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果蝇g蛋白偶联受体,核酸和相关方法

时间:2025-04-02    作者: 管理员


专利名称：：果蝇g蛋白偶联受体,核酸和相关方法
技术领域：
：本发明部分涉及编码新颖果蝇G蛋白偶联受体(DmGPCR)的核酸分子，新颖多肽，筛选与DmGPCR结合和/或调节DmGPCR活性的试验，结合DmGPCR的方法，试剂，例如DmGPCR抗体、检测编码DmGPCR核苷酸序列的引物和探针，包含本发明的抗体、引物和探针的试剂盒，包含DmGPCR、DmGPCR结合伴侣和DmGPCR调节剂的组合物，和用DmGPCR结合伴侣或调节剂控制昆虫群体的方法。
背景技术：
：人和其它生命形式是由活细胞组成的。生命体的细胞彼此沟通，从环境中获得信息和刺激的机制是细胞表面表达的细胞膜受体分子。已经鉴定出了许多这样的受体，并确定了它们的特征，有时根据其结构基序和信号转导特征分类成主要的受体超家族。这些家族包括(但不限于)配体门离子通道受体、依赖于电压的离子通道受体、受体酪氨酸激酶、受体蛋白质酪氨酸磷酸酶和G蛋白偶联受体。这些受体是将胞外信号翻译成细胞生理应答的首要联系。G蛋白偶联受体(即GPCR)构成了细胞表面受体的一大超家族，其特征是一个氨基末端胞外域、一个羧基末端胞内域和一个跨膜7次的蛇形结构。因此，这些受体有时也被称为7跨膜(7TM)受体。这7个跨膜域形成3个胞外环和3个胞内环，以及氨基和羧基末端结构域。受体的胞外部分起到了识别和结合一种或多种胞外结合伴侣(即配体)的作用，而胞内部分起到识别和与下游效应物分子相互沟通的作用。GPCR能与各种各样的配体结合，包括钙离子、激素、趋化因子、神经肽、神经递质、核苷酸、脂类、有味物质甚至光子。理所当然的，GPCR在许多细胞类型的正常(有时是异常的)功能中是重要的。一般见Strosberg，Eur.J.Biochem.，1991，196，1-10；Bohm等，BiochemJ.，1997，322，1-18。当某特定配体与其相应的受体结合时，该配体通常刺激受体而活化一特异性异三聚鸟嘌呤核苷酸结合调节蛋白(G蛋白)，该蛋白与受体的胞内部分或区域偶联。G蛋白进而将信号传递给细胞内的效应分子，从而刺激或抑制该效应分子的活性。这些效应分子包括腺嘌呤核苷酸环化酶、磷脂酶和离子通道。腺嘌呤核苷酸环化酶和磷脂酶是与第二信使分子cAMP、三磷酸肌醇和二酰甘油的产生有关的酶。通过依次发生的这些事件，胞外配体的刺激通过G蛋白偶联受体产生了胞内变化。这些受体各自都具有自身的特征性主要结构、表达模式、配体结合模式和胞内效应物系统。由于G蛋白偶联受体在细胞与其环境沟通中的重要作用，这些受体是引人注意的调节目标，例如可通过激活或拮抗这些受体进行调节。对于具有已知配体的受体，激动剂或拮抗剂的鉴定可特别针对增强或抑制配体的作用。例如，一些G蛋白偶联受体在疾病发生机理中起作用(例如某些作为HIV协同受体的趋化因子受体在AIDS病理发生中可能起作用)，因此是甚至在缺乏对于该受体的天然配体的了解下，都是治疗干预的有吸引力的目标。其它受体由于在本身是治疗干预的有吸引力的目标的组织或细胞类型中表达，也是治疗干预的有吸引力的目标。后一类受体的例子包括免疫细胞表达的受体，它们可能是抑制自身免疫应答或增强免疫应答，抵抗病原体或癌的靶子；大脑或其它神经器官和组织表达的受体，可能是治疗精神分裂症、抑郁、双相性精神障碍、或其它神经病的靶子。后一类受体也可用作鉴定和/或纯化(例如通过荧光活化的细胞分拣)表达受体的细胞亚型的标志。昆虫被认为是农业和人家庭环境中的主要害虫。昆虫也在动物和人身上寄生，在此被称为外寄生虫，导致发病和死亡。昆虫还是对植物、动物和人类传播病毒和寄生虫病的载体。因此，对于发现控制昆虫群体，驱除和/或杀死病原性或寄生虫物种的新方法有持续和迫切的需要。一种通过杀死或使昆虫瘫痪控制昆虫群体的方法是通过使用化学药剂，称作杀虫剂，它们是对昆虫有选择毒性的，也对其它无脊椎动物有潜在的毒性。目前杀虫剂对那些对农产品，包括庄稼和牲畜的害虫的控制有重大的价值。杀虫剂也用于人类居住环境，用于控制草地和花园害虫以及对人产生伤害或困扰的昆虫，例如叮人或蜇人的昆虫，苍蝇和蟑螂。杀虫剂还对于治疗或预防家畜和宠物中外寄生虫(包括跳蚤、虱子、扁虱、壁虱和蜇蝇)导致的疾病有巨大的价值。然而目前用作杀虫剂的化学物质并不是最佳的。一些对哺乳动物有明显的毒性，同时在某些靶昆虫中对它们的耐药性亦已产生。因此，存在对具有新作用机制的新颖选择性杀虫剂的需要。已知具有神经肽配体的昆虫GPCR的例子(见例如Li，等，EMBOJournal，1991，10，3221-3229；Li，等，J.Biol.Chem.，1992，267，9-12；Monnier，等，J.Biol.Chem.，1992，267，1298-1302；VandenBroeck，等，Int.Rev.Cytology，1996，164，189-268；Guerrero，Peptides，1997，18，1-5；Hauser，等，J.Biol.Chem.，1997，272，1002-1010；Birgul等，EMBOJ.，1999，18，5892-5900；Torfs等，J.Neurochem.，2000，74，2182-2189；和Hauser等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1998，249，822-828；Larsen，等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2001，286，895-901；Lenz，等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2001，286，1117-1122；Kubiak等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2002，291，313-320；Staubli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，99，3446-3451；Garczynski等，Peptides，2002，23，773-780)，Holmes等，InsectMolecularBiology，2000，(5)，457-465；Cazzamali等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，99，12073-12078；Cazzamali等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2002，298，31-36；Radford等，J.Biol.Chem.2002，277，38810-38817；Park等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，99，11423-11428；Kreienkamp等，J.Biol.Chem，10.1074/jbc.M206931200(2002年8月6日在线发表)和Mertens，等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2002，297，1140-1148。最近的相关专利申请Ebens，AllenJames，Jr.；Torpey，Justin；Keegan，KevinPatrick.NucleicacidsandpolypeptidesofDrosophilamelanogasterGprotein-coupledreceptorandtheiruseaspesticidalandpharmaceuticaltargets.PCTInt.Appl.(2001)，43pp.CODENPIXXD2WO0170981A220010927CAN135268323AN2001713564CAPLUS.Kravchik，Anibal.DrosophilaGprotein-coupledreceptors，genomicDNAandcDNAmoleculesencodingGPCRproteins，andtheirusesasinsecticidaltargets.PCTInt.Appl.(2001)，392pp.CODENPIXXD2WO0170980A220010927CAN135269068AN2001713563CAPLUS)。通常在无脊椎动物(例如昆虫)中发现的一般为4-12个氨基酸的一大类肽是被称作FMRF酰胺-相关肽(即FaRP)的一类神经肽。原型FMRF酰胺(FMRFa)肽的命名是由于在其C末端具有“FMRF”共有氨基酸序列，通常由(F，Y)(M，V，I，L)R(F，Y)NH2构成。作为神经肽，这些分子参与需要受控的神经肌肉活动的生命过程。虽然已显示一些神经递质和神经调节蛋白(包括神经肽)的作用是受体的配体，迄今未将鉴定到作为GPCR的配体的FaRP神经肽。含有保守FXGXR-酰胺基序的果蝇肽与哺乳动物速激肽(tachykinins)结构相关，因此造出了一个词“果蝇速激肽(drotachykinin)”(Siviter等，J.Biol.Chem.，2000，275(30)，23273-23280)。果蝇速激肽对昆虫肠的收缩有强大的刺激效果(皮下)。白细胞激肽是一组分布广泛的昆虫激素，它刺激肠蠕动和肠管液体分泌速度。在肠管中，它们的主要作用是通过与基侧膜上的受体结合提高氯渗透性。白细胞激肽只在卫星细胞中提高胞内钙作用(O’Donnell等，Am.J.Physiol.，1998，43，R1039-R1049)。咽侧体抑制素是一组重要的控制各种功能的昆虫神经激素，包括在变态中起到中心作用的保幼激素的合成以及不同种昆虫的生殖。最早的第一种果蝇咽侧体抑制素，Ser-Arg-Pro-Tyr-Ser-Phe-Gly-Leu-NH2(即果蝇抑制素(drostatin)-3)(SEQIDNO165)是从果蝇头部的提取物中分离的(Birgul等，EMBOJ.，1999，18，5892-5900)。近来，克隆出了一种果蝇咽侧体抑制素前激素原基因，它编码四种果蝇咽侧体抑制素Val-Glu-Arg-Tyr-Ala-Phe-Gly-Leu-NH2(果蝇抑制素-1)(SEQIDNO163)，Leu-Pro-Val-Tyr-Asn-Phe-Gly-Leu-NH2(果蝇抑制素-2)(SEQIDNO164)，Ser-Arg-Pro-Tyr-Ser-Phe-Gly-Leu-NH2(果蝇抑制素-3)(SEQIDNO165)，和Thr-Thr-Arg-Pro-Gln-Pro-Phe-Asn-Phe-Gly-Leu-NH2(果蝇抑制素-4)(SEQIDNO166)(Lenz等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2000，273，1126-1131)。第一种果蝇咽侧体抑制素受体是由Birgul等克隆的，显示由果蝇抑制素-3通过Gi/Go途径激活其功能(Birgul等，EMBOJ.1999，18，5892-5900)。最近克隆了第二种推测的果蝇咽侧体抑制素受体(即DARII)(Lenz等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2000，273，571-577)。DARII受体cDNA(登录号AF253526)编码与第一种果蝇咽侧体抑制素受体密切相关的蛋白。近来，我们(Larsen，等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2001，286，895-901)和其它人(Lenz，等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2001，286，1117-1122)揭示了咽侧体抑制素对DARII的功能性激活。近来，已克隆出果蝇咽侧体抑制素C型前激素原，它编码果蝇咽侧体抑制素CGln-Val-Arg-Tyr-Gln-Cys-Tyr-Phe-Asn-Pro-Ile-Ser-Cys-Phe-OH(Williamson等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2001，282，124-130)。成熟肽应当在N-末端具有pGlu，这是N-末端Gln环化的结果，得到pGlu-Val-Arg-Tyr-Gln-Cys-Tyr-Phe-Asn-Pro-Ile-Ser-Cys-Phe-OH(SEQIDNO183)；和在Cys6和Cys13之间的二硫键，与天蛾(Manducasexta)C型咽侧体抑制素pGlu-Val-Arg-Phe-Gln-Cys-Tyr-Phe-Asn-Pro-Ile-Ser-Cys-Phe-OH(SEQIDNO182)类似，它们仅在4位有所不同(Phe4对Try4)(Kramer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991，88，9458-9462)。Nichols等揭示了果蝇咽侧体抑制素-C的强烈和持续的肌肉收缩抑制，称其为平台线(FLT)肽(Nichols等Peptides，2002，23，787-794)。就我们所知，迄今未鉴定出任何昆虫C型咽侧体抑制素的受体。磺胺激肽(sulfakinin)是一类昆虫Tyr-磺化神经肽。它们显示与脊椎动物肽胃分泌素和缩胆囊素序列和功能上(肌肉性作用，刺激消化酶释放)的类似性。在果蝇中鉴定出编码两种磺胺激肽(也称作果蝇磺胺激肽)DSKI[Phe-Asp-Asp-Tyr(SO3H)-Gly-His-Met-Arg-Phe-酰胺](SEQIDNO160)和DSKII[Gly-Gly-Asp-Asp-Gln-Phe-Asp-Asp-Tyr(SO3H)-Gly-His-Met-Arg-Phe-酰胺](SEQIDNO161)的基因(Nichols，Mol.CellNeuroscience，1992，3，342-347；Nichols等，J.Biol.Chem.，1988，263，12167-12170)。C-末端七肽序列Asp-Tyr(SO3H)-Gly-His-Met-Arg-Phe-酰胺(SEQIDNO162)在迄今进化而广泛分离的昆虫种类中鉴定到的所有磺胺激肽中是相同的。在广泛多样的昆虫分类群中该七肽序列的保守性，包括磺化Tyr残基的存在，推测反映了这种亲肌性的“活性核心”在功能上的重要性(Nachman&Holman，于InsectNeuropeptidesChemistry，BiologyandAction，Menn，Kelly&Massler，编，AmericanChemicalSociety，Washington，D.C.，1991，pp.194-214)。近来，我们鉴定到果蝇的孤儿受体(DmGPCR9)是果蝇磺胺激肽受体(称作DSK-R1)，并将其与果蝇的激活肽，Met5→Leu修饰的果蝇磺胺激肽-1，Asp-Tyr(SO3H)-Gly-His-Leu-Arg-Phe-酰胺(SEQIDNO157)匹配(Kubiak等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2002，291，313-320)。新的非孤儿果蝇GPCR包括PRX酰胺肽、CCAP、corazonin和AKH(Park等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，99，11423-11428；Cazzamali等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2002，298，31-36)；白细胞激肽(Radford等，J.Biol.Chem.2002，277，38810-38817)；果蝇抑制素-C(Kreienkamp等，J.Biol.Chem，10.1074/jbc.M206931200(2002年8月6日在线出版))；FMRF酰胺(Cazzamali等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，99，12073-12078)；和神经肽F(Mertens，等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2002，297，1140-1148)的受体。
