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专利名称：一种检测孔雀石绿的酶联免疫试剂及方法
技术领域：
本发明涉及酶联免疫和兽药残留检测分析技术领域中的一种检测孔雀石绿的酶联免疫试剂及方法。

背景技术：
孔雀石绿(Malachite Green，MG)作为抗真菌剂，抗外生性寄生虫药和消毒剂被广泛使用于鱼类养殖业中。但是，最近研究显示，孔雀石绿具有高致癌性。所以，许多国家都将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。我国也于2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，禁止用于所有食品动物。然而由于孔雀石绿价格低廉，杀霉效果显著，因此在水产养殖中仍然禁而未绝。
为了防止孔雀石绿残留进入食物链，养殖者和政府监控部门需要一种快速、准确并且敏感的技术来检测它。目前，孔雀石绿残留检测有两种常规方法HPLC和LC/MS，但它们都比较昂贵且样品处理起来很复杂，检测费时。


发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测水产品和水体中孔雀石绿的酶联免疫试剂盒，它含有 (1)包被孔雀石绿抗原的酶联板或包被抗抗体的酶联板； (2)酶标记物； (3)孔雀石绿特异性抗体； (4)孔雀石绿标准品溶液； (5)底物显色液； (6)终止液； (7)浓缩洗涤液； (8)酶标记物稀释液； (9)浓缩复溶液。
本发明所述酶联板中孔雀石绿包被抗原是采用活泼酯法将孔雀石绿半抗原与牛丙种球蛋白进行偶联得到的，抗抗体可为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体，羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到，羊抗兔抗抗体是以兔源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到。制备酶联板过程中所用的包被缓冲液为pH值9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；包被孔雀石绿抗原或抗抗体的载体物质可为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等；载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等；所用的洗涤液为含有0.1％～0.5％吐温80，0.5％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液；所用的封闭液是含有8％～15％的马血清和1％惰性蛋白的溶液。
本发明所述试剂盒中酶标记物为酶标记抗抗体或酶标记孔雀石绿抗原，所用酶可为过氧化物酶或半乳糖甘酶，本发明优选过氧化物酶；酶标记物形式可为冻干粉、浓缩液和工作液；酶标记物工作液所用的稀释液为含有50％甘油(可防止放入-20℃环境的酶标记物冻结，亦可长时间保持酶标记物的生物活性)、1％的叠氮化钠防腐剂(便于保存)的溶液。
本发明所述试剂盒中酶标记抗抗体的制备步骤为 (1)抗抗体的制备以鼠源性抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体；或以兔源性抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗兔抗抗体。
(2)过氧化物酶标记抗抗体的制备将抗抗体与过氧化物酶(HRP)进行偶联，采用的方法是戊二醛法，采用戊二醛法使得抗抗体与辣根过氧化物酶的结合率升高，传统GA一步法偶联反应不易控制，反应速度快的分子易发生自生聚合，且偶联效率不高。为了解决这些问题，我们将一步法进行了改进，克服了一步法的缺点。首先在被偶联的两种分子中，与偶联剂反映较弱的分子先用过量的偶联剂活化，然后去处多余的偶联剂；第二步将一端与某种分子连接的偶联剂，通过改变反应条件而与另一种分子连接起来。二步法虽然操作较繁，但偶联效率提高，而且形成的同分子聚合物减少。
本发明所述试剂盒中酶标记抗原是采用活性酯法将标记酶与孔雀石绿半抗原进行偶联得到。
本发明所述试剂盒中孔雀石绿特异性抗体为鼠源单克隆抗体或兔源多克隆抗体，免疫原是采用活泼酯法将孔雀石绿半抗原与钥孔槭血蓝蛋白进行偶联得到的；抗体形式可为冻干粉、浓缩液、工作液；抗体稀释液为pH值8.2、0.05mol/L、含有3％马血清和5‰明胶的磷酸盐缓冲液。
