I)脂联素可增加5-AMP活化蛋白激酶(AMPK)对乙酰辅酶A羧化酶(ACC)磷酸化作用，加快脂肪酸氧化，使胰岛素受体及受体后水平信号传导加速，减少肝脏糖异生，促进葡萄糖利用，从而达到改善胰岛素抵抗的目的。(2)脂联素对脂肪因子和脂肪酸引起的胰岛B细胞凋亡起到一定的对抗作用，促进葡萄糖的利用。(3)脂联素可增强胰岛素敏感性，并且可以改善胰岛B细胞功能，对疾病的发生起到双重保护作用。(4)抑制巨噬细胞的生长，减少其对脂质的摄取，从而减少巨噬细胞向泡沫细胞的转化，可结合血管损伤处胶原聚集在血管内膜下，参与炎症反应的终止过程。通过对不同类型糖调节受损人群大血管病变影响因素分析，评价糖尿病血浆脂联素(APN)在预测糖尿病前期大血管病变及其严重程度中的临床意义。

发明内容
本发明的目的是为了提供一种脂联素的测定方法及其应用，给预测糖尿病前期大血管病变的情况提供一种依据。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。—种脂联素浓度的测定方法，其步骤为(I)配置缓冲液标准品 APN (浓度分别为 200、100、50、25、12. 5,6. 25,3. 125,1. 56、0.78ng/ml,共 9 管)。(2)血浆标本IOml加入4990ml溶解缓冲液稀释至1:500，即为待测样本。(3)每管加入IOOml待测样品或标准品，再加入1-APN溶液、兔抗APN抗体，充分混匀，在室温下(20 25°C)孵育24小时过夜。(4)次日加入兔血清以及羊抗兔IgG抗体(对照管除外)，混匀，40C孵育20分钟，离心20分钟(3000 Xg)吸取上清液弃去。(5)测定各试管的δ射线量。(6)标准曲线绘制；在对数坐标纸上以标准品APN浓度为横坐标，Β/Β0 (%)为纵坐标绘制标准曲线。(7)根据样品Β/Β0 (%)从曲线上查得相应的APN浓度(ng/ml)。(8) APN浓度(ng/ml)计算:所得APN浓度(ng/ml)值乘以稀释倍数(500)再除以1000即为样本浓度。所述的IOX倍缓冲液(50ml)兔抗APN抗体(13ml)、IAPN标记物(13.5ml)、标准品(重组APN纯品0.75ml)、质控品I和2(重组APN纯品1ml)、兔载体(2ml)、沉淀试剂(羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗体、3%聚乙二醇)。购于美国Linco公司的放射免疫试剂盒，批内 CV < 6.21%,批间 CV < 9.25%。测定原理固定浓度的标记抗原与一定量抗血清温育抗体上抗原的结合位点是有限的。若加入未标记抗原，两者将竞争结合抗体上的有限固定位点，随着未标记抗原增加，与抗体结合的标记物将减少。将抗体结合物与游离的标记物分离，然后计数其中一部分或两部分，通过由标准品建立的标准曲线可查得未知样本中APN抗原的含量。本发明所述的测试方法，步骤简单，测量精准，通过对不同类型糖调节受损人群大血管病变影响因素分析，评价糖尿病血浆脂联素(APN)在预测糖尿病前期大血管病变及其严重程度中的临床意义。


图1为实施例四组间血浆APN浓度比较具体实施例方式下面结合附图与具体实施例进一步阐述本发明的技术特点:实施例2009-2011收集长宁区中心医院，临床疑似冠心病而住院行冠状动脉造影术患者共210例。行口服糖耐量试验，根据1999年WHO诊断标准糖代谢状态分为:正常糖代谢组(NGT) 42例(男性21例，女性21例，平均年龄60.3± 10.9岁)；空腹血糖调节受损组(IFG)36例(男性20例，女性16例，平均年龄62.8±8.2岁);糖耐量减低组(IGT) 92例(男性54例，女性38例，平均年龄61.5±9.9岁)；其中IGTl组44例，IGT2组48例，空腹血糖受损合并糖耐量减低组(IFG+IGT)40例(男性25例，女性15例，平均年龄61.0±9.5岁)。所有入选对象均排除肝、肾、甲状腺疾病，急性代谢紊乱、心功能衰竭、感染、自身免疫性疾病或结缔组织疾病、肿瘤及既往曾接受过PTCA或CABG治疗者。并未使用影响胰岛素分泌和胰岛素抵抗的药物。
诊断及分类标准:采用1999年世界卫生组织(WHO)分类诊断标准:空腹血糖调节受损(IFG),FPG6.1 〈7.0mmol/L，服糖后 2hPG〈7.8mmol/L;糖耐量减低(IGT)，FPG〈6.1mmoI/L，7.8mmol/L彡服糖后2hPG〈ll.lmmol/L ;空腹血糖受损合并糖耐量减低(IFG+IGT)，FPG6.1 〈7.0mmol/L，7.8mmol/L 彡服糖后 2hPG〈lL lmmol/L。对 IGT 人群以2hPG10.0mmol/L 为节点进一步分层，IGTl 组:7.8mmol/L 彡服糖 2hPG〈10.0mmol/L ；IGT2组:10.0mmol/L彡服糖后2hPG〈ll.lmmol/L。