发明内容本发明涉及果蝇中新颖多肽，本文命名为DmGPCR(果蝇G蛋白偶联受体)的惊人发现，它显示对其它神经肽GPCR不同程度的同源性。本发明提供了编码这些之前未知的G-蛋白偶联受体的基因，这些基因编码的DmGPCR多肽；该多肽的抗体；使用多核苷酸和多肽的试剂盒，以及制备和使用先前所述的上述物质的方法。DmGPCR可能起到关键组分的作用，例如调节神经肽结合和/或信号传递。因此，DmGPCR可用于寻找能改变和/或控制结合，和/或通过神经肽或其它物质传递信号的新制剂。发明的这些和其它方面在下文中详述。在一些实施例中，本发明提供了纯化和分离的DmGPCR多肽，其具有在SEQIDNOs2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24之一列出的氨基酸序列或其含有DmGPCR特异性表位的片段。“表位特异性”指DmGPCR受体的一部分能够被DmGPCR特异性抗体所识别，如下详述。本发明的一个实施例包括纯化和分离的多肽，具有SEQIDNOs2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24中列出的完整氨基酸序列，如下文表4所示。这些氨基酸序列是从编码DmGPCR的多核苷酸序列(SEQIDNOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，或23，见下文表4)推测而来的。本文所用的术语“DmGPCR”的单数形式是指包括下面列出的由各多核苷酸序列编码的10种氨基酸序列的每一种。虽然提供的序列是具体的果蝇序列，本发明也将在其范围内包括DmGPCR的等位基因变体、脊椎动物和无脊椎动物形式。在一些实施例中，本发明提供了纯化的多核苷酸(例如cDNA、基因组DNA、合成性DNA、RNA或其组合，不论单链或双链)，具有编码本发明多肽的氨基酸序列的核苷酸序列。这些多核苷酸用于重组表达受体，也用于检测细胞中受体的表达(即用Northern杂交和原位杂交试验)。这些多核苷酸也用于设计反义和其它分子，以抑制或调控DmGPCR在培养细胞、组织或动物中的表达。从本发明的多核苷酸定义中特别排除的是宿主细胞的完整的分离的、非重组的天然染色体。本发明的多核苷酸可具有SEQIDNOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，或23中列出的任一序列。应理解由于通用遗传密码的简并性，存在许多其它多核苷酸序列也能编码具有SEQIDNOs2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24任一列出序列的DmGPCR。本发明还提供了含有编码哺乳动物多肽的多核苷酸序列的纯化和分离的多核苷酸，其中多核苷酸在以下杂交条件下a)在含有50％甲酰胺、1％SDS、1MNaCl、10％硫酸葡萄糖的杂交溶液中42℃杂交16小时；和b)在含有0.1％SSC，1％SDS的洗液中60℃漂洗2次，每次30分钟，与具有SEQIDNOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，或23任一列出的序列的多核苷酸杂交。杂交条件应当是在其它核苷酸分子存在下，仅仅与基因杂交的条件。在严格杂交条件下，仅仅高度互补的核酸序列杂交。这样的杂交条件可防止20个连续核苷酸中有1或2个错配的核酸杂交。在一些实施例中，本发明提供含有本发明多核苷酸的载体。这些载体用于例如在宿主细胞中扩增多核苷酸，以产生有用数量的多核苷酸。在一些实施例中，载体是表达载体，该载体中本发明的多核苷酸与含有表达控制序列的多核苷酸可操纵性连接。这些载体可用于重组产生本发明的多肽。在一些实施例中，本发明提供用本发明的多核苷酸或本发明的载体转化或转染(稳定或瞬时)的宿主细胞。如上所述，这些宿主细胞可用于扩增多核苷酸，也可用于表达该多核苷酸编码的DmGPCR多肽或其片段。在另一个实施例中，本发明提供了产生DmGPCR多肽(或其片段)的方法，包括步骤在营养培养基中培养本发明的宿主细胞，从细胞或培养基中分离多肽或其变体。由于DmGPCR是7次跨膜受体，应理解在一些应用，例如某些活性试验中，分离可能涉及分离含有该多肽的细胞膜，而另一些应用中可能需要更完全的分离。应理解胞外表位对于产生和筛选抗体和其它能与受体，例如DmGPCR结合的结合化合物是特别有用的。因此在另一个实施例中，本发明提供了纯化和分离的多肽，含有DmGPCR的至少一个胞外域(亦即，N-末端胞外域或3个胞外环之一)，例如DmGPCR的N-末端胞外域。本发明还包括纯化的多肽，含有DmGCPR的跨膜域，DmGPCR的与跨膜域连接的胞外环，DmGPCR与跨膜域连接的胞内环，DmGPCR的C-末端胞质区，及其融合蛋白。这些片段可以是天然受体的连续部分。然而，还应理解本文提供的DmGPCR基因和蛋白质序列的知识允许天然蛋白中不连续的各区域重组。在另一个实施例中，本发明提供了对本发明DmGPCR的特异性抗体。抗体特异性如下详述。然而特别指出的是先前文献所述的多肽产生的，并能够和DmGPCR幸运的交叉反应(例如由于两种多肽中都幸运的存在相似的表位)的抗体被视为“交叉反应性”抗体。这些交叉反应性抗体不是DmGPCR的“特异性”抗体。确定一种抗体是否对DmGPCR特异性的或是否能与另一种已知受体起交叉反应的，可用几种试验中的任一进行，例如蛋白质印迹试验，这是本领域熟知的。为了鉴定表达DmGPCR的细胞和调节DmGPCR-配体结合活性，可使用能特异性结合DmGPCR的胞外表位的抗体。在一种变化中，本发明提供单克隆抗体。产生这些抗体的杂交瘤也被视为本发明的一方面内容。在另一种变化中，本发明提供了含有多克隆抗体的无细胞组合物，其中至少一种抗体是对DmGPC特异性的本发明的抗体。从动物分离的抗血清是示范性组合物，是一种含有抗血清的抗体组分的组合物，该组分被悬浮在水或其它稀释剂、赋形剂或运载体中。在另一个相关实施例中，本发明提供了对特异性DmGPCR抗体的特异性的抗独特型抗体。众所周知，抗体含有能够用化学方法或通过重组技术分离的较小的抗原结合域。这些功能域本身是有用的DmGPCR结合分子，也可与毒素或其它多肽融合。因此，在另一个实施例中，本发明提供了含有DmGPCR特异性抗体的片段，其中片段和多肽与DmGPCR结合。通过非限制性实施例，本发明提供的多肽是单链抗体、CDR-移植抗体和人源化抗体。本发明范围内还包括组合物，含有与例如药物学上可接受的运载体调配的本发明的多肽、多核苷酸或抗体。本发明还提供了使用本发明抗体的方法。例如，本发明提供了调节DmGPCR配体结合的方法，包括步骤在抗体与受体结合的条件下，使DmGPCR与对DmGPCR专一性的抗体接触。本发明提供了在个体内诱导针对具有选自SEQIDNO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，和24的序列的多肽的免疫应答的方法。该方法包括对个体施用足够诱导免疫应答量的多肽。本发明还提供了鉴定与DmGPCR结合的化合物的试验。一种试验包括步骤(a)使含有DmGPCR的组合物与怀疑能结合DmGPCR的化合物接触；和(b)测定该化合物与DmGPCR间的结合。在一种变化中，该组合物含有表面表达DmGPCR的细胞。在另一种变化中，使用分离的DmGPCR或含有DmGPCR的细胞膜。这种结合可直接测定，例如通过使用标记的化合物，或可间接通过几种技术测定，包括测定该化合物诱导的DmGPCR的胞内信号传递(或测定DmGPCR信号传递水平的变化)。本发明还提供了使DmGPCR与结合伴侣结合的方法。该方法包括步骤(a)使含有DmGPCR的组合物与结合伴侣接触；和(b)使结合伴侣与DmGPCR结合。例如，DmGPCR可以是DmGPCR1(SEQIDNO1)，DmGPCR5(SEQIDNO9)，DmGPCR7(SEQIDNO17)，或DmGPCR8(SEQIDNO19)。结合伴侣可以是例如果蝇速激肽、白细胞激肽或咽侧体抑制素-C。果蝇速激肽(DTK)可以是例如DTK-1(SEQIDNO169)，Met8-DTK-2(SEQIDNO170)，DTK-2(SEQIDNO171)，DTK-3(SEQIDNO172)，DTK-4(SEQIDNO173)，和DTK-5(SEQIDNO174)。白细胞激肽(LK)可以是例如LK-I(SEQIDNO175)，LK-V(SEQIDNO176)，LK-VI(SEQIDNO177)，和LK-VIII(SEQIDNO178)，库蚊激肽(Culekinin)(SEQIDNO179)，软体动物白细胞激肽样肽，蜗牛激肽(lymnokinin)(PSFHSWSa)(SEQIDNO180)，和果蝇白细胞激肽样肽DLK-1(NSVVLGKKQRFHSWGa)(SEQIDNO181)，DLK-2(pGlu-RFHSWGa)(SEQIDNO182)和DLK-2A(QRFHSWGa)(SEQIDNO183)。咽侧体抑制素(AST)可以是例如AST-C(SEQIDNO184)或DST-C(SEQIDNO185)。其它结合伴侣包括但不限于SEQIDNO186和SEQIDNO187。本发明还包括鉴定DmGPCR和DmGPCR结合伴侣之间结合的调节剂，包括步骤(a)使DmGPCR结合伴侣与含有DmGPCR的组合物在存在和不存在推测的调节剂化合物时相接触；(b)检测结合伴侣和DmGPCR之间的结合；和(c)根据结合伴侣和DmGPCR之间在某推测的调节剂存在下的结合，与不存在该推测的调节剂下的结合相比减少或增加，鉴定该推测的调节化合物或调节剂化合物。例如，DmGPCR可以是DmGPCR5(SEQIDNO9)，DmGPCR7(SEQIDNO17)，或DmGPCR8(SEQIDNO19)。结合伴侣可以是例如果蝇速激肽、白细胞激肽或咽侧体抑制素。果蝇速激肽(DTK)可以是例如DTK-1(SEQIDNO169)，Met8-DTK-2(SEQIDNO170)，DTK-2(SEQIDNO171)，DTK-3(SEQIDNO172)，DTK-4(SEQIDNO173)，和DTK-5(SEQIDNO174)。白细胞激肽(LK)可以是例如LK-I(SEQIDNO175)，LK-V(SEQIDNO176)，LK-VI(SEQIDNO177)，和LK-VIII(SEQIDNO178)，库蚊激肽(SEQIDNO179)，软体动物白细胞激肽样肽蜗牛激肽(PSFHSWSa)(SEQIDNO180)，和果蝇白细胞激肽样肽DLK-1(NSVVLGKKQRFHSWGa)(SEQIDNO181，DLK-2(pGlu-RFHSWGa)(SEQIDNO182)，和DLK-2A(QRFHSWGa)(SEQIDNO183)。咽侧体抑制素(AST)可以是例如AST-C(SEQIDNO184)，或DST-C(SEQIDNO185)。在一种变化中，该组合物含有在其表面表达DmGPCR的细胞。在另一种变化中，使用DmGPCR或含有DmGPCR的细胞膜。结合可直接测定，例如通过使用标记的化合物，或可间接通过几种技术，包括测定该化合物诱导的DmGPCR的胞内信号传递(或测定DmGPCR信号传递水平的变化)。例如，可用激动剂诱导的[35S]GTPγS结合试验、cAMP试验(cAMP产生的诱导或抑制)、或用荧光成像平板阅读机(FLIPR)分析测定胞内钙水平来测定该功能。能刺激DmGPCR活性的DmGPCR结合伴侣可用作激动剂，来增强或延长DmGPCR信号传递，从而干扰正常活化的受体信号传递途径。封闭配体介导的DmGPCR信号传递的DmGPCR结合伴侣可用作拮抗剂，来干涉正常的DmGPCR信号传递并损伤受体介导的作用。另外，DmGPCR调节剂和DmGPCR多核苷酸和多肽可用于DmGPCR活性增强或损伤的疾病和状况的诊断试验中使用。在另一个方面，本发明提供了治疗外寄生虫导致的疾病或异常状况的方法，给予需要这种治疗的个体能调节选自SEQIDNO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24的外寄生虫多肽活性的物质。对外寄生虫导致的情况或疾病治疗有用的物质可在测定对治疗所述疾病或异常相应活性的一种或多种体外试验中显示阳性结果。能调节该多肽活性的物质包括但不限于反义寡核苷酸、激动剂和拮抗剂以及抗体。在另一方面，本发明提供检测样品中一种多肽，作为外寄生虫导致疾病或异常的诊断工具的方法，其中该方法包括步骤(a)使样品与核酸探针接触，该探针在杂交试验条件下与编码选自SEQIDNO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24的多肽的核酸目标区域杂交，所述探针含有编码多肽、其片段的核苷酸序列和/或序列和片段的互补序列；和(b)检测探针目标区域杂交子的存在或数量作为情况指标。适合本发明的核酸探测方法的测试样品包括例如细胞或细胞的核酸提取物，或生物液。用于上述方法的样品可根据试验形式、检测方法和要测试的组织、细胞或提取物性质改变。制备细胞的核酸提取物的方法是本领域已知的，并且可轻易改变，以获得与所用的方法相适应的样品。在一些实施例中本发明提供了DmGPCR的同源物，例如哺乳动物同源物。DmGPCR的哺乳动物同源物可在组织中表达，这些组织包括但不限于神经系统组织、胰脏(特别是胰岛组织)、垂体、骨骼肌、脂肪组织、肝脏、胃肠道和甲状腺。在一些实施例中，本发明提供了鉴定DmGPCR哺乳动物同源物的方法，包括步骤用选自SEQIDNOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，和23的核酸或其部分筛选哺乳动物核酸数据库或核酸文库，并确定是否数据库或文库的部分与该序列同源。本发明的另一个方面提供了通过对昆虫施用DmGPCR多核苷酸或多肽的结合伴侣或调节剂，以改变DmGPCR表达或活性，从而控制昆虫群体的方法。例如，昆虫可选自苍蝇、果蝇、壁虱、跳蚤、虱子、扁虱、和蜇蝇。DmGPCR结合伴侣可以是果蝇速激肽(例如，DTK-1(SEQIDNO169)，Met8-DTK-2(SEQIDNO170)，DTK-2(SEQIDNO171)，DTK-3(SEQIDNO172)，DTK-4(SEQIDNO173)，和DTK-5(SEQIDNO174))，白细胞激肽(e.g.，LK-I(SEQIDNO175)，LK-V(SEQIDNO176)，LK-VI(SEQIDNO177)，和LK-VIII(SEQIDNO178)，库蚊激肽(SEQIDNO179)，软体动物白细胞激肽样肽蜗牛激肽(PSFHSWSa)(SEQIDNO180)，DLK-1(SEQIDNO181)，DLK-2(SEQIDNO182)，和DLK-2A(QRFHSWGa)(SEQIDNO183))，或咽侧体抑制素(AST-C(SEQIDNO184或DST-CSEQIDNO185))。其它结合伴侣包括但不限于SEQIDNO186和SEQIDNO187。DmGPCR调节剂可以是抗DmGPCR抗体或DmGPCR反义多核苷酸。本发明的另一个实施例提供了预防或治疗外寄生虫在宿主中导致的疾病或病况的方法，包括对个体施用DmGPCR多核苷酸或多肽的结合伴侣或调节剂，以调节DmGPCR的表达或活性。本领域技术人员可从整篇申请，包括详述中理解本发明的其它特征或变化，这些特征都是本发明的部分。类似的，本文所述的发明的特征可以重新组合成其它实施例，它们也是本发明的部分，不论这些特征的组合是否在上文作为本发明的部分或实施例被提到过。另外，只有本文所述对本发明关键的那些限制才应被认为是关键的；本发明的变化，只要在本文中没有被提到是关键的，就被视为是本发明的一部分。优选实施方式详述本发明特别提供了编码果蝇G蛋白偶联受体(DmGPCR)或其部分的分离和纯化的多核苷酸，含有这些多核苷酸的载体，被这些载体转化的宿主细胞，制备DmGPCR的方法，使用上述多核苷酸和载体、分离和纯化的DmGPCR的方法，筛选调节DmGPCR活性的化合物的方法，和鉴定DmGPCR的哺乳动物、脊椎动物或无脊椎动物DmGPCR同源物的方法。本文件中进行了各种定义。大部分文字具有本领域技术人员赋予它们的含义。本文中特别在下面或在别处限定的文字具有作为本发明整体的情况下提供的含义，通常是本领域技术人员可理解的。应理解当列出序列组时，其组合或亚组也是被特别考虑的。例如，对于描述“SEQIDNOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，或23”，应理解本发明包括组合或亚组，包括但不限于SEQIDNO1和3；1和5；1，3和5等。本文所用的和本领域理解的术语“合成的”指纯粹化学方法产生的，相对于酶法产生的多核苷酸。“完全”合成的DNA序列因此是完全通过化学方法产生的，“部分”合成的DNA包括那些得到的DNA仅部分是用化学方法产生的。术语“区”指生物分子主要结构的一个物理上连续的部分。对于蛋白来说，区域指该蛋白质氨基酸序列的连续部分。本文所用的术语“功能域(domain)”指生物分子中对该生物分子的已知或怀疑的功能有贡献的结构部分。功能域可以和其区域或部分共同延伸。功能域还可掺入与特定区域，或该区域的全部或部分不同的生物分子的一部分。GPCR蛋白功能域的例子包括但不限于胞外(N-末端)、跨膜和胞质(即C-末端)功能域，它们和GPCR相似命名的区域共同延伸；GPCR7个跨膜区段中的每一个；和连接相邻跨膜区段的每个环区段(胞外和胞内环)。本文所用的术语“活性”指指示或揭示直接或间接结合；影响反应，即对某些接触或刺激的反应具有可测量的效果的各种可测量指标，包括例如，化合物与本发明的多肽或多核苷酸直接结合的亲和力，或例如在某些刺激或事件后对上游或下游蛋白质或其它功能的量的测定。本文所用的术语“抗体”意指完整的抗体，和Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv及其它片段。完整的抗体包括单克隆抗体，例如小鼠单克隆抗体，嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。本文所用的术语“结合”指两种蛋白质、或化合物、或相关蛋白或化合物、或其组合之间的物理或化学相互作用。结合包括离子、非离子、氢键、范德华力、疏水作用等。物理相互作用(结合)可以是直接或间接的，间接是通过或由于另一种蛋白质或化合物的作用而结合。直接结合意味着不通过或不是由于另一种蛋白质或化合物的作用，不通过其它具体的化学中间物的相互作用。本文所用的术语“化合物”指任何可鉴定的化学物质或分子，包括但不限于小分子、肽、蛋白质、糖、核苷酸或核酸，这些化合物可以是天然或合成的。本文所用的术语“互补”指一核酸分子的核苷酸单元之间的华生-克里克碱基配对。本文所用的术语“接触”意味着使化合物直接或间接物理接近本发明的多肽或多核苷酸而结合在一起。所述多肽或多核苷酸可以配制在任意数量的缓冲液、盐、溶液等中。接触包括例如，将该化合物置于含有编码GPCR或其片段的核酸分子或多肽的烧杯、微量滴定板、细胞培养瓶或微阵列，例如基因芯片等中。本文所用的词组“同源核苷酸序列”或“同源氨基酸序列”或其变体指在核苷酸水平或氨基酸水平具有至少特定百分数的同源性特征的序列。同源性核苷酸序列包括那些编码蛋白质同种型的序列。由于例如RNA的交替剪接，这些同种型可在统一生物的不同组织中表达。另外，同种型可以由不同基因编码。同源性核苷酸序列包括编码除了昆虫外的物种(包括但不限于哺乳动物)的蛋白质的核苷酸序列。同源性核苷酸序列还包括但不限于天然存在的等位基因变体和本文所列出的核苷酸序列的突变物。然而，同源性核苷酸序列不包括编码其它已知GPCR的核苷酸序列。同源性氨基酸序列包括那些编码保守氨基酸取代的氨基酸序列，和具有神经肽结合和/或信号传递活性的多肽。然而同源氨基酸序列不包括编码其它已知GPCR的氨基酸序列。可通过例如缺口程序(Wisconsin序列分析软件包，Unix第8版，GeneticsComputerGroup，UniversityResearchPark，Madison，WI)，使用默认设置来确定同源性百分数。该程序使用Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Math.，1981，2，482-489在此完整引入以供参考)。本文所用的术语“分离的”核酸分子指从其天然环境被取出的核酸分子(DNA或RNA)。分离的核酸分子的例子包括但不限于载体中包含的重组DNA分子，为此在异源宿主细胞中的重组DNA分子，部分或基本纯化的核酸分子，和合成性DNA或RNA分子。本文所用的术语“调节”意味着特定活性或蛋白质的量、质量或作用的提高或减少。本文所用的术语“增强的活性”指提高的活性。术语“受损的活性”指下降的活性。本文所用的术语“寡核苷酸”指一系列连接的核苷酸残基，它们碱基数量足够被用于聚合酶链式反应(PCR)。该短序列是基于(或根据下者设计的)基因组或cDNA序列，用于扩增、验证或揭示相同、相似或互补DNA或RNA在特定细胞或组织中的存在。寡核苷酸包括具有至少约10个核苷酸，多至约50个核苷酸，优选约15-30个核苷酸的DNA序列。它们是化学合成的并可用作探针。本文所用的术语“探针”指可变化长度的核酸序列，优选至少约10到至多6,000个核苷酸，视用途而定。