本发明所述试剂盒中当标记酶为过氧化物酶时底物显色液为过氧化氢或过氧化脲、四甲基联苯胺硫酸盐混合溶液、终止液为0.1～0.5mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为半乳糖甘酶时，底物显色液为0.5mol/L磷酸钾缓冲液，终止液为2mol/L的柠檬酸缓冲液；浓缩洗涤液为含有0.1％～0.5％吐温80，0.5％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液；浓缩复溶液为含有20％甲醇、1％小牛血清(BSA)磷酸盐缓冲液。
本发明中首次选用了单底物液，相较于其他同类试剂盒的双底物液(使用时需加2种溶液)，操作更为简便。
本发明所述试剂盒中孔雀石绿标准品溶液为六个浓度梯度的孔雀石绿溶液，孔雀石绿稀释液为磷酸盐缓冲液。
本发明所述试剂盒中试剂的配制具体为 a.孔雀石绿标准溶液孔雀石绿系列标准溶液6瓶，浓度为0μg/L、0.01μg/L、0.05μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L，1～3ml/瓶。
b.包被缓冲液pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液。
c.封闭液8％～15％的马血清和1％惰性蛋白的溶液。
d.浓缩洗涤液含有0.1％～0.5％吐温80，0.5％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液，1瓶。
e.酶标记物酶标记抗抗体工作液或酶标记孔雀石绿抗原工作液，7～12ml/瓶，1瓶。
f.底物显色液为过氧化氢或过氧化脲与邻苯二胺(OPD)或四甲基联苯胺(TMB)的混合液； g.终止液1～2mol/L硫酸、盐酸或2mol/L氢氧化钠缓冲液，5～8ml/瓶，1瓶。
h.抗体工作稀释液为pH值8.2、0.05mol/L、含有3％马血清和5‰明胶的磷酸盐缓冲液。
i.浓缩复溶液含有20％甲醇、1％小牛血清(BSA)磷酸盐缓冲液，30～50ml/瓶，1瓶。
本发明所述检测水产品和水体中孔雀石绿的方法，包括了以下步骤 1.样品前处理 样品均质后称取5g于干净离心管中；加入10ml乙腈(100％)，充分混合30min；室温4000g离心10min移取上清液于离心管中，用JTBaker Alumina1000/6ml中性柱纯化3ml滤液(流速1-2滴/秒)(具体过程见后面4步)；加入3ml乙腈(100％)洗柱；加入3ml样品提取液过柱；收集样品提取液至一新管中。加入3ml乙腈(100％)洗柱，收集提取液至上一管中；用浓缩复溶液将混合洗出液稀释10倍(50ul乙腈提取液+450ul浓缩复溶液)；移取75ul进行分析。样本稀释倍数20 2.用试剂盒检测 向孔雀石绿偶联抗原包被的96孔酶标板微孔中加系列标准品或样本溶液(各2孔)75μl，再加入孔雀石绿抗体工作液75μl，用盖板膜封板，25℃恒温箱中反应30min。倒出孔中液体，每孔加入250μl洗涤液，10秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。每孔加入酶标记物150μl，用盖板膜封板，25℃恒温箱中反应30min，重复洗涤工作。加入底物显色液150μl，轻轻振荡混匀，25℃恒温箱避光显色30min。每孔加入终止液100μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定450nm每孔吸光度值。
3.检测结果分析 用所获得的每个浓度的标准溶液的吸光度平均值(B)，除以第一个标准溶液(0标准)的吸光度值(Bo)，再乘以100％，得到百分吸光度值。以孔雀石绿浓度的半对数为x轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，将样品溶液的百分吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品溶液中孔雀石绿所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品溶液中孔雀石绿的实际浓度。
本发明的检测原理为 当包被原为孔雀石绿偶联抗原时是将孔雀石绿半抗原与牛丙种球蛋白偶联物(CAP-BGG)吸附于固相载体上，加入样本或孔雀石绿标准品，然后加孔雀石绿特异性抗体，待测样品中残留的孔雀石绿和酶标板上包被的孔雀石绿抗原竞争孔雀石绿特异性抗体。再加入酶标记抗抗体进行酶活性的放大作用，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中孔雀石绿残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出孔雀石绿的浓度。