每例受试者空腹8-10小时后于次H晨8AM做75g葡萄糖耐量试验，将75g葡萄糖溶于250-300毫升水中，五分钟内饮完，分别于空腹、服糖后2小时抽取静脉血测空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、服糖后2h血糖(2hpost-challenge glucose, 2hPG),采用葡萄糖氧化酶法测定,在美国贝克曼全自动生化仪上完成。同时空腹检测甘油三脂(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-c)低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-c),并测空腹胰岛素(fasting insulin, FINS)、脂联素、C反应蛋白等指标。每例受试者均测体重(kg)、身高(m)、血压(mmHg)计算每位患者的体重指数BMI (kg/m2)=体重/身高2。评价胰岛素抵抗指标计算胰岛素抵抗指数 HOMA-1R= (FINS X FBG) /22.5。所有入选者在抽取上述空腹静脉血标本同时，留取2毫升静脉血，以296EDTA抗凝后离心15分钟，转速3000r/min，留取上清液血浆0.5毫升，放置_80°C冰箱保存，保存时间小于3个月。测定方法:(I)配置缓冲液标准品 APN (浓度分别为 200、100、50、25、12.5,6.25,3.125,1.56、0.78ng/ml,共 9 管)。(2)血浆标本IOml加入4990ml溶解缓冲液稀释至1:500，即为待测样本。(3)每管加入IOOml待测样品或标准品，再加入IAPN溶液、兔抗APN抗体，充分混匀，在室温下(20 25°C)孵育24小时过夜。(4)次日加入兔血清以及羊抗兔IgG抗体(对照管除外)，混匀，40C孵育20分钟，离心20分钟(3000 Xg)吸取上清液弃去。(5)测定各试管的&射线量。(6)标准曲线绘制；在对数坐标纸上以标准品APN浓度为横坐标，Β/Β0 (%)为纵坐标绘制标准曲线。(7)根据样品Β/Β0 (%)从曲线上查得相应的APN浓度(ng/ml)。(8) APN浓度(ng/ml)计算:所得APN浓度(ng/ml)值乘以稀释倍数(500)再除以1000即为样本浓度。各组血浆APN浓度的比较:糖耐量异常及空腹血糖受损合并糖耐量异常组的血浆APN浓度显著低于空腹血糖受损组，差异有统计学意义(P值分别为0.013和0.002);亦显著低于糖耐量正常组差异有统计学意义(P值分别为0.004和0.000);而糖耐量异常组和空腹血糖受损合并糖耐量异常组之间并无显著差异(P=0.419);与空腹血糖受损组相比，糖耐量正常组的APN浓度虽较高，但差异无统计学意义(P=0.779)。见表I和图1。表I四组间血浆APN浓度比较
权利要求
1.一种脂联素浓度的测定方法，其特征在于:其步骤为: (1)配置缓冲液标准品APN； (2)血浆标本IOml加入4990ml溶解缓冲液稀释至1:500，即为待测样本； (3)每管加入IOOml待测样品或标准品，再加入1-APN溶液、兔抗APN抗体，充分混匀，在20 25 °C温度下孵育24小时过夜； (4)次日加入兔血清以及羊抗兔IgG抗体，对照管除外，混匀，4°C孵育20分钟，离心20分钟吸取上清液弃去； (5)测定各试管的S射线量； (6)标准曲线绘制；在对数坐标纸上以标准品APN浓度为横坐标，Β/Β0(%)为纵坐标绘制标准曲线； (7)根据样品Β/Β0从曲线上查得相应的APN浓度；(8)APN浓度ng/ml计算:所得APN浓度ng/ml值乘以稀释倍数500再除以1000即为样本浓度。
2.根据权利要求1所述的一种脂联素浓度的测定方法，其特征在于:步骤I)中，缓冲液标准品 APN 的浓度分别为 200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78ng/ml,共 9 管。
全文摘要
本发明公开了一种脂联素浓度的测定方法，其步骤为配置缓冲液标准品APN。血浆标本10ml加入4990ml溶解缓冲液稀释至1:500，即为待测样本。每管加入100ml待测样品或标准品，再加入I-APN溶液、兔抗APN抗体，充分混匀，在室温下孵育24小时过夜。次日加入兔血清以及羊抗兔IgG抗体，混匀，4℃孵育20分钟，离心20分钟吸取上清液弃去。测定各试管的射线量。标准曲线绘制；在对数坐标纸上以标准品APN浓度为横坐标，B/B0为纵坐标绘制标准曲线。根据样品B/B0从曲线上查得相应的APN浓度。APN浓度计算。本发明所述的测试方法，步骤简单，测量精准，通过对不同类型糖调节受损人群大血管病变影响因素分析，评价糖尿病血浆脂联素在预测糖尿病前期大血管病变及其严重程度中的临床意义。
文档编号G01N33/60GK103076452SQ20121058802
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月30日 优先权日2012年12月30日
发明者宁光, 黄珊, 王卫庆, 顾卫琼, 洪洁 申请人:上海市内分泌代谢病研究所