它们用于检测相同、相似或互补核酸序列。通常从天然或重组来源获得较长长度的探针，具有高度特异性，比寡聚物杂交慢得多。它们可以是单链或双链，并且经精心设计在PCR、基于杂交膜、或ELISA样技术中具有专一性。当指多核苷酸时，“部分”或“片段”包括具有衍生出片段或部分的参比多核苷酸的至少14，16，18，20，25，50，或75个连续核苷酸的多核苷酸序列。当指多肽时，“部分”或“片段”包括具有衍生出片段或部分的参比多肽的至少5，10，15，20，25，30，35，或40个连续氨基酸的多肽序列。术语“预防”指减少生物接触或发生异常状况的可能性。术语“控制昆虫群体”或其变体指增加或减少群体中昆虫的数量。例如，控制昆虫群体的方法包括增加给定昆虫群体中有益昆虫的数量和减少给定昆虫群体中有害昆虫数量。术语“治疗”指具有疗效或至少部分减轻或停止生物体中的异常。本文所用的术语“个体”指昆虫、脊椎动物、无脊椎动物和哺乳动物。术语“疗效”指抑制或活化导致或负责异常或正常情况的因素。疗效在某种程度上缓解了一种或多种异常或正常情况的症状。疗效可以指以下一种或多种(a)细胞增殖、生长和/或分化的增加；(b)细胞死亡的抑制(即减缓或停止)；(c)退化的抑制；(d)某种程度上缓解了与情况有关的一种或多种症状；和(e)增强受影响细胞群的功能。可如本文所述鉴定显示针对异常或正常情况有效的化合物。要治疗的生物的状况可以是异常或正常的。术语“异常状况”指某些生物的细胞或组织的功能违背了该生物体内的正常功能。例如，异常状况可以与细胞增殖、细胞分化、细胞信号传递或细胞存活有关。词组“正常状况”指生物细胞或组织的正常功能。例如，正常状况可以与细胞增殖、细胞分化、细胞信号传递或细胞存活有关。术语“施用”指一种将化合物掺入生物体细胞或组织的方法。当在生物体内或生物体外存在该生物的细胞或组织时，可预防、治疗或诱导其状态。可在生物体外将细胞维持在细胞培养皿中或培养。为了生物体内的细胞，本领域中存在很多用于施用化合物的方法，包括但不限于口腔、腹膜内、皮下、注射和气溶胶给药。对于生物体外的细胞，本领域存在许多施用化合物的方法，包括但不限于细胞显微注射技术、转化技术和运载体技术。还可通过对一组必须改变生物个体信号转导途径的细胞施用化合物，预防、治疗或诱导情况。然后可监测施用化合物对生物功能的作用。个体可以是例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、家兔、豚鼠；陪伴动物(例如犬或猫)，牲畜动物(例如鸡、猪或牛)，山羊、马、猴、猿或人；蠕虫；或昆虫。“扩增”指与正常细胞比较，某细胞中DNA或RNA数量的增加。“扩增”用于RNA时是细胞中RNA可检测存在，因为在一些正常细胞中没有RNA的基线表达。在其它正常细胞中，存在基线水平的表达，因此在这些情况下扩增是检测到与基线水平相比至少1-2倍，优选更多。本文所用的术语“严格杂交条件”或“氧条件”指在探针、引物或寡核苷酸与其目标序列杂交，但不和其它序列杂交的条件。严格条件依赖于序列，在不同情况下可能是不同的。较长的序列在较高温度下专一性杂交。通常，严格条件比特定序列在特定离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低5℃。Tm是(在特定离子强度、pH和核酸浓度下)有50％与目标序列互补的探针与目标序列杂交平衡的温度。由于目标序列通常是过量存在的，在Tm，50％探针将是平衡的。通常，严格条件是盐浓度为少于1.0M钠离子，通常约0.01-1.0M钠离子(或其它盐)，pH7.0-8.3，温度对于短探针、引物或寡核苷酸(例如10-50个核苷酸)至少约30℃，对于长探针、引物或寡核苷酸至少60℃。严格条件还可通过加入去稳定剂，例如甲酰胺实现。氨基酸序列以从左到右，氨基到羧基的方向存在。氨基和羧基不存在于序列中。核苷酸序列仅以单链从5′到3′方向从左到右存在。核苷酸和氨基酸是以IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的形式，或(对于氨基酸)以三字母编码存在。多核苷酸本发明的基因组DNA含有本发明多肽的蛋白质编码区，也包括其等位基因变体。应广泛理解的是，对于许多基因，基因组被转录成RNA转录物，该转录物经过一次或多次剪接，其中转录物的内含子(即非编码区域)被除去，或“被剪去”。在本领域中，将能够通过任选的机制剪接，从而能够除去不同RNA序列，但仍然编码DmGPCR多肽的RNA转录物称为“剪接变体”，它也属于本发明。本发明理解的剪接变体因此是由同一原始基因组DNA序列编码的，但来自不同的mRNA转录物。等位基因变体是野生型基因序列的修饰形式，在染色体分离或接触产生基因突变的条件导致这种修饰。等位基因变体和野生型基因一样，也是天然存在的序列(与体外操纵产生的非天然存在的变体相反)。本发明还包括通过反转录编码DmGPCR的RNA多核苷酸得到的cDNA(通常随后进行互补链的第二链合成，得到双链DNA)。编码DmGPCR的DNA序列列于SEQIDNOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，或23。本发明的DNA可包含双链分子和互补分子(“非编码链”或“互补链”)，具有根据华生-克里克的DNA碱基配对原则与编码链不可分辨的序列。本发明也包括其它编码任何本发明的具体DmGPCR多肽的其它多核苷酸，它们的序列与本文的具体多核苷酸序列由于众所周知的通用核基因密码简并性有所不同。本发明还包括DmGPCRDNA的哺乳动物等物种的同源物。物种同源物有时被称作“直向同源物”，通常与本发明的DNA具有至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％的同源性。通常，相对于本发明多核苷酸的“同源性”百分数可计算成在排列序列和(如需要)引入缺口以实现最大序列相同性百分数后，与具有特定多核苷酸序列的DmGPCR序列中的核苷酸相同的候选序列中核苷酸碱基的百分数。本发明的另一个方面是用本文中公开的DmGPCR的核苷酸序列鉴定其它动物，包括哺乳动物、脊椎动物和无脊椎动物中的DmGPCR的同源物。本文中公开的任何核苷酸序列，或其部分可用作例如探针，用本领域技术人员公知的筛选方法筛选数据库或核酸文库，例如，基因组或cDNA文库，来鉴定同源物。本发明提供的多核苷酸序列信息使得用本领域熟知和常规实践的技术大规模表达编码的多肽成为可能。本发明的多核苷酸还能通过熟知的技术，例如Southern和/或Northern杂交，聚合酶链式反应(PCR)鉴定和分离编码相关DmGPCR多肽的多核苷酸，例如等位基因变体和物种同源物。相关多核苷酸的例子包括基因组序列，包括等位基因变体，和编码与DmGPCR同源的多肽的多核苷酸，以及共有一种或多种DmGPCR的生物、免疫和/或物理性质的结构相关多肽。还可通过Southern和/或PCR分析鉴定编码与DmGPCR同源的蛋白质的基因，用于在动物模型中的GPCR疾病。对DmGPCRDNA序列的知识还可通过用Southern杂交或聚合酶链式反应(PCR)能鉴定编码DmGPCR表达控制调控序列，例如启动子、操纵子、增强子、抑制子等的基因组DNA序列成为可能。本发明的多核苷酸还可用于杂交试验来鉴定细胞表达DmGPCR的能力。本发明的多核苷酸还可提供诊断方法的基�。糜诩鼙泶顳mGPCR而引起疾病状态的外寄生虫的存在，该信息用于诊断和选择治疗方法。本文对于编码DmGPCR多肽的全长多核苷酸的公开使得本领域一般技术人员能够得到每一个可能的全长多核苷酸的片段。因此，本发明提供了编码DmGPCR的多核苷酸片段，含有至少14，优选至少16，18，20，25，50或75个编码DmGPCR的多核苷酸的连续核苷酸。本发明的片段多核苷酸可含有对于编码DmGPCR的多核苷酸序列独特的序列，因此能够仅(即“专一的”)在高度严格或中等严格条件下和编码DmGPCR(或其片段)的多核苷酸杂交。本发明的基因组序列的多核苷酸片段不仅是对编码区域独特的，还包括衍生自内含子、调控区域和/或其它非翻译序列的序列。对本发明的多核苷酸独特的序列是通过与其它已知多核苷酸比较可识别的，并可通过使用本领域常规使用的排列对比程序，例如可在公众序列数据库中得到的那些进行鉴定。这些序列还可通过Southern杂交分析识别，以确定多核苷酸将杂交的基因组DNA片段的数目。本发明的多核苷酸可以使其能够被检测的方式标记，包括放射性、荧光和酶标记。片段多核苷酸作为检测DmGPCR全长或片段多核苷酸的探针是特别有用的。可在试剂盒中包含一种或多种多核苷酸，用于检测编码DmGPCR的多核苷酸的存在，或用于检测编码DmGPCR的多核苷酸序列的变异。本发明还包括在中等严格或高等严格条件下与SEQIDNOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，或23的多核苷酸的非编码链或互补链杂交的编码DmGPCR多肽的DNA。示范性高等严格杂交条件如下42℃在杂交溶液中杂交，该溶液含有50％甲酰胺、1％SDS、1MNaCl、10％硫酸葡萄糖，60℃在含有0.1XSSC和1％SDS的洗涤溶液中洗涤2次。应理解在领域中，可通过改变温度和缓冲液、或盐浓度实现相等严格度的条件，如Ausubel等(编.)，ProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，1994，pp.6.0.3-6.4.10所述。可通过经验确定或根据探针的长度和鸟苷/胞苷(GC)碱基配对百分率精确计算杂交条件中的变化。可如Sambrook等(编)，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarbor，NewYork，1989，pp.9.47-9.51所述计算杂交条件。用本发明公开的核苷酸序列信息的知识，本领域技术人员可从不同来源(即不同组织或不同生物)通过各种各样本领域技术人员已知的，或如Sambrook等，Molecularcloningalaboratorymanual，第二版，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NY，1989(在此完整引入以供参考)所述的方法鉴定和获得编码DmGPCR的核苷酸序列。例如，可通过用本文提供的DmGPCR基因序列信息产生的寡核苷酸探针筛选mRNA、cDNA或基因组DNA，获得编码DmGPCR的DNA。可用可检测基团，例如荧光基团、放射性原子或化学发光基团，根据本领域技术人员已知的和常规杂交试验所用的方法，例如Sambrook等所述，标记探针。含有上述任何DmGPCR核苷酸序列的核酸分子可以任选的用聚合酶链式反应(PCR)方法，用本文核苷酸序列产生的PCR寡核苷酸引物合成。见Mullis等的美国专利号4,683,195和Mullis的4,683,202。PCR反应提供了选择性提高特定核酸序列浓度的方法，即使该序列之前未经纯化并且在一具体样品中只存在单个拷贝。该方法可用于扩增单链或双链DNA。方法主要涉及用两种寡核苷酸探针作为引物，进行所需核酸分子模版依赖的聚合酶介导的复制。本领域技术人员熟知各种各样的任选克隆和体外扩增方法。这些技术的例子可在例如Berger等，GuidetoMolecularCloningTechniques，MethodsinEnzymology152AcademicPress，Inc.，SanDiego，CA(Berger)中发现，在此完整引入以供参考。本发明的核酸分子和其衍生的片段可用于筛选限制性片段长度多态性和基因作图。可用自动化测序法获得或验证DmGPCR的核苷酸序列。本发明的DmGPCR核苷酸是100％准确的。然而，如本领域所知的，自动化方法获得的核苷酸序列可能会含有一些错误。自动化确定的核苷酸序列通常与给定核酸分子的准确核苷酸序列有至少约90％、更通常至少约95％-99.9％的相同性。准确的序列可以用本领域已知的手工测序方法更精确测定。序列中导致一个或多个核苷酸插入或缺失的错误可导致翻译中框架漂移，从而使得预测的氨基酸序列与该核酸分子从突变位点开始的实际核苷酸序列不同。表达构建物和载体还提供了掺入本发明多核苷酸中的自发复制性重组表达构建物，例如质�：筒《綝NA载体。本文使用扩增编码DmGPCR的DNA或RNA和/或表达编码DmGPCR的DNA的载体。本发明的载体包括但不限于质粒、噬菌体、粘粒、附加体、病毒颗粒、病毒和可整合DNA片段(例如可通过同源重组整合入宿主基因组的片段)。病毒颗�？砂ǖ幌抻谙俨《�、杆状病毒、细小病毒、疱疹病毒、痘病毒、腺关联病毒、Smeliki森林病毒、痘苗病毒和逆转录病毒。表达载体的例子包括但不限于pcDNA3(Invitrogen)和pSVL(PharmaciaBiotech)。其它表达载体包括但不限于pSPORT载体，pGEM载体(Promega)，pPROEX载体(LTI，Bethesda，MD)，Bluescript载体(Stratagene)，pQE载体(Qiagen)，pSE420(Invitrogen)，和pYES2(Invitrogen)。还提供了表达构建物，其中编码DmGPCR的多核苷酸与内源或外源表达控制DNA序列和转录终止子可操纵性连接。表达控制DNA序列通常包括启动子、增强子、操纵子和调节元件结合位点，通常是基于表达系统选择的，其中利用了表达构建物。通常根据提高基因表达的能力选择启动子和增强子序列，而通常根据调节基因表达的能力选择操纵子序列。本发明的表达构建物还可包含编码一个或多个可选择标记的序列，从而能鉴定携带该构建物的宿主细胞。表达构建物还可含有帮助和/或启动宿主细胞中的同源重组的序列。本发明的构建物还可含有在宿主细胞中复制所必须的序列。可用表达构建物生产编码的蛋白，但也可以简单的用于扩增编码DmGPCR的多核苷酸序列。在一些实施例中，载体是表达载体，其中本发明的多核苷酸与含有表达控制序列的多核苷酸可操纵性连接。一些表达载体是可复制的DNA构建物，其中编码DmGPCR的DNA序列与能够影响合适的宿主细胞中DmGPCR表达的合适的控制序列可操纵性连接。当DNA区域之间可操纵性连接或联结时，它们彼此功能上相关。例如，如果启动子与编码序列可操纵性连接或联结，则它控制序列的转录。扩增载体不需要表达控制结构域，而需要能在宿主中复制，这通常是由复制起始点和能促进识别转化物的选择基因赋予的。对表达载体中控制序列的需要视所选的宿主和转化方法而异。通常，控制序列包括转录启动子，任选的控制转录的操纵子序列，编码合适的mRNA核糖体结合(位点)的序列和控制转录和翻译终止的序列。载体可含有能被宿主生物识别的启动子。本发明的启动子序列可以是原核、真核或病毒的。合适的原核序列的例子包括噬菌体λ的PR和PL启动子(ThebacteriophageLambda，Hershey，A.D.，编，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NY，1973，在此完整引入以供参考；LambdaII，Hendrix，R.W.，Ed.，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NY，1980，在此完整引入以供参考)；大肠杆菌的trp，recA，热休克，和lacZ启动子以及SV40早启动子(Benoist等，Nature，1981，290，304-310，在此完整引入以供参考)。其它启动子包括但不限于小鼠乳腺瘤病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)的长末端重复区、马罗尼白血病病毒、巨细胞病毒立即早期启动子、EB病毒、Rous肉瘤病毒、人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人金属硫蛋白的启动子。在本发明的载体中还可包含其它调控序列。合适的调控序列的例子包括例如噬菌体MS-2复制酶基因和噬菌体λ基因cII的SD序列。SD序列可在其后直接跟随一编码DmGPCR的DNA，导致成熟DmGPCR蛋白的表达。此外，合适的表达载体可包含合适的标记，从而能筛选经转化的宿主细胞。用任何本领域技术人员熟知，并在例如Sambrook等，见上所述的文献中所述的各种技术中的任一种进行所选宿主的转化。可通过构建载体，包含外源起始点或通过宿主细胞染色体复制机制提供复制起始点。如果载体整合入宿主染色体，后者就足够了。另外，本领域技术人员宁可不使用含有病毒复制起始点的载体，而通过用可选择标记和DmGPCRDNA共转化的方法转化哺乳动物细胞。合适标记的一个例子是二氢叶酸还原酶(DHFR)或胸苷激酶(例如美国专利号4,399,216)。编码DmGPCR的核苷酸序列可与载体DNA根据常规技术重组，包括钝端或交错末端连接，限制酶消化以提供合适的末端，适当填充粘性末端，碱性磷酸酶处理以避免不需要的连接，和用合适的连接酶连接。Sambrook等，见上公开了这些技术，并且是本领域熟知的。构建哺乳动物表达载体的方法如Okayama等，Mol.Cell.Biol.，1983，3，280；Cosman等，Mol.Immunol.1986，23，935；Cosman等，Nature，1984，312，768；EP-A-0367566和WO91/18982所述，都在此完整引入以供参考。宿主细胞本发明的另一个方面提供了宿主细胞，包括原核细胞和真核细胞，以允许编码的DmGPCR多肽表达的形式含有本发明的多核苷酸(或本发明的载体)。本发明的多核苷酸可作为环状质粒或含有分离的蛋白质编码区域的线性DNA或病毒载体的一部分，被引入宿主细胞。将DNA引入宿主细胞的方法是熟知的，并在本领域技术中常规使用，包括转化、转染、电穿孔、核注射、或与载体，例如脂质体、微团、血影细胞和原生质体等融合。本发明的表达系统包括细菌、酵母、真菌、植物、昆虫、无脊椎动物、脊椎动物和哺乳动物细胞系统。本发明提供了用本发明的多核苷酸或本发明的载体转化或转染(稳定或瞬时)的宿主细胞。如上所述，这些宿主细胞用于扩增多核苷酸，还用于表达该多核苷酸编码的DmGPCR多肽或其片段。本发明的一些方面还提供具有表达载体的转化的宿主细胞，该表达载体含有上述任何一种核酸分子。当表达载体被引入合适的宿主细胞时，发生核苷酸序列的表达。表达本发明多肽的合适的宿主细胞包括但不限于原核细胞、酵母和真核细胞。如果使用原核表达载体，合适的宿主细胞将是任何能表达克隆的序列的原核细胞。合适的原核细胞包括但不限于大肠杆菌、芽孢杆菌、沙门菌、假单胞菌、链球菌和葡萄球菌属的细菌。如果使用真核表达载体，合适的宿主细胞可以是任何能够表达该克隆序列的真核细胞。真核细胞可以是高等真核细胞(动物)的细胞。合适的真核细胞包括但不限于非人哺乳动物组织细胞和人组织培养细胞。宿主细胞包括但不限于昆虫细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、非洲绿猴肾细胞(COS细胞)、人293细胞和小鼠3T3成纤维细胞。