包被原为抗抗体时是将抗抗体吸附于固相载体上，加入孔雀石绿特异性抗体，再加入孔雀石绿酶标记抗原和样本或孔雀石绿标准品溶液，待测样本中残留的孔雀石绿和酶标记孔雀石绿抗原竞争孔雀石绿特异性抗体，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中孔雀石绿残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出孔雀石绿的浓度，与标准溶液颜色比较则可判断样品中孔雀石绿的浓度范围。
本发明的酶联免疫反应测试盒，利用竞争性的酶联反应原理，定量检测分析孔雀石绿在鱼、虾以及水样中的含量，具有特异性强、灵敏度高，样品预处理简单，检测时间短、检测样本量大等优点。



图1为孔雀石绿的检测标准曲线图。

具体实施例方式 以下描述了本发明的具体实施方式
，但不能将其理解为对本发明的限定，用本领域常规技术手段对其作出的替代、修改及改变均落在本发明的保护范围内。
实施例1 检测孔雀石绿的酶联免疫试剂盒组分的制备 1.抗原的合成 a.包被原的合成 将孔雀石绿采用衍生物法合成孔雀石绿半抗原，再将半抗原通过重氮化反应和牛丙种球蛋白载体蛋白用活泼酯法进行偶联得到。
b.免疫原的合成 将孔雀石绿半抗原通过重氮化反应和钥孔槭血蓝蛋白载体蛋白用活泼酯法进行偶联得到。
2.孔雀石绿鼠单克隆抗体的制备 a.动物免疫 采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以孔雀石绿半抗原与钥孔槭血蓝蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为300μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。
b.细胞融合和克隆化 取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按51比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
c.细胞冻存和复苏 取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成5×106个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
d.单克隆抗体的制备与纯化 采用体内诱生法，将8周龄的Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×106个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，20℃保存。
3.孔雀石绿兔多克隆抗体的制备 采用新西兰大白兔作为免疫动物，以孔雀石绿半抗原与钥孔槭血蓝蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为3mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。
4.酶标板的制备 本发明所述试剂盒中包被孔雀石绿抗原的酶联板或包被抗抗体的酶联板的制备步骤为 (1)用包被缓冲液将孔雀石绿半抗原与牛丙种球蛋白(BGG)偶联物或抗抗体以0.02～0.08μg/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗抗体稀释液； (2)向酶联板的每孔中加入100μl已经稀释好的抗原稀释液或抗抗体稀释液，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤1次，每次15～30s，拍干； (3)向酶联板的每孔中加入150～200μl封闭液，37℃温育1～2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
以上方法制备的酶联板具有很好的稳定性，经过冷热稳定性试验，酶联板的相关技术参数均在正常范围，且包被原有良好的特异性。
实施例2 检测孔雀石绿单克隆酶联免疫试剂盒的组建 组建检测孔雀石绿的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分 (1)包被孔雀石绿抗原的酶联板； (2)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体； (3)孔雀石绿鼠单克隆抗体； (4)孔雀石绿标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.01μg/L、0.05μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L； (5)底物显色液为过氧化氢或过氧化脲与邻苯二胺(OPD)或四甲基联苯胺(TMB)的混合液； (6)终止液为2mol/L的硫酸缓冲液； (7)浓缩洗涤液含有0.1％～0.5％吐温80，0.5％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液； (8)抗体稀释液为pH值8.2、0.05mol/L、含有3％马血清和5‰明胶的磷酸盐缓冲液。