这些细胞在细胞培养物中的增殖是常规的程序(见例如TissueCulture，AcademicPress，Kruse和Patterson，编，1973，在此完整引入以供参考)。另外，可用酵母宿主作为宿主细胞。酵母细胞的例子包括但不限于酿酒酵母、毕赤酵母和克鲁维酵母菌属。酵母宿主的例子是酿酒酵母(S.cerevisiae)和毕赤酵母(P.pastoris)。酵母载体可含有来自2T酵母质粒的复制序列起始点，自发复制序列(ARS)，启动子区，聚腺苷酸化序列，翻译终止序列，和可选择标记基因。本文还包括酵母和大肠杆菌中复制的穿梭载体。另外，可用昆虫细胞作为宿主细胞。在一个实施例中，用杆状病毒表达系统表达本发明的多肽(见Luckow等，Bio/Technology，1988，6，47，BaculovirusExpressionVectorsALaboratoryManual，O’Rielly等(编)，W.H.Freeman和Company，NewYork，1992，和美国专利号4,879,236，分别在此完整引入以供参考)。另外，例如MAXBACTM完整杆状病毒表达系统(invitrogen)可用于在昆虫细胞中的生产。在另一个相关实施例中，本发明提供了产生DmGPCR多肽(或其片段)的方法，包括步骤在营养培养基中培养宿主细胞，从细胞或培养基中分离多肽或其变体。由于DmGPCR是一种7次跨膜受体，应理解在一些应用，例如某些活性试验中，分离可能涉及分离嵌有该多肽的细胞膜，而另一些应用中可能需要更完全的分离。本发明的宿主细胞是开发能与DmGPCR起特异性免疫反应的抗体的免疫原的有价值来源。本发明的宿主细胞还可用于大规模生产DmGPCR多肽的方法，其中在合适的培养基中培养细胞，从细胞或从细胞培养的培养基中通过本领域已知的纯化方法，例如常规层析法，包括免疫亲和层析、受体亲和层析、疏水作用层析、凝集素亲和层析、尺寸排阻层析、阳离子或阴离子交换层析、高压液相层析(HPLC)、反相HPLC等，分离所需的多肽产物。纯化的其它方法包括其中表达所需的蛋白质并纯化成为具有特别的能被特异性结合伴侣或试剂识别的尾、标记或螯合分子的融合蛋白质。可切割该纯化的蛋白，得到所需蛋白质，或不处理，仍然作为完整的融合蛋白。切割该融合组分，由于该切割过程可产生具有额外的氨基酸残基的所需蛋白。对DmGPCRDNA序列的了解使得能够改变细胞，从而允许或提高内源性DmGPCR的表达。可修饰细胞(例如通过同源重组)，通过用全部或部分异源启动子整个或部分置换天然存在的DmGPCR启动子来增强表达，从而使细胞以更高水平表达DmGPCR。异源启动子以与内源DmGPCR编码序列可操纵性连接的方式插入(见例如PCT国际出版号WO94/12650，PCT国际出版号WO92/20808和PCT国际出版号WO91/09955)。还应考虑，除了异源启动子DNA，也可与其一起插入可扩增标记DNA(如ada、dhfr和编码氨甲酰磷酸合酶、天冬酰胺转氨甲酰酶和二氢乳清酸酶的合成酶的多功能CAD基因)，和/或内含子DNA。如果与DmGPCR编码序列连接，用标准选择方法对标记DNA的扩增导致细胞中DmGPCR编码序列的共扩增。敲除本发明提供的DNA序列信息也使得开发(例如通过同源重组或“敲除”策略，见Capecchi，Science，1989，244，1288-1292)不能表达功能性DmGPCR或表达DmGPCR变体的个体变为可能。这些个体(尤其是包括昆虫和蠕虫)可用作研究DmGPCR的体内活性和DmGPCR的调节剂的模型，也可用于进一步阐明昆虫和蠕虫中DmGPCR的作用。反义本发明还使得识别和与编码DmGPCR的多核苷酸杂交的反义多核苷酸成为可能。提供了全长和片段的反义多核苷酸。本发明的片段反义分子包括那些特异性识别或能与DmGPCR表达控制序列或DmGPCRRNA杂交的序列(如编码DmGPCR的DNA与其它编码已知分子的DNA比较确定的序列)。鉴定对DmGPCR编码多核苷酸独特的序列可以通过各种公众可得的序列数据库，和/或通过市售序列比较程序来进行。在鉴定了所需的序列后，通过限制性消化或用本领域熟知的任意的各种聚合酶链式反应技术进行分离。反义多核苷酸特别与调节表达DmGPCRmRNA的细胞对DmGPCR的表达密切相关。将能够与DmGPCR表达控制序列或DmGPCRRNA特异性结合的反义核酸(优选10-20个碱基配对寡核苷酸)引入细胞(例如通过病毒载体或胶束分散系统，例如脂质体)。反义核酸与DmGPCR目标核苷酸序列在细胞中结合，防止目标序列的转录和/或翻译。特别考虑硫代磷酸和膦酸甲酯反义寡核苷酸用于本发明的治疗。反义寡核苷酸还可用聚-L-赖氨酸、转铁蛋白聚赖氨酸或胆固醇分子在其5’末端进一步修饰。在转录或翻译水平上抑制DmGPCR表达可用于产生研究DmGPCR生物作用的细胞或动物模型。衍生自本发明编码DmGPCR的核苷酸序列的反义寡核苷酸或选自SEQIDNOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，或23的核苷酸序列的片段，或与其同源或互补的序列用于在各种组织中探测基因表达。例如，可在原位通过常规放射性自显影技术用携带有探测基团的寡核苷酸探针探测组织。可从SEQIDNOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，或23，或对应其的mRNA，包括但不限于起始密码子、TATA盒、增强子序列等选择针对核苷酸序列的调控区的反义寡核苷酸。转录因子本发明教导的DmGPCR序列使得调节DmGPCR在天然细胞和个体中的表达的新转录因子，和被DmGPCR转化或转染的细胞成为可能。例如，已显示通过锌指功能域与DNA结合的Cys2-His2锌指蛋白能适应结构改变，从而识别不同的目标序列。这些人工锌指蛋白以高亲和力和低解离常数识别特定的目标位点，能起到基因开关的作用，以调节基因表达。本发明对特定DmGPCR目标序列的了解使得能够用已知的方法，例如联合基于结构的建模和筛选噬菌体展示文库来对目标序列专一性的锌指蛋白进行工程改造(Segal等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，96，2758-2763；Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94，5525-5530；Greisman等，Science，1997，275，657-661；Choo等，J.Mol.Biol.，1997，273，525-532)。每个锌指功能域通常识别三或更多对碱基。由于18个碱基对的识别序列通常已经足够长，以赋予它对任何已知基因组的独特性，预期具有6个串联重复锌指的锌指蛋白能够确保对特定序列的专一性(Segal等)。基于DmGPCR序列设计的人工锌指重复序列融合，于能活化或抑制DmGPCR表达的活化或抑制功能域(Liu等)。或者，可将锌指功能域通过锌指肽和TBP之间不同长度的接头区与TATA盒-结合因子(TBP)融合，产生转录激活剂或抑制剂(Kim等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94，3616-3620)。这些蛋白和编码它们的多核苷酸具有调节体内DmGPCR表达的用途。可通过转染能表达新转录因子的构建物(基因治疗)将这种新转录因子传递给靶细胞或引入蛋白质。还可设计工程改造的锌指蛋白与RNA序列结合，作为反义或催化性RNA方法的替代方法用于治疗(McColl等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，96，9521-9526；Wu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，344-348)。本发明考虑了根据本发明的基因序列，设计这些转录因子和定制的锌指蛋白的方法，它们可用于调节细胞(天然或转化的细胞)中DmGPCR表达。这些细胞中的遗传补充物含有上述序列。多肽本发明还提供了本发明的多核苷酸编码的纯化和分离的DmGPCR多肽，包括具有SEQIDNOs2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24中列出的氨基酸序列的DmGPCR多肽。应理解，胞外表位对于产生和筛选抗体以及其它能与DmGPCR等受体结合的化合物特别有用。因此，在另一个实施例中，本发明提供了含有至少一个DmGPCR的胞外域(例如N-末端胞外域和三个胞外环之一)，例如DmGPCR的N-末端胞外域的纯化和分离的多肽。本发明范围内还包括纯化和分离的多肽，其含有选自DmGPCR跨膜域、DmGPCR胞外环连接的跨膜域、DmGPCR胞内环连接跨膜域、DmGPCR的C-末端胞质区及其融合物的DmGPCR片段。这些片段可以是天然受体的连续部分。然而，还将会理解本文提供的DmGPCR基因和蛋白质序列的知识得以能重组天然蛋白质中不连续的各个功能域。用称作“tmtrestall(Parodi等，Comput.Appl.Biosci.，1994，5，527-535)”的FORTRAN计算机程序，显示DmGPCR含有跨膜结构域。本发明还包括与本发明的参比多肽具有至少99％，至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少60％，至少55％，or至少50％相同性和/或同源性的多肽。相对于本发明的参比多肽的氨基酸序列“相同性”百分数本文定义为两条序列排列对象，按需要引入缺口，实现最大序列相同性百分比，而不将任何保守性取代视为序列相同之后，候选序列中与DmGPCR序列残基相同的氨基酸残基的百分数。相对于本发明的参比多肽，氨基酸序列“同源性”百分数在此指两条序列排列对齐，并按需要引入缺口实现最大序列相同性百分比，还将任何保守取代视为序列相同之后，候选序列中与DmGPCR序列中残基相同的氨基酸残基的百分数。在一方面，同源性百分数计算成排列对比时，两条序列的较小一条中的氨基酸残基与相比较的序列中氨基酸残基相同的百分数，在100个氨基酸长度中可引入四个缺口以使得能最大程度排列对齐(Dayhoff，于AtlasofProteinSequenceandStructure，vol.5，NationalBiochemicalResearchFoundation，Washington，D.C.，1972，p.124，在此引入以供参考)。可从天然细胞来源分离，或化学合成，和通过包括本发明宿主细胞的重组方法生产本发明的多肽。预计用哺乳动物宿主细胞提供翻译后修饰(例如糖基化、截短、脂化和磷酸化)，以满足本发明重组表达产物最佳生物活性的需要。DmGPCR多肽的糖基化和非糖基化形式属于本发明。本发明还包含了DmGPCR多肽变体(或同类物)。在一个例子中，插入提供了插入变体，其中在DmGPCR氨基酸序列中插入一个或多个氨基酸残基。插入物可以位于蛋白质末端的两头或一端，或可以位于DmGPCR氨基酸序列内部区域内。在末端一头或两头具有额外残基的插入变体可包括例如，融合蛋白或具有氨基酸尾或标记的蛋白。插入变体包括DmGPCR多肽，其中在DmGPCR氨基酸序列或其生物学活性片段上加入一个或多个氨基酸残基。本发明的变体产物还包括成熟的DmGPCR产物，即其中除去了前导或信号序列，而具有额外的氨基末端残基的DmGPCR产物。额外的氨基末端残基可衍生自其它蛋白质，或可包含一个或多个不可鉴定来自什么具体蛋白质的残基。考虑在位置-1具有额外的甲硫氨酸残基的DmGPCR产物(Met-1-DmGPCR)如在位置-2和-1具有额外的甲硫氨酸和赖氨酸残基的DmGPCR产物(Met-2-Lys-1-DmGPCR)，具有额外的Met、Met-Lys、Lys残基(或一个或多个碱性残基)的DmGPCR变体特别可用于增强细菌宿主细胞中的重组蛋白质生产。本发明还包括由于使用特定的表达系统导致具有额外氨基酸残基的DmGPCR变体。例如，用作为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白一部分表达所需的多肽的市售载体，提供了在从所需的多肽上切下GST组分后，在-1位具有额外的甘氨酸残基的所需多肽。也考虑其它载体系统中表达得到的变体。插入变体还包括融合蛋白，其中DmGPCR的氨基末端和/或羧基末端与另一多肽融合。在另一方面，本发明提供了缺失变体，其中DmGPCR多肽中的一个或多个氨基酸残基被除去。缺失可影响DmGPCR多肽的一个或两个末端，或除去DmGPCR的一个或多个非末端氨基酸残基。因此，缺失变体包括所有的DmGPCR多肽片段。本发明还包括SEQIDNOs2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24之一中列出的序列的多肽片段，其中这些片段保留了DmGPCR多肽的生物学(例如配体结合和/或胞内信号传递)和免疫学性质。本发明考虑本文所述的任何多肽含有至少5，10，15，20，25，30，35，或40个保守性氨基酸的片段。多肽片段可显示对DmGPCR和其等位基因产物和物种同源物的独特或特异性的抗原性能。可用任何本领域熟知和常规使用的方法制备具有所需生物学和免疫学性能的本发明的片段。在另一个方面，本发明提供了DmGPCR多肽的取代变体。取代变体包括其中一个或多个DmGPCR多肽的氨基酸残基被除去并被其它残基取代的那些多肽。在一个方面，取代性质是保守的，然而，本发明也考虑非保守取代。对此，可定义为了该目的的保守取代是下面表1、2或3列出的那些。变体多肽包括那些通过修饰编码本发明多肽的多核苷酸引入的保守取代。氨基酸可以按照物理性质和对二级和三级蛋白质结构的贡献分类。在本领域中，保守取代被认为是用一种氨基酸取代另一种具有相似性质的氨基酸。示范性的保守取代如表1所述(来自WO97/09433，第10页，1997年3月13日出版(PCT/GB96/02197，96/9/6提交))，如下文表1保守取代I侧链特征氨基酸亲脂性非极性GAPILV极性不带电CSTMNQ极性带电DEKR芳族HFWY其它NQDE另外，保守氨基酸如Lehninger，(BIOCHEMISTRY，第二版；WorthPublishers，Inc.NY，NY，1975，pp.71-77)所述分组，如下文表2所列表2保守取代II侧链特征氨基酸非极性(疏水性)A.亲脂性ALIVPB.芳族FWC.含硫的MD.边界G不带电-极性A.羟基STYB.酰胺NOC.巯基CD.边界G带正电(碱性)KRH带负电(酸性)DE作为另一种选择方案，示范性保守取代如下文表3所示。表3保守取代III原始残基示范性取代Ala(A)Val，Leu，IleArg(R)Lys，Gln，AsnAsn(N)Gln，His，Lys，ArgAsp(D)GluCys(C)SerGln(Q)AsnGlu(E)AspHis(H)Asn，Gln，Lys，ArgIle(I)Leu，Val，Met，Ala，Phe，Leu(L)Ile，Val，Met，Ala，PheLys(K)Arg，Gln，AsnMet(M)Leu，Phe，IlePhe(F)Leu，Val，Ile，AlaPro(P)GlySer(S)ThrThr(T)SerTrp(W)TyrTyr(Y)Trp，Phe，Thr，SerVal(V)Ile，Leu，Met，Phe，Ala应理解本发明的多肽的定义应包括携带除了氨基酸残基的插入、缺失或取代外的修饰的多肽。例如，修饰可以是共价性质的，包括例如与聚合物、脂类、其它有机和无机基团的化学键合。可制备这些衍生物来提高多肽的循环半衰期，或可设计成改进多肽对于所需的细胞、组织或器官的靶向能力。类似的，本发明还包括经共价修饰，从而包含一或多种水溶性聚合物结合物，例如包含聚乙二醇、聚氧乙二醇、或聚丙二醇的DmGPCR多肽。能显示天然DmGPCR的配体结合性质，并以较高水平表达的变体，以及能提供组成性活性受体的变体，在本发明的试验中特别有用；这些变体也可用于本发明的试验，提供细胞、组织和动物模型，用于研究反常的DmGPCR活性。抗体本发明还考虑对DmGPCR或其片段具有特异性的抗体，例如单克隆和多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、双功能/双特异性抗体、人源化抗体、人抗体和移植互补决定区(CDR)的抗体，包括含有能够特异性识别本发明多肽的CDR序列的化合物。本发明还提供了抗体片段，包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv。当用于描述本发明的抗体时，术语“对……特异性”表示本发明的抗体可变区专门识别和结合DmGPCR多肽(即能够根据测定结合亲和力的差异区分DmGPCR多肽与其它已知的GPCR多肽，尽管在DmGPCR和这些多肽之间可能存在局部序列相同性、同源性或相似性)。将会理解特异性抗体也可以与其它蛋白质(例如金黄色葡萄球菌A蛋白或其它ELISA技术中的抗体)通过抗体可变区外的序列，特别是分子的恒定区中的序列相互作用。可确定本发明抗体结合特异性的筛选试验是公知的，并且在本领域中被常规使用。该试验的充分讨论，可见Harlow等(编)，AntibodiesALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY，1988，Chapter6。还考虑了能识别和结合本发明DmGPCR多肽片段的抗体，条件是抗体对于DmGPCR多肽具有特异性。本发明的抗体可用任何熟知和本领域常规使用的方法制备。本发明提供了对本发明DmGPCR具有特异性的抗体。抗体特异性如下所述。然而，应强调可从先前在文献中所述的多肽产生，并且能与DmGPCR不规则交叉反应(例如由于在两种多肽中不规则存在类似的表位)的抗体被认为是“交叉反应性”抗体。这些交叉反应性抗体不是对DmGPCR“特异性”的抗体。用几种方法之一，例如本领域熟知的蛋白质印迹分析确定一种抗体是否是对于DmGPCR特异性的，或与另一种已知的受体交叉反应。为了鉴定表达DmGPCR的细胞和调节DmGPCR-配体结合活性，与DmGPCR的胞外表位特异性结合的抗体是有用的。在一变化中，本发明提供单克隆抗体。产生这些抗体的杂交瘤也是本发明的一部分。在另一种变化中，本发明提供人源化抗体。人源化抗体可用于治疗外寄生虫导致的疾病或病况的体内治疗性指征。在另一个变化中，本发明提供含有多克隆抗体的无细胞组合物，其中至少一种抗体是本发明的DmGPCR特异性抗体。从动物分离的抗血清是示范性组合物，如一种组合物，含有重新悬浮在水或其它稀释剂、赋形剂或载体中的抗血清的抗体组分。在另一个相关实施例中，本发明提供了对DmGPCR特异性抗体具有特异性的抗独特型抗体。众所周知，抗体含有较小的抗原结合域，它能通过化学或重组技术分离。这些功能域本身是有用的DmGPCR结合分子，也可与毒素或其它多肽融合。因此，在另一个实施例中，本发明提供了含有DmGPCR特异性抗体的片段的多肽，其中所述片段和多肽能与DmGPCR结合。作为非限制性例子，本发明提供作为单链抗体、CDR-移植抗体和人源化抗体的多肽。非人抗体可以通过任何本领域已知的方法人源化。在一方法中，将非人CDR插入人抗体中或共有抗体框架序列中。然后可在该抗体框架中引入更多变化，以调节亲和力或免疫原性。本发明的抗体可用于例如治疗目的(通过调节外寄生虫DmGPCR活性)、用于检测或定量检测外寄生虫DmGPCR的诊断目的，和DmGPCR的纯化。还包括用于本文所述任何目的的本发明抗体的试剂盒。通常，本发明的试剂盒还包括抗体对其具有免疫特异性的对照抗原。本发明还提供了使用本发明抗体的方法。例如，本发明提供了调节DmGPCR配体结合的方法，包括步骤在抗体与受体结合的条件下，使DmGPCR与对DmGPCR特异性的抗体接触。本发明抗体可用于通过对昆虫施用抗DmGPCR抗体，以调节DmGPCR的配体结合，来控制昆虫群体。例如，昆虫可选自苍蝇、果蝇、壁虱、跳蚤、虱子、扁虱、蟑螂和蜇蝇。基因操纵用DmGPCR基因操纵也可用于昆虫等个体。基因操纵包括恢复DmGPCR活性、DmGPCR过度表达、和DmGPCR的负调控。本发明还包括基因操纵，以使得由于功能突变而损失的DmGPCR活性恢复。对合适的细胞传递功能性DmGPCR基因在体外、原位、或体内进行，使用载体，更有效是病毒载体(例如腺病毒、腺关联病毒、或逆转录病毒)，或体外用物理DNA转移方法(例如脂质体或化学处理)。见例如Anderson，Nature，1998，suppl.392(6679)，25-20。对于基因治疗技术的其它综述，见Friedmann，Science，1989，244，1275-1281；Verma，ScientificAmerican，1990，68-84；和Miller，Nature，1992，357，455-460。还考虑可用基因操纵(例如反义处理)来负调控DmGPCR的表达。作为非限制性例子，可用基因操纵通过敲除或下调一个或多个DmGPCR基因或其片段控制昆虫群体(见上下文)。组合物本发明的另一个方面涉及组合物，包括杀虫剂和药物组合物，包括上述任何核酸分子或重组表达载体，和可接受的载体或稀释剂。载体或稀释剂可以是药物学上可接受的。合适的载体如Remington’sPharmaceuticalSciencesA.Osol，的最新版本所述，这是一本本领域的标准文献，在此完整引入以供参考。这些载体或稀释剂的例子包括但不限于水、盐水、ringer’s溶液、葡萄糖溶液和5％人血清清蛋白。可用脂质体和非水性载体，例如固定油。制剂可用常用技术消毒。本发明的范围内还包括含有配制在例如药物学上可接受的载体中的本发明的多肽、多核苷酸或抗体的组合物。本发明提供了含有DmGPCR多核苷酸、DmGPCR多肽。抗-DmGPCR抗体、其具有DmGPCR结合活性的片段或部分、DmGPCR结合伴侣或DmGPCR调节剂的杀虫剂组合物。试剂盒和方法本发明还涉及试剂盒，包括药物和杀虫剂试剂盒。试剂盒可包括任何上述核酸分子，任何上述多肽，或任何上述与本发明的多肽结合的抗体，和阴性对照。试剂盒可包括其它成分，例如说明书、固相载体、帮助定量的试剂等。可设计试剂盒，用于检测多核苷酸或编码的蛋白质的表达。例如，可提供寡核苷酸杂交试剂盒，包括一个容器，装有DmGPCR特异性DNA的特异性寡核苷酸探针，和可任选的装有阳性和阴性对照和/或说明书的容器。类似的，可提供PCR试剂盒，其中包括一个容器，装有DmGPCR特异性序列的特异性引物，DNA和可任选的，装有分子大小标记、阳性和阴性对照和/或说明书的容器。杂交条件应该是在其它核酸分子存在下，仅与基因发生杂交的条件。在严格杂交条件下，仅高度互补的核酸序列杂交。这些条件可防止在20个连续核苷酸中有1或2个错配的核酸杂交。这些条件如上所述。本发明适合核酸探测方法的测试样品包括例如，细胞或细胞的核酸提取物、或生物液。用于上述方法的样品可根据试验形式、检测方法和要检测的组织、细胞或提取物性质变化。制备细胞的核酸提取物的方法是本领域熟知的，不难适应于获得与所用方法相容性的样品。在另一个方面，本发明提供了检测样品中多核苷酸，作为外寄生虫导致疾病或异常的诊断工具的方法，其中该方法包括步骤(a)使样品与核酸探针接触，该探针在杂交试验条件下与编码具有SEQIDNO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，和24的序列的多核苷酸的核酸目标区域杂交，所述探针含有的核酸序列编码该多肽、其片段和序列和片段的互补序列的核酸序列；和(b)检测探针靶区域杂交物的存在和量，作为疾病的指征。另外，可提供免疫测定试剂盒，包括容器，容器中装有DmGPCR蛋白质特异性抗体和可任选的装有阳性和阴性对照和/或说明书的容器。还提供可用于鉴定DmGPCR结合伴侣，例如天然配体或调节剂(激动剂或拮抗剂)的试剂盒。用于治疗疾病或异常的物质可能在一种或多种检测对所述疾病或异常的治疗有误相应活性的体外试验中显示阳性结果。调节多肽活性的物质包括但不限于，反义寡核苷酸、激动剂和拮抗剂，以及抗体。本发明还提供了调节DmGPCR的配体结合性的方法，包括步骤在抗体与受体结合的条件下，使DmGPCR与DmGPCR特异性抗体接触。诱导免疫应答的方法本发明的另一个方面设计在个体内诱导针对本发明的多肽的免疫应答的方法，包括对个体施用其量足够诱导免疫应答的多肽。量由物种、个体大小等决定，可由本领域技术人员决定。鉴定配体的方法本发明的另一个方面涉及鉴定与DmGPCR或编码DmGPCR的核酸分子结合的化合物的方法，包括使DmGPCR、或编码它的核酸分子与化合物接触，并测定是否化合物与DmGPCR或编码它的核酸分子结合。结合可通过本领域技术人员熟知的结合试验确定，包括但不限于凝胶移动试验、蛋白质印迹、放射性标记的竞争试验、基于噬菌体的表达克隆、通过层析的共分级、共沉淀、交联、相互作用捕获/双杂交分析、RNA-蛋白分析、ELISA等，如CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，NY，1999所述，在此完整引入以供参考。要筛选的化合物包括(可包括怀疑与DmGPCR或编码它的核酸分子结合的化合物)，但不限于胞外、胞内、生物学或化学起源的化合物。本发明还提供鉴定能与DmGPCR结合的化合物的试验。这样的试验之一包括使含有DmGPCR的组合物与怀疑与DmGPCR结合的化合物接触，并测定化合物和DmGPCR之间的结合。在一些实施例中，组合物包括表面表达DmGPCR的细胞。在另一种变化中，使用分离的DmGPCR或含有DmGPCR的细胞膜。可直接，例如采用标记的化合物测定这种结合，或可用几种技术，包括测定该化合物诱导的DmGPCR的胞内信号传递(或测定DmGPCR信号传递水平的变化)间接测定。可用分离或重组的DmGPCR产物。DmGPCR变体或表达这些产物的细胞来鉴定或开发特异性结合分子，包括天然配体和合成化合物。结合伴侣可用于纯化DmGPCR产物，并用于常规免疫学方法，对液体和组织样品中的DmGPCR产物进行检测和定量。结合分子对于调节(即封阻、抑制或刺激)DmGPCR的生物活性，尤其是与信号转导有关的活性是特别有用的。本发明提供的DNA和氨基酸序列信息还可以鉴定能与DmGPCR多肽或多核苷酸相互作用的结合伴侣化合物。鉴定结合伴侣化合物的方法包括溶液试验、体外试验，其中DmGPCR多肽被固定，和基于细胞的试验。对DmGPCR多肽的结合伴侣化合物的鉴定提供了治疗或预防性干预表达DmGPCR的外寄生虫相关病理过程的候选药物和候选杀虫剂。本发明包括几种鉴定DmGPCR结合伴侣的试验系统。在溶液试验中，本发明的方法包括步骤(a)使DmGPCR多肽与一种或多种候选结合配体化合物接触，和(b)鉴定与DmGPCR多肽结合的化合物。可通过分离DmGPCR多肽/结合伴侣复合物，将其中的DmGPCR多肽与DmGPCR多肽/结合伴侣化合物相分离，来鉴定与DmGPCR多肽结合的化合物。在本发明的另一个实施例中还考虑另一个额外步骤，即特征分析该结合伴侣化合物的物理、生物和/或生物化学性质。在一个方面，用对DmGPCR多肽或候选结合伴侣化合物具有免疫特异性的抗体，来分离DmGPCR多肽/结合伴侣复合物。在其它实施例中，DmGPCR多肽或候选结合伴侣化合物含有能促进其分离的标记或尾，本发明的鉴定结合伴侣化合物的方法包括一个通过与该标记或尾相互作用，分离DmGPCR多肽/结合伴侣复合物的步骤。该类标记的示范例是聚组氨酸序列，通常约6个组氨酸残基，从而可通过镍螯合分离这样标记的化合物。其它本领域熟知和常用的标记和尾，例如FLAG尾(EastmanKodak，Rochester，NY)，也包含在本发明内。本发明的标记还包括但不限于放射性标记(例如125I，35S，32P，33P，3H)，荧光标记、化学发光标记、酶标记和免疫标记。在体外试验的一些实施例中，本发明提供的方法，包括步骤(a)使固定化的DmGPCR多肽与候选结合伴侣化合物接触，和(b)检测候选化合物与DmGPCR多肽的结合。在另一个实施例中，候选结合伴侣化合物是固定化的，检测DmGPCR的结合。用任何本领域熟知的方法完成固定化，包括与载体、珠、或层析树脂的共价结合，以及非共价高亲和力相互作用，例如抗体结合，或用链霉亲和素/生物素，其中固定化的化合物具有生物素分子。可用(i)非固定化合物上的放射性标记，(ii)非固定化合物上的荧光标价，(iii)非固定化合物的免疫特异性抗体，(iv)非固定化合物上能够激发荧光载体的标记，在该载体上结合有固定化的化合物实现对结合的检测，也可用其它本领域熟知和常规使用的技术。本发明还提供了基于细胞的试验，以鉴定DmGPCR多肽的结合伴侣化合物。在一个实施例中，本发明提供了方法，包括步骤使在细胞表面表达的DmGPCR多肽与候选的结合伴侣化合物接触，并检测候选的结合伴侣化合物对DmGPCR多肽的结合。在另一个实施例中，检测包括检测分子结合导致的细胞内钙流或其它生理事件。在本发明的另一个实施例中，使用高通量筛选对DmGPCR具有合适结合亲和力的化合物。简单说，在固相载体上合成大量不同的小肽测试化合物，作为溶于合适缓冲液中的游离化合物。肽测试化合物与DmGPCR接触，洗涤。然后用本领域熟知的方法检测结合的DmGPCR。还可直接将本发明的纯化的多肽包裹在平板上，用于上述结合试验。另外，可用非中和性抗体捕获蛋白质，将其固定在固相载体上。通常，可用表达的DmGPCR进行与其确定的配体的HTS结合试验。用合适的放射性同位素，包括但不限于125I，3H，35S或32P，用本领域技术人员熟知的方法标记鉴定出的多肽。另外，可用熟知方法，用合适的荧光衍生物标记肽(Baindur等，DrugDev.Res.，1994，33，373-398；Rogers，DrugDiscoveryToday，1997，2，156-160)。可用几种标准方法之一，包括过滤受体一配体复合物，从未结合配体中分离出结合的配体，在HTS试验中检测放射性标记，它与表达重组蛋白的细胞系所得到的膜制备物中的受体特异性结合(Williams，Med.Res.Rev.，1991，11，147-184；Sweetnam等，J.NaturalProducts，1993，56，441-455)。另一种方法包括闪烁亲近测定法(SPA)或FlshPlate形式，其中这些分离并不是必须的(Nakayama，Curr.OpinionDrugDisc.Dev.，1998，1，85-91Bossé等，J.BiomolecularScreening，1998，3，285-292)。可用各种方法，包括荧光能量转移(FRET)、直接荧光光度分析结合的配体，或荧光极化检测荧光配体的结合(Rogers，DrugDiscoveryToday，1997，2，156-160；Hill，Curr.OpinionDrugDisc.Dev.，1998，1，92-97)。可用其它试验鉴定DmGPCR的特异性配体，包括通过测定测试配体与靶蛋白的直接结合鉴定靶蛋白配体的试验，和用离子电喷质谱分析/HPLC方法，或其它物理和分析法鉴定通过亲和超滤的靶蛋白的配体。另外，用Fields等(Nature，1989，340，245-246)和Fields等(TrendsinGenetics，1994，10，286-292)所述的酵母双杂交系统间接评估这些结合作用，这些文献都在此完整引入以供参考。双杂交系统是用于检测两种蛋白质或多肽之间相互作用的遗传方法。可用于鉴定与感兴趣的已知蛋白结合的蛋白质，或用于对相互作用的关键功能域或残基划界。已开发出该方法的各种变化，用于克隆编码DNA合成蛋白的基因，鉴定与蛋白质结合的肽，或筛选药物。双杂交系统利用一对相互作用的蛋白质，将转录活化功能域带到与上游报道基因活化序列(UAS)DNA结合域附近，通常在酵母中进行。试验需要构建两个杂交基因，编码(1)与第一种蛋白质融合的DNA-结合域，和(2)与第二种蛋白质融合的活化域。DNA-结合域将第一种杂交蛋白质带到报道基因的UAS处；然而，由于大部分蛋白质缺乏活化域，该DNA-结合杂交蛋白不激活报道基因的转录。含有活化域的第二杂交蛋白本身不能激活报道基因的表达，因为它不与UAS结合。然而，当存在两种杂交蛋白质时，第一和第二种蛋白质的非共价相互作用将活化域和UAS连接起来，激活报道基因的转录。例如，当第一种蛋白质是DmGPCR基因产物或其片段时，即知道其能与另一种蛋白质或核酸相互作用，该试验将用于检测能干扰该结合相互作用的物质。当在该系统中加入不同的测试物质，监控报道基因的表达。抑制剂的存在导致缺乏报道物信号。当不知道DmGPCR基因产物的功能，不知道与基因产物结合的配体时，酵母双杂交试验还可用于鉴定与基因产物结合的蛋白质。在一种鉴定与DmGPCR受体或其片段结合的蛋白质的试验中，可使用编码DmGPCR受体(或片段)和UAS结合域(即第一种蛋白)的融合多核苷酸。另外，在该方法中产生和筛选了许多与活化域融合的分别编码不同的第二种蛋白质的杂交基因。通常，由总cDNA或基因组DNA融合文库的一个或多个成员编码第二蛋白，每个第二蛋白编码区与活化域融合。该系统能用于许多蛋白质，甚至不需要知道第二结合蛋白的身份或功能。系统是高度灵敏的，可检测其它方法不能揭示的相互作用；甚至瞬时作用可触发转录，以产生可以重复被翻译，得到报道蛋白的稳定的mRNA。可用其它方法搜索与靶蛋白结合的物质。美国专利号5,585,277(在此引入以供参考)描述了鉴定测试配体与靶蛋白的直接结合的筛选方法之一。该方法是根据蛋白质总是作为折叠和非折叠状态的混合物，并且在两个状态之间不断切换存在的原理。当测试配体与靶蛋白的折叠形式结合时(即当测试配体是靶蛋白的配体)，与配体结合的靶蛋白分子维持在其折叠状态。因此，在与靶蛋白结合的测试配体存在下，折叠的靶蛋白比无配体存在时为多。可用任何能够辨别靶蛋白的折叠和未折叠状态的方法确定配体与靶蛋白的结合。为了进行该试验，并不需要知道靶蛋白的功能。事实上可通过该方法评估任何作为测试配体的物质，包括但不限于金属、多肽、蛋白质、脂质、多糖、多核苷酸和小有机分子。另一种鉴定靶蛋白配体的方法如Wieboldt等(Anal.Chem.，1997，69，1683-1691)所述。该技术能在组合文库溶液中一次筛检到能与靶蛋白结合的20-30种物质。通过简单的膜洗涤，可将与靶蛋白结合的物质与其它文库组分分开。随后留在膜上的特别选出的分子从靶蛋白上释放，用HPLC和压缩气体辅助的电喷(离子喷雾)离子质谱法分析。该方法选择对靶蛋白具有最大亲和力的文库组分，并且对于小分子文库是特别有用的。本发明的其它实施例包括用竞争性筛选试验，其中能结合本发明多肽的中和性抗体特异性地与测试化合物竞争对多肽的结合。以此，可用抗体检测任何与DmGPCR具有一个或多个相同抗原决定簇的多肽。放射标记的竞争性结合研究如A.H.Lin等(AntimicrobialAgentsandChemotherapy，1997，41(10)，2127-2131)所述，在此完整引入以供参考。鉴定调节剂的方法本发明还提供了鉴定DmGPCR和DmGPCR结合伴侣之间的结合的调节剂的方法，包括步骤(a)使DmGPCR结合伴侣与含有DmGPCR的组合物，在存在和不存在推测的调节剂化合物的条件下接触；(b)检测结合伴侣和DmGPCR之间的结合；和(c)根据结合伴侣和DmGPCR在推测调节剂存在下的结合，比不存在推测的调节剂下的结合减少或增加，鉴定推测的调节化合物或调节剂化合物。在DmGPCR信号传递不足的情况下(例如，由于DmGPCR配体活性不足)，能刺激DmGPCR活性的DmGPCR结合伴侣可作为激动剂。在DmGPCR信号传递过量的情况下，封闭配体介导的DmGPCR信号传递的DmGPCR结合伴侣可用作DmGPCR的拮抗剂。另外，DmGPCR调节剂和DmGPCR多核苷酸和多肽可用于外寄生虫所引起的疾病或DmGPCR活性增强或损伤疾病的诊断试验中使用。在另一个方面，本发明提供治疗疾病或异常状况的方法，包括对需要这种治疗的个体施用能调节具有选自SEQIDNO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24的序列的多肽的活性或表达的物质。本发明的另一个方面通过对昆虫施用能调节DmGPCR多核苷酸表达或活性的结合伴侣或调节剂，提供控制昆虫群体的方法。可通过培育推测的调节剂与含有DmGPCR多肽或多核苷酸的细胞，和测定推测的调节剂对DmGPCR活性或表达的效果鉴定调节(即增强、下降或封阻)DmGPCR活性或表达的物质。通过比较某化合物对DmGPCR的作用和对其它GPCR化合物的作用，可评估该化合物调节DmGPCR活性的选择性。选择性调节剂可包括例如能与DmGPCR多肽或编码DmGPCR的核酸特异性结合的抗体和其它蛋白质、多肽或有机分子。DmGPCR活性的调节剂应该是在治疗上用于治疗与正常或异常DmGPCR活性有关的疾病和生理状况。DmGPCR多核苷酸和多肽，以及DmGPCR调节剂可用于外寄生虫导致的疾病或以增强或受损的GPCR活性为特征的病况的诊断试验。本发明鉴定调节剂的方法包括上述任一种方法的变化，以鉴定结合伴侣化合物，变体包括下列技术，其中鉴定出一种结合伴侣，在存在和不存在候选调节剂的情况下进行结合试验。当DmGPCR多肽和结合伴侣化合物之间的结合在候选调节剂的存在下，与其不存在的情况下比较，有所改变时，鉴定为调节剂。提高DmGPCR多肽和结合伴侣化合物之间的结合的调节剂被称为增强剂或激活剂，减少DmGPCR多肽和结合伴侣化合物之间的结合的调节剂被称为抑制剂。本发明还包括高通量筛选(HTS)试验，来鉴定影响或抑制DmGPCR多肽生物活性(即影响酶活性、结合活性等)的化合物。HTS试验能够以有效方式筛选大量化合物。基于细胞的HTS系统被用于调查DmGPCR受体-配体相互作用。设计HTS试验以鉴定具有所需性质的“命中”或“先导化合物”，然后可从其设计变化，以提高所需性质。