(9)浓缩复溶液为含有20％甲醇、1％小牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液。
实施例3 检测孔雀石绿多克隆酶联免疫试剂盒的的组建 组建检测孔雀石绿的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分 (1)包被羊抗兔抗抗体的酶联板； (2)用碱性磷酸酯酶标记的孔雀石绿抗原； (3)孔雀石绿兔多克隆抗体； (4)孔雀石绿标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.01μg/L、0.05μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L； (5)底物显色液对硝基磷酸盐缓冲液； (6)终止液为2mol/L的氢氧化钠缓冲液； (7)浓缩洗涤液含有0.1％～0.5％吐温80，0.5％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液，1瓶； (8)浓缩复溶液为含有20％甲醇、1％小牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液。
实施例4 水产品样品中孔雀石绿残留的检测 (1)样品前处理； (2)用本发明所述的试剂盒进行检测； (3)分析检测结果。
本发明中样品前处理方法为 样本前处理需配制 将1mL乙腈与9mL提供的浓缩复溶液混合。
试剂盒提供的酶标记物是25倍浓缩的。每次检测前，浓缩的酶标记物用酶标记物稀释液进行稀释。例如，40ul25倍浓缩的酶标记物与1ml酶标记物稀释液混合以获得酶标记物工作液。
标样的配制 储存标样需要用10％乙睛/样品稀释缓冲液(V/V)稀释，配出0、0.01、0.05、0.1、0.5和1ug/L(ppb)的孔雀石绿标样。
1ppb标样40ul 100ppb储存液和4mL标样稀释液 0.5ppb标样1mL 1ppb标样和1mL标样稀释液 0.1ppb标样200ul 1ppb标样和1.8mL标样稀释液 0.05ppb标样1mL 0.1ppb标样和1mL标样稀释液 0.01ppb标样200ul 0.05ppb标样和800ul标样稀释液 (a)水产品(虾、鱼等)前处理方法 1.样品均质后称取5g于干净离心管中； 2.加入10ml乙腈(100％)，充分混合30min； 3.室温4000g离心10min； 4.移取上清液于离心管中，用JTBaker Alumina1000/6ml中性柱纯化3ml滤液(流速1-2滴/秒)(具体过程见后面4步)； 5.加入3ml乙腈(100％)洗柱； 6.加入3ml样品提取液过柱； 7.收集样品提取液至一新管中。
8.加入3ml乙腈(100％)洗柱，.收集提取液至7管中。
9.用浓缩复溶液将混合洗出液稀释10倍(50ul乙腈提取液+450ul浓缩复溶液)； 10.移取75ul进行分析。
样本稀释倍数20 (b)水样 取50μl澄清水样用于分析。
用本发明所述的试剂盒进行检测 1、从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室温(20-25℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、取出需要数量的微孔及框架，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
4、加标准品/样本75μl/孔到各自的微孔中，然后加抗体工作液75μl/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。25℃环境中反应30min。
5、取出将孔内液体甩干，用洗液250μl/孔洗板4-5次，每次间隔10秒，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破)。
6、每孔加入酶标记物150μl，盖板膜盖板后置25℃环境中反应30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗，4-5遍(同上)，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破)。
7、显色每孔加入底物150μl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色30min。
8、测定每孔加入终止液100μl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(在5min内读完数据)，测定每孔OD值。
结果判定 结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含孔雀石绿成反比。
1、粗略判定 用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.250，样本2的吸光度值为0.720，标准液吸光度值分别是0ppb为1.610；0.01ppb为1.380；0.05ppb为1.100；0.1ppb为0.620；0.5ppb为0.289；1ppb为0.108。则样本1的浓度范围是0.5ppb-1ppb；样本2的浓度范围是0.05ppb-0.1ppb。
2、定量分析 (1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100％，即
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值 (2)标准曲线的绘制与计算 以标准品百分吸光率为纵坐标，以孔雀石绿标准品浓度(ng/ml)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中孔雀石绿实际浓度。若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。
实施例5 水体样品中孔雀石绿残留的检测 1.样品前处理 直接取75ul澄清水样进行分析。
2.用试剂盒检测 方法同实施例4 3.检测结果分析 方法同实施例4 实验例1 标准品精密度试验 从每批按照实施例1(4)中的方法制备的酶联板中，各抽出10个微孔，测定0.5μg/L。标准溶液的吸光度值(OD值)，重复3次，计算变异系数CV％，结果见表1。。
表1 标准可重复性试验(CV％)
结果表明变异系数范围在4.3％～9.7％之间，符合了变异系数小于20％的规定，说明本试剂盒标准品精密度达到了标准。
实验例2 样本可重复性试验 以0.5μg/L浓度的孔雀石绿，添加到鱼虾和水体样品中，分别取三个不同批次的试剂盒各五个，每个浓度重复5次，分别计算变异系数，结果见表2、表3。
表2 鱼虾样品可重复性试验

表3 水体样品可重复实验
结果表明鱼虾样本变异系数均低于20％，水体样本的变异系数均低于20％，符合了变异系数小于25％的规定，说明本试剂盒测定样本的精密度达到了标准。
实验例3 抗体的特异性 特异性是指抗体对待测物的识别能力，强调抗体与待测物间结合反应的专一性和对结构相近或相关物质的区分能力。特异性取决于待测物与其他物质的交叉反应。在竞争分析中，不同物质的交叉反应率可用如下公式计算 交叉反应率(％)＝IC50(竞争物)/IC50(待测物)*100 实验例4 试剂盒的准确度试验 取两个浓度的孔雀石绿标准品溶液，分别为0.5μg/kg(L)和1μg/kg(L)，分别对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，分别计算回收率。
表4 试剂盒的准确度
结果表明鱼虾的添加回收率在78％～98％之间，水样添加回收率在80％～98％之间。
实验例5 试剂盒保存条件为2～8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、孔雀石绿添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒在2～8℃可以保存12个月以上。
实验例6 取两个浓度的孔雀石绿标准品溶液，分别为50μg/kg(L)和100μg/kg(L)，分别对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，根据实验数据绘出曲线分别计算其回收率。
标准液吸光度值分别是0ppb为2.045；0.01ppb为1.800；0.05ppb为1.235；0.1ppb为0.850；0.5ppb为0.350；1ppb为0.133 样本液吸鱼样的光度值空白管为2.015；0.5ppb为0.36；0.381；0.343；0.359；1ppb为0.135；0.143；0.142；0.150；水样空白管为1.995；0.5ppb为0.361；0.354；0.367；0.384；1ppb为0.142；0.139；0.152；0.148；根据标准品OD值制定标准曲线(图1) 表5 试剂盒的准确度
结果表明在鱼中添加的回收率在84％～99％之间，水样中添加回收率在82％～96％之间。
权利要求
1.一种检测水产品和水体中孔雀石绿的酶联免疫试剂盒，其特征是，它含有
(1)包被孔雀石绿抗原的酶联板或包被抗抗体的酶联板；
(2)酶标记物；
(3)孔雀石绿特异性抗体；
(4)孔雀石绿标准品溶液；
(5)底物显色液；
(6)终止液；
(7)浓缩洗涤液；
(8)酶标记物稀释液；