“命中”或“先导化合物”的化学修饰常基于“命中”和DmGPCR多肽之间可鉴定的结构/活性关系。本发明范围内的调节剂包括但不限于非肽分子(例如非肽模拟物)、非肽变构效应物和肽。用于该试验的DmGPCR多肽或多核苷酸可以是游离在溶液中，固定在固相载体上，携带于细胞表面或位于细胞内，或与细胞的一部分结合。本领域技术人员能，例如，测定DmGPCR和要测试的化合物之间复合物的形成。另外，本领域技术人员还能检测DmGPCR与其底物之间由于要测试的化合物导致的复合物形成的减少。本发明的另一个方面涉及鉴定调节(即增加或减少)DmGPCR活性的化合物的方法，包括使DmGPCR与化合物接触，测定化合物是否改变DmGPCR的活性。比较在测试化合物存在下的活性与不存在测试化合物的情况下的活性。含有测试化合物的样品的活性比缺乏测试化合物的样品中的活性高，化合物应提高了活性。类似的，含有测试化合物的样品的活性比缺乏测试化合物的样品中的活性低，化合物应抑制了活性。本发明特别在各种活性试验中通过使用DmGPCR筛选化合物。要筛选的化合物包括(可包括怀疑调节DmGPCR活性的化合物)，但不限于，胞外、胞内、生物学或化学起源的化合物。在这些试验中使用的DmGPCR多肽可以是任何形式，例如游离在溶液中，固定在固相载体上，携带于细胞表面或位于细胞内。本领域技术人员能，例如，测定DmGPCR和要测试的化合物之间复合物的形成。另外，本领域技术人员还能检测DmGPCR与其底物之间由于要测试的化合物导致的形成的复合物减少。本发明DmGPCR多肽的活性可通过例如与化学合成的肽配体结合或被其激活的能力测定。另外，可通过测定其与钙离子、激素、趋化因子、神经肽、神经递质、核苷酸、脂、有味物质和光子结合的能力来测定DmGPCR的活性。另外，DmGPCR的活性可通过测定效应物分子，包括但不限于腺苷酸环化酶、磷脂酶和离子通道的活性来测定DmGPCR活性。因此，DmGPCR活性的调节剂可改变DmGPCR受体功能，例如受体的结合性质或活性，例如G蛋白介导的信号转导或膜定位。在方法的各种实施方式中，试验可以采用离子流试验、酵母生长试验、非水解性GTP试验(例如[35S]GTPγS试验)、cAMP试验、三磷酸肌醇试验、二酰基甘油试验、水母发光蛋白试验、荧光素酶试验、胞内Ca2+浓度的FLIPR试验、有丝分裂试验、MAP激酶活性试验、花生四烯酸释放试验(例如使用[3H]-花生四烯酸)和胞外酸化速率试验，以及其它本领域已知的DmGPCR活性的基于结合或功能的试验形式。在本发明这些实施方式中，有些包括任何本领域已知的G蛋白，例如G16、G15，或嵌合Gqi5，Gqs5，Gqo5，Gqz5等。可用本领域技术人员熟知的FaRP活性试验中所用的方法测定DmGPCR活性。本发明的DmGPCR受体的生物活性包括但不限于与天然或非天然配体的结合，以及本领域已知的GPCR的任一种功能活性。GPCR活性的非限制性例子包括各种形式的跨膜信号传递，可涉及G蛋白结合和/或对各种鸟苷酸的G蛋白结合的影响；另一种GPCR的示范性活性是与已知G蛋白不同的辅助蛋白或多肽结合。本发明的调节剂显示了各种化学结构，可通常分类为天然DmGPCR受体配体的非肽类模拟物、DmGPCR受体的肽和非肽变构效应物、和可作为DmGPCR受体的激活剂或抑制剂(竞争性、抗竞争性和非竞争性)(例如抗体产物)。本发明不限制合适调节剂的来源，可以获自天然来源，例如植物、动物或矿物提取物，或非天然来源，例如小分子文库，包括文库构建的组合化学方法产物和肽文库。DmGPCR受体的肽调节剂的例子显示以下的一级结构GLGPRPLRF酰胺(SEQIDNO49)，GNSFLRF酰胺(SEQIDNO136)，GGPQGPLRF酰胺(SEQIDNO102)，GPSGPLRF酰胺(SEQIDNO103)，PDVDHVFLRF酰胺(SEQIDNO150)，和焦-EDVDHVFLRF酰胺(SEQIDNO167)。可用检测酶活性的其它试验包括但不限于光度分析、放射分析、HPLC、电化学等，如ENZYMEASSAYSAPRACTICALAPPROACH，R.Eisenthal和M.J.Danson编，1992，OxfordUniversityPress所述，在此完整引入以供参考。在活性试验中编码GPCR的cDNA的用途是熟知的，在高通量筛选(HTS)中每天能测试数以千计未知化合物的试验方法有详细的记录。文献中满是在HTS结合试验中使用放射性标记的配体开发药物的例子(见Williams，MedicinalResearchReviews，1991，11，147-184；Sweetnam，等，J.NaturalProducts，1993，56，441-455的综述)。对于结合试验HTS，重组受体是优选的，因为它们具有更好的特异性(更高的相对纯度)，能产生大量受体物质，并能以各种各样的形式使用(见Hodgson，Bio/Technology，1992，10，973-980，在此完整引入以供参考)。各种异源系统对于本领域技术人员熟知的重组受体的功能性表达是可行的。这些系统包括细菌(Strosberg，等，TrendsinPharmacologicalSciences，1992，13，95-98)，酵母(Pausch，TrendsinBiotechnology，1997，15，487-494)，几种昆虫细胞(VandenBroeck，Int.Rev.Cytology，1996，164，189-268)，两栖动物细胞(Jayawickreme等，Curr.Opin.Biotechnol.，1997，8，629-634)和几种哺乳动物细胞系(CHO，HEK293，COS，etc.；见Gerhardt，等，Eur.J.Pharmacology，1997，334，1-23)。这些例子不排除使用其它可能的细胞表达系统，包括从线虫获得的细胞系(PCT申请，WO98/37177)。在本发明的一些实施例中，筛选能调节DmGPCR活性的化合物的方法包括使测试化合物与DmGPCR接触，并分析该化合物与DmGPCR之间形成的复合物的存在。在这样的试验中，通常标记配体。适当培养后，将游离配体与存在的结合形式相分离，游离的或未复合标记的量是特定化合物与DmGPCR结合能力的衡量指标。熟知在重组系统中异源受体的活化可导致各种生物反应，它们是由宿主细胞中表达的G蛋白介导的。激动剂占据GPCR可导致Gα亚基的结合位点上结合的GDP变换成GTP；可用GTP的放射性、非水解性衍生物[35S]GTPγS测定激动剂与受体的结合(Sim等，Neuroreport，1996，7，729-733)。还可用这种结合通过在已知激动剂存在下，[35S]GTPγS结合的减少测定拮抗剂与受体的结合。因此，可以构建基于[35S]GTPγS结合的HTS试验。功能性表达异源GPCR所需的G蛋白可以是宿主细胞的天然成分，或可通过熟知的重组技术引入。G蛋白可以是完整或嵌合的。通常，可利用接近普遍存在的竞争性G蛋白(例如Gα16)将任何给出的受体与可检测的应答途径相联系。G蛋白激活导致刺激或抑制其它天然蛋白，可能与可测定的反应相联系的活性。这些生物反应的例子包括但不限于下列在特别工程改造的酵母细胞中和不存在极限营养物情况下存活的能力(Pausch，TrendsinBiotechnology，1997，15，487-494)；如荧光染料测定胞内Ca2+浓度的改变(Murphy，等，Curr.Opin.DrugDisc.Dev.，1998，1，192-199)。还可用荧光变化监测配体诱导的膜电势或胞内pH的变化；为此目的，描述了适合HTS的自动化系统(Schroeder，等，J.BiomolecularScreening，1996，1，75-80)。用非洲爪蟾(Xenopuslaevis)制备的黑色素细胞显示在对异源性GPCR活化的反应中色素组织结构的配体依赖性变化；该反应能适应HTS形式(Jayawickreme，等，Curr.Opin.Biotechnol.，1997，8，629-634)。还可进行共同的第二信使(包括cAMP、磷酸肌醇和花生四烯酸)测定。使用这些受体的HTS方法包括永久转染的CHO细胞，其中可通过特异性改变这些细胞制备的膜中[35S]GTPγS结合的能力来鉴定激动剂和拮抗剂。在本发明的另一个实施例中，永久性转染的CHO细胞可用于制备含有显著数量重组受体蛋白的膜；这些膜制备物然后可用于使用该特定受体特异性放射标记配体的受体结合试验。另外，可用于HTS的功能试验，例如荧光监测含有这些受体之一或受体组合的永久性转染CHO细胞中胞内Ca2+浓度或膜电势配体诱导的变化。同样有用的是另一种形式的哺乳动物细胞，例如HEK293或COS细胞的相似形式。本领域技术人员熟知的HTS形式中，永久转染的昆虫细胞系，例如果蝇S2细胞，和表达果蝇受体的重组酵母细胞(例如Pausch，TrendsinBiotechnology，1997，15，487-494)也可用于本发明。本发明考虑多种筛选和鉴定DmGPCR受体的配体结合抑制剂。在一个例子中，DmGPCR受体被固定，在存在和不存在候选调节剂，例如抑制剂化合物的情况下评估DmGPCR与结合配体的相互作用。另一个例子，在溶液试验中，存在和不存在候选抑制剂化合物的情况下分析DmGPCR受体与其结合配体之间的相互作用。在两种试验中，鉴定到能减少DmGPCR受体与其结合伴侣之间的结合的化合物作为其抑制剂。另一种考虑的试验涉及双杂交试验的变化，其中通过检测转化或转染的宿主细胞中正信号鉴定蛋白/蛋白相互作用的抑制剂，如PCT出版物号WO95/20652所述，1995年8月3日出版。本发明考虑的候选调节剂包括选自可能的激活剂或可能的抑制剂文库的化合物。有许多不同的文库，可用于鉴定小分子调节剂，包括(1)化学文库，(2)天然产物文库，和(3)包括随机肽、寡核苷酸或有机分子的组合文库。化学文库包括随机化学结构，其中的一些是已知化合物的类似物或在其它药物开发筛选中被鉴定为“命中”或“先导”化合物的类似物，其中一些衍生自天然产物，还有一些从非定向合成有机化学物质产生。天然产物文库是用于建立筛选混合物的微生物、动物、植物、或海洋生物的集合，该文库可通过(1)发酵和从土壤、植物或海洋微生物产生肉汤并提�。�(2)植物或海洋生物的提取而建立的。天然产物文库包括多聚酮化合物、非核糖体肽及其(非天然发生的)变体。组合文库包括大量肽、寡核苷酸或有机化合物，作为混合物。这些文库用传统的自动化合成方法、PCR、克隆或专利合成方法是较容易制备的。特别感兴趣的是非肽组合文库。其它感兴趣的文库包括肽、蛋白质、肽模拟物、多平行合成集合、重组和多肽文库。对于组合化学和从其建立的文库的综述，见Myers，Curr.Opin.Biotechnol.，1997，8，701-707。用本文所述的各种文库鉴定调节剂能够改变候选的“命中物”(或“先导物”)来优化“命中物”调节活性的能力。可设计本发明所考虑的其它候选抑制剂，包括结合伴侣的可溶形式，以及作为嵌合、或融合蛋白的结合伴侣。本文所用的“结合伴侣”广义上包括非肽调节剂，以及除了天然配体、抗体、抗体片段之外的神经肽的肽调节剂，和包含对鉴定出的DmGPCR基因的表达产物具有免疫特异性的抗体结构域的修饰的化合物。在本发明的其它实施例中，本发明的多肽被用作相互作用调节剂的鉴定、特征分析和纯化的研究工具。通过各种本领域已知的方法在本发明的多肽中掺入合适的标记，用多肽捕获作用性分子。例如，分子可与标记的多肽一起培育，洗涤除去未结合的多肽，定量测定多肽复合物。用不同浓度的多肽获得的数据计算多肽与蛋白复合物结合的数量、亲和力和结合的值。标记的多肽还可用作纯化该多肽与之相互反应的分子的试剂，该分子包括但不限于抑制剂。在亲和纯化的一个实施例中，多肽与层析柱共价偶联。提取细胞及其膜，各种细胞亚组分通过柱。分子与柱通过其与多肽的亲和力结合。从柱上回收多肽复合物，解离并对回收的分子进行蛋白测序。然后该氨基酸序列用于鉴定捕获分子，或用于设计从合适的cDNA文库克隆相应基因的寡核苷酸。另外，可鉴定显示与本发明DmGPCR配体具有相类似的性质，但较�。⑶冶热嘶蚨锾迥诘哪谠磁涮逑允靖ぐ胨テ诘幕衔�。当设计有机化合物时，本发明的分子可用作“先导”化合物。设计对已知药物学上有活性的化合物的模拟物，是开发基于这些“先导”化合物的药物中熟知的方法。通常用模拟物设计、合成和测试避免随机筛选大量分子中的目标性质。另外，通过分析本发明DNA编码的推定氨基酸序列得到的结构数据也可用于更具特异性的新药，从而使其具有更高的药物能力。比较本发明的蛋白质序列和所有可得到的数据库中的序列显示，本发明蛋白质与G蛋白偶联受体跨膜部分有显著同源性。因此，可用计算机建模根据可得到的其它蛋白质跨膜域的信息来发展本发明蛋白质推定的三级结构。因此，可设计基于DmGPCR的预测的结构的新颖配体。在一个具体实施例中，用本发明的筛选方法鉴定的新颖分子是低分子量有机分子，其中可用其制备口服的组合物或药物组合物，例如片剂。可制备何常规的给药方式，包括但不限于口腔、静脉内、皮肤、皮下、鼻、肌肉内或腹膜内给药的组合物或药物组合物，包括用本文所述的筛选方法鉴定的核酸分子、载体、多肽、抗体和化合物。载体或其它成分的性质依赖于具体的给药途径和要给药的本发明的具体实施方式。用于该情况的技术和方案的例子等可见Remington’sPharmaceuticalSciences，Osol，A(ed.)，1980，在此完整引入以供参考。这些低分子量化合物的剂量可由要治疗的疾病状态和病况，以及其它临床因素，例如要治疗的个体的体重或情况，以及施用化合物的途径决定。对于治疗动物，可施用约0.5mg/kg体重-500mg/kg体重的化合物。治疗通常是以较低剂量进行的，并继续到观察到所需的治疗结果。确定对个体施用的化合物的剂量和对生物施用化合物的模式的方法如1996年8月23日提交的美国临时专利申请号No.08/702,282，和1996年8月1日出版的国际专利出版号WO96/22976所述，在此完整引入以供参考，包括任何附图或表格。本领域技术人员应理解这些描述适用于本发明并可轻易对其适应。正确的剂量依赖于各种因素，例如要治疗的疾病的类型，使用的具体组合物，和个体的大小和生理状态。本文所述的治疗有效量可以最初由细胞培养物和动物模型估计。例如，可在动物模型中配制剂量，达到最初考虑被细胞培养试验中测定的IC50的循环浓度范围。还可确定药物和代谢物的血浆半衰期和在血浆、肿瘤和主要器官中的生物分布，以便于选择最适合抑制一种疾病的药物。可进行这样的测定，例如，可对用药物治疗的动物的血浆进行HPLC分析，还可用检测方法，例如X光、CAT扫描和MRI测定放射性标记的化合物的位置。可通过改变化学结构和重新测试，优化在筛选试验中显示强抑制活性，但药物动力学特性差的化合物。对此，可用显示良好药物动力学特征的化合物作为模型。还可通过测定血细胞组成进行毒性研究。例如，可在合适的动物模型中如下进行毒性研究1)对小鼠施用化合物(还应使用未治疗对照小鼠)；2)在各治疗组中通过小鼠尾静脉定期获得血样；和3)分析样品的红血细胞和白血细胞计数，血细胞组成和淋巴细胞对多形核细胞的百分数。对各给药方案与对照的比较结果将显示是否存在毒性。在各毒性研究结束时，可通过杀死动物(优选根据美国兽医学联合会的美国兽医学联合会指南报告PanelonEuthanasia，J.Amer.Vet.Med.Assoc.，1993，202，229-249上)进行进一步的研究。然后可通过肉眼观察尸体解剖，检查各治疗组的代表动物中转移、异常疾病或毒性的直接证据。记录组织中的肉眼可见的异常，对组织作组织学检查。本发明的化合物和方法，包括本文所述的筛选方法鉴定出的核酸分子、多肽、抗体、化合物，具有各种药物学和农业(例如杀虫剂)用途，并可用于例如治疗或预防外寄生虫导致的病况，或控制昆虫群体。本发明还包括在个体中激动(刺激)或拮抗DmGPCR天然结合伴侣有关的活性的方法，包括对所述个体施用其量足够对该激动或拮抗起作用的上述多肽之一的激动剂或拮抗剂。本发明的一个实施例是一种用本发明的蛋白质的激动剂或拮抗剂治疗个体外寄生虫导致的疾病或病况的方法，包括对个体施用其量足够激动或拮抗外寄生虫DmGPCR有关的功能的激动剂或拮抗剂。下文表4包含了本发明的多核苷酸和多肽。根据布达佩斯条约，本发明的克隆被保藏在农业研究典型培养物(NRRL)国际保藏单位，1815N.UniversityStreet，Peoria，Illinois61604，U.S.A。下面的表5提供了登录号和保藏日期。本发明还通过下面用于阐明本发明的实施例进行了说明。这些实施例不是为了，或被解释成限制本发明的范围。应清楚本发明可通过除了本文具体描述以外的方式实施。根据本文的教导，可进行对本发明的许多修改和改变，因此在本发明的范围内。本专利文件中提到的各专利、申请和印刷出版物在此完整引入以供参考。实施例实施例1DmGPCR的鉴定用各种基因搜索软件工具将Celera基因型果蝇数据库转换成预测的蛋白质和mRNA数据库，以预测将产生的mRNA(“PnuFlyPep”数据库)。基因搜索软件工具分析基因组数据库的方法是本领域技术人员已知的。用几种线虫(C.elegans)FaRPGPCR的核苷酸序列作为对上述mRNA数据库的查询序列。用各种工具，包括FASTA和缺口BLAST检索该数据库中具有相似性的区域(Altschul等，Nuc.AcidsRes.，1997，25，3389，在此完整引入以供参考)。简单说，代表基础局部排列对比检索工具的BLAST算法适合用于测定序列相似性(Altschul等，分子生物学杂志215403-410(1990)，在此完整引入以供参考)。通过生物技术信息国家中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公众可获得进行BLAST分析的软件。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的字，以鉴定高评分的配对(HSP)，当与数据库序列中同样长度的字排列对比时，匹配或满足某个正值的阈评分T。T称为相邻字评分阈值(Altschul等，见上)。找到这些起始的相邻字作为引发寻找含有它们的更长HSP的搜索的出发点。将找到的字沿着各序列双向延伸，直到能增加累计的排列对比评分。当(1)累计的排列对比评分从其最大达到值处下落数量X；(2)由于一个或多个负评分残基排列对比的累计，该累计评分达到0或以下；或(3)达到两序列之一的末端时，找到的字延伸被停止。BLAST算法参数W、T和X确定了排列对比的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)用作默认值的句长(W)为11，使用BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915-10919(1989))排列(B)为50，预期值(E)为10，M＝5，N＝-4，并比较双链。BLAST算法(Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1993，905873-5787，在此完整引入以供参考)和缺口BLAST算法还进行两条序列间相似性的统计学分析。BLAST算法提供的一种相似性测量方法是最小可能性之和(P(N))，其提供了可能性的指示，通过它可碰巧发生两条核苷酸或氨基酸序列之间的匹配。例如，如果在测试核酸的和DmGPCR核酸的比较中，最小可能性之和小于约1，优选更小于约0.1，更优选小于约0.01，和最优选小于约0.001，将核酸视为与DmGPCR基因或cDNA相似。从用于制备PnuFlyPep数据库的预测mRNA数据库检索到了对应于预测蛋白质的mRNA。这些被鉴定为下列核苷酸序列SEQIDNOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，和23，都与该查询序列具有统计学上显著的重叠同源性。核苷酸序列SEQIDNOs3，5，9，11，13，和15(对应于DmGPCRs2a，2b，5a，5b，6a，和6b)获自PCR克隆和对另一条鉴定到序列(未显示)的测序。这些序列每条都代表DmGPCR基因的剪接变体。实施例2DmGPCR的克隆cDNA制备从成年的果蝇(Drosophilamelanogaster)polyA+RNA(ClontechLaboratories，PaloAlto，CA)或成年果蝇总RNA(下文)制备cDNA。为了获得总RNA，冷冻麻醉果蝇的亲代原种(BiologicalSupplyCompany，Burlington，NC)，在含有10mlH2O、10mlFormula4-24InstantDrosophila培养基和6-10粒活性干酵母(BiologicalSupplyCompany)培养管中加入5-6只成年果蝇。每个试管末端放置聚氨酯泡沫栓，室温培育果蝇4-6周。在成熟期，冰冻该试管，将麻醉的果蝇倒入装在液氮中的50ml聚丙烯试管中。冷冻的果蝇储藏在-70℃，直到用研钵研磨它们，并在液氮存在下用杵捣碎。将粉末状组织和一些液氮滗到干冰上的50ml聚丙烯试管中。液氮蒸发后，将粉末状组织储藏在-70℃。为了制备RNA，将300mg粉末状组织置于干冰上的聚丙烯试管中，加入5ml6M盐酸胍的0.1MNaOAc，pH5.2溶液。用DEPC处理所有的溶液，或用DEPC-处理的dH2O制备，烘干所有的玻璃器皿，或使用没有使用过的塑料试验室器材，以减少Rnase污染的问题。试管旋转混合，然后置于冰上。用连续通过20，21，22号针头匀浆化粉末状组织。离心试管(100xg10min)，然后将2.5-3ml上清液铺在装在14×95mmUltraClear离心试管(BeckmanInstruments，Inc.，PaloAlto，CA)中8ml5.7M氯化铯0.1MNaOAc溶液的顶部。18℃下，样品在L8-70超离心机(BeckmanInstruments，Inc.)中以25000rpm离心18小时。滗去上清液，倒置试管晾干。将RNA的片状沉淀悬浮在200微升无Rnase的dH2O(QiagenInc.，Valencia，CA)中，然后用100微升无Rnase的dH2O淋洗两次(共400微升)。加入44微升3MNaOAc，pH5.2和1ml冷100％乙醇沉淀RNA。-70℃过夜储藏，14000rpm离心试管1小时(Eppendorf微量离心管5402)，用75％乙醇(用DEPC处理的dH2O制备)淋洗，沉淀溶于无Rnase的dH2O。在10mMTris-HCl，pH7.5中检测260或280nm的吸光度，用于估计RNA的浓度和纯度。根据SuperscriptII酶(GIBCOBRL，Rockville，MD)提供的方法制备第一链cDNA。在含有无Rnase的dH2O和250ng(2.5微升)随机引物的微量离心管中加入500ng(2微升)polyA+RNA或3微克(4微升)总RNA。试管(12微升)在70℃培育10分钟，冰上冷却，然后加入4微升5x第一链缓冲液、2微升0.1MDTT和1微升10mMdNTP混合物。25℃10分钟，42℃2分钟培育后，加入1微升(200单位)SuperscriptII，继续在42℃培育50分钟。70℃培育15分钟停止酶反应。为了除去与cDNA互补的RNA，加入2微升(2单位)RnaseH(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)，然后37℃培育20分钟。cDNA储藏在-20℃。PCR反应用标准的50/100微升PCR反应或热启动PCR反应，使用Ampliwax珠(PerkinElmerCetus，Norwalk，CT)扩增果蝇G蛋白偶联受体(DmGPCR)。用蒸馏水溶液引物(GenosysBiotechnologies，Inc.，TheWoodlands，TX)510μM浓度的′-和3′-引物，1μM的中间引物。各PCR反应物含有2-4单位rTthXLDNA聚合酶，1.2-1.5mMMg(OAc)2、200μM各dNTP、和200或400nM各引物。对于热启动PCR，各2-4微升引物加入32或36微升“下游”混合物(dH2O，3.3xXL-缓冲液，dNTP和Mg(OAc)2)(总体积40微升)。加入Ampliwax珠(PerkinElmerCetus)，75℃培育试管5分钟，室温冷却，然后加入60微升“上游”混合物(dH2O，3.3xXL-缓冲液，rTth和模板)。在perkinElmerSeries9600热循环仪中进行PCR扩增。热循环仪的典型程序包括94℃1分钟，然后是30轮扩增(94℃0.5分钟，60℃0.5分钟，72℃2分钟)，然后是60℃6分钟。为了在PCR产物上建立3′A-突出端(“加尾”)，在PCR扩增结束时加入1微升Taq聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)。72℃培育试管10分钟。在用TAE缓冲液(5)配制的1％琼脂糖凝胶中分析反应混合物。通常用QIAquick自旋柱(QIAGEN)纯化PCR产物。连接和转化将所有PCR产物连接入PCR3.1载体(Invitrogen)，根据厂商的说明，将连接好的产物转化入OneShotTMTOP10F′感受态细胞(Invitrogen)。在含有50微克氨苄青霉素/ml的LB肉汤培育要筛选插入物的转化株。用煮沸-裂解质粒小制备物法(5)或通过直接从转化的细菌扩增质粒DNA的“集落PCR”法(6)鉴定具有插入物的集落。DNA测序用Qiagen阴离子交换质粒试剂盒(QIAGEN-tip20)，从37℃培养过夜的5mlLB培养基中根据厂商指示分离DNA，制备要测序的DNA。通常采用四种引物(T7、M13反向，“有义”和“反义”)(表6)来测序各DNA。采用染料-终止子测序化学试剂，即BigDyeTM终止子试剂(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)或DYEnamicTMET终止子试剂盒(AmershamPharmaciaBiotech，Inc.，Piscataway，NJ)。根据厂商的推荐，进行测序反应。用Centri-Sep自旋柱(PrincetonSeparations，Adelphia，NJ)除去引物和未掺入的核苷酸。在AppliedBiosystems377自动化DNA测序仪上分析测序反应物。用Sequencher(GeneCodes，AnnArbor，MI)，序列分析程序(WisconsinPaekageVersion10.1，遗传学计算机小组(GCG)，Madison，WI)的GCG组装配和分析DNA序列，并通过(Informax，Bethesda，MD)的VectorNTI5.5的程序套装使DNA行使功能。表6DNA测序引物本发明DmGPCR克隆和测序的结果如下DmGPCR1用设计对应于PnuFlyPep34651的cDNA的PCR引物成功的扩增了从果蝇polyA+mRNA制备的cDNA制备物的PCR产物。对得到的产物进行克隆和测序。试验获得的序列与预测序列相同。获得了完整的克�。莆狣mGPCR1。DmGPCR2用设计成对应于PnuFlyPep67585的cDNA的PCR引物扩增PCR产物的最初尝试并不成功。将该预测序列与现存的线虫受体以及其它神经肽受体排列对比，显示预测序列的5’末端异常的长，提示可能在该侧的基因预测中有错误。用基因组序列作为向导，设计并测试了各种另选的5’PCR引物。这些引物组合之一，使用从总RNA制备的cDNA成功的得到了具有正确尺寸的产物。对衍生自PCR反应的克隆进行测序，显示扩增产物包含预测的5’和3’端，与预测序列相同，除了预测序列缺少6个氨基酸的延伸。比较克隆也揭示了存在两种剪接同工型，一种与预测序列相似(称为DmGPCR2a)，另一条缺少位于经过TMVIII进入分子的胞内C末端的23个氨基酸延伸段(称为DmGPCR2b)。DmGPCR3文献中已经报道了对应于DmGPCR预测蛋白质的基因。该基因(GenBank登录号M77168)被称作NKD，“一种发育调控的速激肽受体”。MonnierD，等，J.Biol.Chem.1992，267(2)，1298-302。比较M77168和PnuFlyPep68505序列显示预测的序列与cDNA显著不同。cDNA具有较长的5′末端，缺少一个编码51个氨基酸的外显子，并且在3′末端明显较短。对出版的序列设计PCR引物，用总RNA制各的cDNA获得PCR产物。该产物与报道的NKD序列的结构相同。DmGPCR4用对应于PnuFlyPep67393的cDNA设计扩增DmGPCR4的PCR引物。用总果蝇mRNA制备的cDNA文库获得并克隆了PCR产物。比较这些克隆和PnuFlyPep预测的序列，揭示序列相同，除了HMMGene预测的一个外显子不存在于任何克隆的PCR产物中。DmGPCR4最近被Lenz等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2000，273，571-577等克隆出，分类成第二个推测的咽侧体抑制素受体。DmGPCR5DmGPCR5(FlyPepCG7887)错误的含有移码突变。PnuFlyPep版本，PnuFlyPep67522(最近在文献中称为“速激肽相关肽的果蝇受体”(M77168)(LiXJ，等，EMBOJournal，1991，10(11)，3221-3229))，改正了该错误，但错误的预测了一些内部序列和C-末端。初看起来，对应于PnuFlyPep蛋白质的预测的cDNA与发表的序列相同。用PCR引物，从果蝇polyA+mRNA制备的cDNA混合物成功的扩增了正确大小的PCR产物。对克隆的PCR产物测序揭示，虽然整个剪接模式相同，但在PnuFlyPep序列中存在两个剪接错误。这些错误导致移码突变，随后是一个补偿的移码突变，导致在试验测定的和报道的序列之间，从氨基酸46位起有13个氨基酸的不同。该克隆的基因称为DmGPCR5a。另外，发现了DmGPCR5的剪接同工型。该变体编码N-末端胞外域有额外的3个氨基酸。该变体被称为DmGPCR5b。DmGPCR6对应于PnuFlyPep15731的GPCR已经在文献中被描述成“神经肽Y”受体(M81490.LiXJ，等，J.Biol.Chem.，1992，267(1)，9-12)。PnuFlyPep预测的序列与M81490在分子两端都不相同。PnuFlyPep15731在N末端与M81490相比具有额外的15个氨基酸。PnuFlyPep15731的3′末端也与M81490不同，是截短的，不含保守的TMVI和TMVII残基。用M81490的序列设计最初的PCR引物。用这些引物和来自总mRNA的模板，获得了PCR产物。克隆的PCR产物的检测揭示，它使用与M81490相同的处理模式。该克隆被称为“DmGPCR6a”。在克隆DmGPCR6a的过程中，发现了额外的剪接同工型。用交替剪接受体产生分子的另一个3′末端，用与6a大部分相同，但具有不同阅读框的序列产生了该同工型。另外，该克隆的开放阅读框延伸过3′PCR引物。检测3′末端的基因组序列揭示了许多可能的候选外显子。测试了对应于这些可能的外显子的PCR引物，直到发现可能扩增PCR产物。该产物称为6b。该基因组序列的检测还预测了PnuFlyPep15731的起始密码子ATG与含有额外的15个氨基酸的M81490起始密码子在同一个阅读框内，似乎PnuFlyPep15731起始密码子是真正的起始密码子。设计了新的5′PCR引物，其中加入了PnuFlyPep15731起始密码子，与两个3′PCR引物结合使用，扩增和克隆了DmGPCR6aL和DmGPCR6bL(长)。DmGPCR7扩增DmGPCR7基因产物的最初尝试并不成功。将该预测序列(PnuFlyPep67863)与其它GPCR排列对比，提示在分子3’末端的预测中可能有错误。预测序列的3’末端比大多数其它GPCR长得多。基因组序列的检测提示可能的错误发生在除去框内终止密码子的剪接预测中，该终止密码子本应得到正确尺寸的分子。设计了在该内含子内的3’PCR引物。另外，设计了新的5’PCR引物，以利用就在预测的起始密码子上游的框内ATG。PCR扩增来自总mRNA的cDNA得到具有预期尺寸的产物。DmGPCR7的PnuFlyPep和WO01/70980版本的N-末端都缺失两个氨基酸。如前所述，PnuFlyPep和FlyPepCG10626版本在C-末端都不正确。预测不正确的DmGPCR7基因产物版本是推测的果蝇白细胞激肽受体(例如Hewes&Taghert，GenomeRes.，2001，11，1126-1142；Holmes等，InsectMol.Biol.，2000，9，457-465)。然而，在本发明之前没有试验证据证实该推测。DmGPCR8用对PnuFlyPep预测的序列设计的PCR引物成功扩增了DmGPCR8。用衍生自polyA+RNA的cDNA作为PCR反应的模板。全部6个测序的克隆在结构上都与PnuFlyPep预测的序列相同。在68位(DNA序列)注意到有多态性，其中一半克隆在该位置是“C”，一半是“A”。该改变导致氨基酸改变，分别为Asp或Glu。Celera序列标为“A”，因此任选“A”克隆(Glu)用于进一步研究。没有获得正确朝向的“A”克�。虼私辛死肞meI的亚克隆步骤来除去来自原始pCR3.1克隆的插入，用PmeI消化的pCR3.1载体逆转其朝向。PnuFlyPep版本是正确的。然而WO01/70980缺少大约17个N-末端氨基酸和约15个内部氨基酸。该受体分类成推测的抑生长素样受体(例如Hewes&Taghert，GenomeRes.，2001，11，1126-1142)。在该发明之前，没有试验证据确认该推测。DmGPCR9用对PnuFlyPep预测序列设计的PCR引物以及从polyA+RNA制备的cDNA模板克隆DmGPCR9。在PnuFlyPep中正确预测了基因组结构。DmGPCR10用DmGPCR10(PnuFlyPep70325)设计的引物产生PCR产物的最初尝试是不成功的。预测的cDNA的检测显示，预测的序列是不寻常的，因为它不含有高度保守的TMVI中的“WXP”基序，也不含有TMVII的“NPXXF”基序，虽然存在几个其它的保守残基。检测最后一个外显子下游80kb的基因组序列没有揭示任何其它的可能外显子。没有尝试获得DmGPCR10的完整克隆。DmGPCR11(咽侧体抑制素样肽受体)用出版的序列设计“咽侧体抑制素样肽受体”的PCR引物。Birgul等，EMBOJournal，1999，18(21)，5892-5900。用衍生自总mRNA制备物的cDNA获得PCR产物，克隆并测序。编码蛋白质的最终cDNA与出版物所述的相同。实施例3RNA印迹分析可进行RNA印迹分析，检测mRNA的表达。如上所述用有义朝向的寡核苷酸和反义朝向的寡核苷酸作为引物，扩增了一部分选自SEQIDNO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，和23的核苷酸序列的GPCRcDNA序列。来自Clontech(人II#7767-1)的多个人组织RNA印迹与探针杂交。预杂交在42℃，5xSSC，1xDenhardt′s试剂，0.1％SDS，50％甲酰胺，250mg/ml鲑鱼精DNA中进行4小时。杂交在同样的混合物中42℃过夜进行，加入约1.5×106cpm/ml标记的探针。通过RediprimeDNA标记系统(AmershamPharmacia)用α-32P-dCTP标记探针，在Nick柱(AmershamPharmacia)上纯化，加到杂交溶液中。42℃下，在0.2xSSC和0.1％SDS中洗涤几次滤膜。在-80℃下，用增强掩模使滤膜在KodakXAR胶片(EastmanKodakCompany，Rochester，N.Y.，USA)上曝光。实施例4在真核细胞中重组表达DmGPCR在哺乳动物细胞中表达DmGPCR为了制备DmGPCR蛋白，在合适的宿主细胞中用合适的表达载体和标准的基因工程技术表达DmGPCR编码的多核苷酸。例如，将实施例1所述的DmGPCR编码的序列亚克隆入商品表达载体pzeoSV2(Invitrogen，SanDiego，CA)，用转染试剂FuGENE6(Boehringer-Mannheim)转染入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，产品插页中提供了转染方案。其它真核细胞系，包括例如人胚肾(HEK293)和COS细胞也是合适的。通过在100微克/毫升zeocin(Stratagene，LaJolla，CA)存在下培养，选择稳定表达DmGPCR的细胞。可任选的，可用标准层析技术从细胞纯化DmGPCR。为了促进纯化，产生对应于DmGPCR氨基酸序列的部分的一种或多种合成性肽序列的抗血清，用该抗血清亲和纯化DmGPCR。DmGPCR还可与尾序列(例如聚组氨酸、血凝素、FLAG)一起在框内表达，以促进纯化。此外，将会知晓DmGPCR多肽的许多用途，例如下述试验，不需要从宿主细胞纯化DmGPCR。在293细胞中表达DmGPCR对于DmGPCR在293细胞中的表达，用载体pSecTag2A(Invitrogen)制备了携带相关DmGPCR编码序列的质粒。载体pSecTag2A含有用于分泌的小鼠IgK链前导序列，可用抗-myc抗体检测重组蛋白的c-myc表位，用于镍螯合层析的C-末端聚组氨酸，和用于选择稳定的转染子的zeocin抗性基因。通过常规方法测定该GPCRcDNA的正向引物，优选含有核苷酸的5′延伸，以引入HindIII克隆位点和与GPCR序列匹配的核苷酸。还用常规方法检测了反向引物，优选含有5′核苷酸延伸，以引入用于克隆的XhoI限制性位点和对应于DmGPCR序列的反向互补物的核苷酸。PCR条件是退火温度为55℃。