(9)浓缩复溶液。
试剂盒中孔雀石绿包被抗原是采用活泼酯法将孔雀石绿半抗原与牛丙种球蛋白进行偶联得到的，抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体，羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到，羊抗兔抗抗体是以兔源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到。
2.如权利要求1所述的检测水产品和水体中孔雀石绿的酶联免疫试剂盒，其特征是，试剂盒中酶标记物为酶标记抗抗体或酶标记孔雀石绿抗原，所用酶为过氧化物酶或半乳糖甘酶；酶标记物形式为冻干粉、浓缩液或工作液。
3.如权利要求1所述的检测水产品和水体中孔雀石绿的酶联免疫试剂盒，其特征是，所用酶为过氧化物酶。
4.如权利要求2或3所述的检测水产品和水体中孔雀石绿的酶联免疫试剂盒，其特征是，试剂盒中酶标记孔雀石绿抗原是采用活性酯法将标记酶与孔雀石绿半抗原进行偶联得到。
5.如权利要求4所述的检测水产品和水体中孔雀石绿的酶联免疫试剂盒，其特征是，试剂盒中孔雀石绿特异性抗体为鼠源单克隆抗体或兔源多克隆抗体，免疫原是采用活泼酯法将孔雀石绿半抗原与钥孔槭血蓝蛋白进行偶联得到的；抗体形式为冻干粉、浓缩液或工作液；抗体稀释液为pH值8.2、0.05mol/L、含有3体积％马血清和5体积‰明胶的磷酸盐缓冲液。
6.如权利要求5所述的检测水产品和水体中孔雀石绿的酶联免疫试剂盒，其特征是，试剂盒中当标记酶为过氧化物酶时底物显色液为过氧化氢、过氧化脲或四甲基联苯胺硫酸盐混合溶液、终止液为0.1～0.5mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为半乳糖甘酶时，底物显色液为0.5mol/L磷酸钾缓冲液，终止液为2mol/L的柠檬酸缓冲液；浓缩洗涤液为含有0.1体积％～0.5体积％吐温80，0.5质量％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液；浓缩复溶液为含有20体积％甲醇、1体积％小牛血清的磷酸盐缓冲液。
7.如权利要求6所述的检测水产品和水体中孔雀石绿的酶联免疫试剂盒，其特征是，制备酶联板过程中所用的包被缓冲液为pH值9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；包被孔雀石绿抗原或抗抗体的载体物质为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶或琼脂糖凝胶；载体的形式是试管、微量反应板凹孔、小珠或小圆片；洗涤液为含有0.1体积％～0.5体积％吐温80，0.5％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液；封闭液是含有15体积％～30体积％的马血清和1％惰性蛋白的溶液。
8.如权利要求1-3和5-7任一所述的检测水产品和水体中孔雀石绿的酶联免疫试剂盒，其特征是，试剂盒中孔雀石绿标准品溶液为六个浓度梯度的孔雀石绿溶液，孔雀石绿稀释液为磷酸盐缓冲液，孔雀石绿标准溶液浓度为0μg/L、0.01μg/L、0.05μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L，1～3ml/瓶。
9.如权利要求4所述的检测水产品和水体中孔雀石绿的酶联免疫试剂盒，其特征是，试剂盒中孔雀石绿标准品溶液为六个浓度梯度的孔雀石绿溶液，孔雀石绿稀释液为磷酸盐缓冲液，孔雀石绿标准溶液浓度为0μg/L、0.01μg/L、0.05μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L，1～3ml/瓶。
10.一种检测水产品和水体中孔雀石绿的方法，包括了以下步骤
(1)样品前处理；
(2)用权利要求1-9任一项所述的试剂盒进行检测；
(3)分析检测结果。
全文摘要
本发明公开了一种检测孔雀石绿的酶联免疫试剂及方法，该酶联免疫试剂含有(1)包被孔雀石绿抗原的酶联板或包被抗抗体的酶联板；(2)酶标记物；(3)孔雀石绿特异性抗体；(4)孔雀石绿标准品溶液；(5)底物显色液；(6)终止液；(7)浓缩洗涤液；(8)酶标记物稀释液；(9)浓缩复溶液。利用该酶联免疫试剂定量检测分析孔雀石绿在鱼、虾以及水样中的含量，具有特异性强、灵敏度高，样品预处理简单，检测时间短、检测样本量大等优点。
文档编号G01N33/543GK101424686SQ20081020273
公开日2009年5月6日 申请日期2008年11月14日 优先权日2008年11月14日
发明者聂继斌, 俊 唐, 谭彩莲, 宏 杨, 温俊梅, 欣 齐, 成 李, 杨宗繁 申请人:深圳市绿诗源生物技术有限公司