凝胶纯化PCR产物，克隆入载体的HindIII-XhoI位点。用Qiagen层析柱纯化DNA，用DOTAP转染培养基(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)转染入293细胞。在转染24小时后，用抗His和抗-DmGPCR肽抗体进行蛋白质印迹分析，测试瞬时转染细胞的表达。用Zeocin选择永久性转染细胞并增殖。通过用抗-His、抗-Myc或抗-GPCR肽抗体进行蛋白质印迹分析，从细胞和培养基中都检测到重组蛋白质的产生。DmGPCR在COS细胞中的表达为了在COS7细胞中表达DmGPCR，可将含有选自SEQIDNO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，或23的核苷酸序列的多核苷酸分子克隆入载体p3-CI中。该载体是pUC18衍生的质粒，其中含有HCMV(人巨细胞病毒)启动子-位于bGH(牛生长激素)聚腺苷酸序列上游的内含子和一个多克隆位点。另外，该质�：衐hfr(二氢叶酸还原酶)基因，其可在药物氨甲蝶呤(MTX)存在下选择稳定的转化株。用常规方法确定正向引物，优选含有5′延伸，以引入用于克隆的XbaI限制性位点，然后是对应于选自SEQIDNOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，或23的核苷酸序列的核苷酸。也用常规方法确定了反向引物，优选含有核苷酸的5′延伸，引入SalI克隆位点，随后是对应于SEQIDNOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，o或23的核苷酸序列的反向互补物。PCR包括在95℃5分钟的最初变性步骤，30轮，95℃30秒变性，58℃退火30秒，和在72℃延伸30秒，随后是在72℃延伸5分钟。该PCR产物通过凝胶纯化，连接入载体p3-CI的XbaI和SalI位点。该构建物转化入大肠杆菌细胞，用于扩增和DNA纯化。用Qiagen层析柱纯化DNA，用BRL的Lipofectamine试剂根据厂商说明书转染入COS7细胞。转染48和72小时后，测试培养基和细胞中的重组蛋白质表达。可通过将细胞生长培养基浓缩到约10mg蛋白质/ml，然后通过例如层析纯化蛋白质，来纯化COS细胞培养物表达的DmGPCR。纯化的DmGPCR在装有YM-10膜的Amicon浓缩机中浓缩到0.5mg/ml，储藏在-80℃。昆虫细胞中DmGPCR的表达为了在杆状病毒系统中表达DmGPCR，可用PCR扩增选自SEQIDNO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，或23的核苷酸序列的多核苷酸分子。用常规方法确定正向引物，优选含有加上NdeI克隆位点的5′延伸，然后是对应于选自SEQIDNO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，或23的核苷酸序列的核苷酸。还通过常规方法确定了反向引物，优选具有引入KpnI克隆位点的5′延伸，随后是对应于选自SEQIDNO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，或23的核苷酸序列的反向互补物的核苷酸。凝胶纯化PCR产物，用NdeI和KpnI消化，克隆入载体pAcHRL-A(Pharmingen，SanDiego，CA)的对应位点。pAcHTL表达载体含有Autographacalifornica核多面体病病毒(AcMNPV)的强聚多角体蛋白启动子和在多克隆位点上游的6Xhis尾。还存在为了磷酸化的蛋白质激酶位点和为了在多克隆位点前切下重组蛋白的凝血酶位点。当然，也可用许多其它杆状病毒代替pAcHTL-A，例如pAc373、pVL941和pAcIM1。还可使用其它表达GPCR多肽的合适的载体，条件是如需要，该载体构建应包括转录、翻译和运输的定位信号，例如框内AUG和信号肽。这些载体如Luckow等，Virology17031-39等所述。用标准杆状病毒表达法，如Summers等(AMANUALOFMETHODSFORBACULOVIRUSVECTORSANDINSECTCELLCULTUREPROCEDURES，TexasAgriculturalExperimentalStationBulletinNo.1555(1987))所述培养和分离病毒。在一个实施例中，用“BaculoGold”转染试剂盒(Pharmingen，SanDiego，CA)使用厂商提供的方法将含有DmGPCR基因的pAcHLT-A引入杆状病毒。在转染后24小时，用35S-甲硫氨酸放射性标记的感染的细胞分析单个细胞分离物的蛋白质生产。感染后48小时收集感染的细胞，用SDS-PAGE显示标记的蛋白。可分离显示高表达水平的病毒，并用于大规模表达。为了在Sf9细胞中表达DmGPCR多肽，可用上述用于杆状病毒表达的引物和方法进行PCR，扩增具有选自SEQIDNO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，或23的核苷酸序列的多核苷酸分子。将DmGPCRcDNA克隆入载体pAcHLT-A(Pharmingen)中，在Sf9昆虫细胞中表达。除去内部NdeI位点(用上述杆状病毒表达相同的引物)后将该插入物克隆入NdeI和KpnI位点。用Qiagen层析柱纯化DNA，在Sf9细胞中表达。测试了未纯化噬斑的初步蛋白质印迹试验中与GPCR特异性抗体反应的具有预期大小的重组蛋白质。在HIG5细胞中进一步纯化和表达优化后，确认了这些结果。实施例5相互作用捕获/双杂交系统为了测试DmGPCR作用蛋白，可用该相互作用捕获/双杂交文库筛选法。该试验首先在Fields，等，Nature，1989，340，245中描述，在此完整引入以供参考。在CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NY，1999，和Ausubel等，SHORTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，第四版，GreeneandWiley-interseience，NY，1992中出版了一种方法，在此完整引入以供参考。试剂盒可购自Clontech，PaloAlto，CA(Matchmaker双杂交系统3)。在合适的质粒(即pGBT7)中用标准亚克隆技术构建了编码所有或部分DmGPCR和酵母转录因子GAL4DNA结合域(DNA-BD)的核苷酸序列的融合物。类似的，在来自可能的GPCR结合蛋白的cDNA的第二个质粒(即pGADT7)中构建了GAL4活性域(AD)融合文库(形成cDNA文库的方法见Sambrook等，MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL，第二版，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NY，1989，在此完整引入以供参考)。通过测序验证了DNA-BD/GPCR融合构建体，测试了自主报道基因活化和细胞毒性，两者都会阻止双杂交分析。用AD/文库融合构建体进行类似的控制，确保宿主细胞中的表达，和缺乏转录活性。用GPCR和文库融合质粒根据标准方法(Ausubel等，SHORTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，第四版，GreeneandWiley-interscience，NY，1992，在此完整引入以供参考)转化酵母细胞(约105个转化株/mgDNA)。DNA-BD/GPCR与AD/文库蛋白的体内结合导致特定酵母质粒报道基因(即lacZ、HIS3、ADE2、LEU2)的转录。将酵母细胞接种在营养缺陷培养基上，筛选报道基因的表达。检测在补充有Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的培养基中生长后，集落的β-半乳糖苷酶活性两次(β-半乳糖苷酶活性的滤膜试验如Breeden等，ColdSpringHarb.Symp.Quant.Biol.，1985，50，643中所述，在此完整引入以供参考)。从转化株拯救阳性AD文库质粒，重新引入原始酵母株和其它含有无关的DNA-BD融合蛋白的菌株，来确认特定的DmGPCR/文库蛋白作用。对插入的DNA进行测序，以验证与GAL4AD融合的开放阅读框的存在，并检测DmGPCR-结合蛋白的身份。实施例6用凝胶电泳进行迁移率变动DNA-结合试验凝胶电泳迁移率变动试验可迅速的检测特异性蛋白质-DNA作用。方法在手册中广泛可得，例如Sambrook等，MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL，第二版，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NY，1989，和Ausubel等，SHORTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，第四版，GreeneandWiley-interscience，NY，1992等手册中所述，在此完整引入以供参考。从合成性寡核苷酸、限制性内切酶片段或PCR片段获得探针DNA(＜300bp)，末端用32P标记。在稳定温度下(22-37℃)，在含有放射性标记的探针DNA、非特异性载体DNA(约1微克)、BSA(300μg/ml)、和10％(v/v甘油)的10-15微升缓冲液(即TAE或TBE，pH8.0-8.5)中，培育一等份纯化的DmGPCR(约15微克)或粗DmGPCR提取物(约15ng)至少30分钟。然后将反应混合物加到聚丙烯酰胺凝胶上，在30-35mA运行，直到游离的探针DNA与蛋白质-DNA复合物良好分开。然后干燥凝胶，用放射性自显影检测对应于游离DNA和蛋白质-DNA复合物的条带。实施例7DmGPCR抗体用标准技术产生DmGPCR的多克隆或单克隆抗体，产生其有用的抗体结合片段或其变体，包括“人源化”变体。这些方法可在例如Sambrook等(1989)，见上文和Harlow等(编)，ANTIBODIESALABORATORYMANUAL，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY，1988中发现。在一个实施例中，重组DmGPCR多肽(或含有这些多肽的细胞或细胞膜)用作产生抗体的抗原。在另一个实施例中，用具有对应于DmGPCR的免疫原性部分(例如6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或更多个氨基酸)的氨基酸序列的一种或多种肽作为抗原。对应于DmGPCR胞外部分的肽，尤其是亲水胞外部分，属于本发明。抗原可与佐剂混合，或与半抗原连接，以增加抗体生产。多克隆或单克隆抗体作为示范性方法，用重组DmGPCR或其合成片段免疫小鼠，产生单克隆抗体(或更大的哺乳动物，例如家兔，获得多克隆抗体)。为了提高抗原性，肽与匙孔血蓝蛋白(Pierce)根据厂商推荐偶联。首次注射，抗原用弗氏完全佐剂乳化，皮下注射。间隔两到三周，用弗氏不完全佐剂乳化其它等份的DmGPCR抗原，皮下注射。在最后一次加强注射前，从接种的小鼠获得血清样品，用蛋白质印迹评估与DmGPCR免疫反应的抗体的存在。可用来自接种的动物的血清作为多克隆抗血清或用于分离识别DmGPCR的多克隆抗体。另外，可杀死小鼠，取下其脾脏用于产生单克隆抗体。为了产生单克隆抗体，将脾脏置于10ml无血清RPMI1640中，通过在补充有2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(RPMI)(Gibco，Canada)的无血清RPMI1640中研磨脾脏，形成单细胞悬液。过滤细胞悬液，离心洗涤，重新悬浮在无血清RPMI中。以相似方式制备来自三只未免疫的Balb/c小鼠的胸腺细胞，用作饲养细胞层。对数期NS-1骨髓瘤细胞在融合之前3天置于补充有10％胎牛血清(FBS(HycloneLaboratories，Inc.，Logan，Utah))的RPMI中，离心并充分洗涤。为了产生杂交瘤融合体，将免疫小鼠的脾脏细胞与NS-1细胞混合，离心，并吸去上清液。轻拍试管使细胞沉淀脱落，将沉淀与2ml37℃PEG1500(75mMHEPES，pH8.0中的50％溶液)(Boehringer-Mannheim)搅拌，然后加入无血清RPMI。然后，离心细胞，重新悬浮在含有15％FBS、100μM次黄嘌呤、0.4μM氨基喋呤、16μM胸腺嘧啶(HAT)(Gibco)、25单位/mlIL-6(Boehrnger-Mannheim)和1.5×106胸腺细胞/ml的RPMI中，铺在1O个Corning平底96孔组织培养板(Corning，CorningNewYork)上。在融合后第2、4和6天，从融合平板的孔中吸去100微升培养基，用新鲜培养基置换。第8天，用ELISA筛选融合物，测试是否存在能与DmGPCR结合的小鼠IgG的存在。通过稀释进一步克隆所选的融合孔，直到获得产生抗-DmGPCR抗体的单克隆培养物。抗-DmGPCR单克隆抗体的人源化如本文所述的DmGPCR的表达模式和GpCR作为治疗干预已被证明的跟踪记录提示了DmGPCR抑制剂(拮抗剂)的治疗指征。DmGPCR中和抗体是一类用作DmGPCR拮抗剂的治疗剂。下面是人源化本发明的单克隆抗体的方法。人源化的原理在文献中有所述，并且受到抗体蛋白的�？榕帕写俳Ｎ司】赡芗跎俳岷喜固宓目赡苄裕墒褂肐gG4同种型的人源化抗体。例如，可通过产生含有感兴趣的非人抗体蛋白的可变区和人抗体分子恒定区的嵌合抗体，实现一定的人源化水平(见例如Morrison等，Adv.Immunol.，1989，44，65-92)。从B细胞杂交瘤的基因组DNA或从分离自感兴趣的杂交瘤的mRNA产生的cDNA克隆DmGPCR中和性抗-DmGPCR抗体的可变域。V区基因片段与编码人抗体恒定区的外显子连接，得到的构建物在合适的宿主细胞(例如骨髓瘤或CHO细胞)中表达。为了实现甚至更高水平的人源化，仅将非人单克隆抗体基因编码抗原结合性互补决定区(“CDR”)的可变区基因片段的部分克隆入人抗体序列(见例如Jones等，Nature，1986，321，522-525；Riechmann等，Nature，1988，332，323-327；Verhoeyen等，Science，1988，239，1534-36；和Tempest等，Bio/Technology，1991，9，266-71)。如需要，将人抗体包围CDR3区的β-折叠框架修饰成更加接近镜像对映起始单克隆抗体抗原结合域的三维结构(见Kettleborough等，ProteinEngin.，1991，4，773-783；和Foote等，J.Mol.Biol.，1992，224，487-499)。在另一种方法中，通过改变非人抗体所选的表面残基，例如通过定点诱变来人源化感兴趣的非人单克隆抗体表面，同时保留该非人抗体所有的内部和接触残基。见Padlan，MolecularImmunol.，1991，28(4/5)，489-98。用DmGPCR中和性抗GPCR单克隆抗体和产生它们的杂交瘤进行上述方法，从而产生了用作治疗剂的人源化DmGPCR中和性抗体，用于治疗或减轻DmGPCR的表达或配体介导的DmGPCR信号传递起有害作用的疾病。实施例8鉴定DmGPCR活性的调节剂的试验下面是几种非限制性的用于鉴定DmGPCR活性的调节剂(激动剂和拮抗剂)的试验。在可通过这些试验鉴定的调节剂中有受体的天然配体化合物、天然配体的合成类似物和衍生物；抗体；抗体片段；和/或衍生自天然抗体或来自抗体样组合文库的抗体样化合物；和/或通过文库的高通量筛选鉴定出的合成性化合物等。与DmGPCR结合的调节剂用于鉴定组织样品(例如用于诊断目的、病理目的等)中的DmGPCR。激动剂和拮抗剂调节剂分别用于上调和下调DmGPCR活性。可用一个推定的调节剂。和/或可用已知的激动剂组合候选拮抗剂(反之亦然)进行该试验。cAMP试验在一类试验中，在已接触候选调节剂化合物的DmGPCR转染的细胞中测定环化腺嘌呤一磷酸(cAMP)的水平。cAMP分析的方法在文献中有所描述(见例如Sutherland等，Circulation，1968，37，279；Frandsen等，LifeSciences，1976，18，529-541；Dooley等，J.Pharm.andExper.Ther.，1997，283(2)，735-41；和George等，J.BiomolecularScreening，1997，2(4)，235-40)。下文列出了这些试验的示范性方法，使用NENTMLifeScienceProducts的腺苷酸环化酶活化FlashPlate试验。简单说，将DmGPCR编码序列(例如DNA或无内含子的基因组DNA)亚克隆入市售表达载体，例如pzeoSV2(Invitrogen)，用已知方法，例如Boehringer-Mannheim提供的转染方法，在提供FuGENE6转染试剂时将该表达载体瞬时转染入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。将转染的CHO细胞接种入FlashPlate分析试剂盒的96孔微量滴定板，该板用固体闪烁剂包裹，在其上结合有cAMP抗血清。作为对照，一些孔接种有野生型(未转染)CHO细胞，平板中的其它孔接受不同量的cAMP标准溶液，用于建立标准曲线。在每个孔的细胞中加入一种或多种测试化合物(即候选调节剂)，用水和/或无化合物培养基/稀释剂作为对照。处理后，使cAMP在室温下，在细胞中聚集正好15分钟。加入含有[125I]-标记的cAMP裂解缓冲液终止试验，用PackardTopcountTM96孔微量滴定板闪烁计数器对平板进行计数。裂解细胞(或标准品)的未标记的cAMP与固定量的[125I]-cAMP竞争与平板上结合的抗体。构建标准曲线，通过内推法获得未知的cAMP值。响应接触测试化合物，细胞胞内cAMP水平的改变指示了DmGPCR调节活性。作为与G蛋白Gs亚型偶联受体激动剂的调节剂将刺激cAMP的产生，导致cAMP水平可测定的3-10倍增加。与G蛋白Gi/o亚型偶联受体的激动剂将抑制毛喉素刺激的cAMP产生，导致cAMP水平可测定的50-100％减少。作为反向激动剂的调节剂将逆转对组成性活化或由已知激动剂激活的受体的这些效果。水母发光蛋白试验在另一个试验中，用DmGPCR表达构建物和编码发光蛋白水母发光蛋白的构建物瞬时共转染细胞(例如CHO细胞)。在辅因子腔肠素的存在下，水母发光蛋白将发射可测量的光，其与胞内(胞质)游离钙量成比例(见例如Cobbold，等，“Aequorinmeasurementsofcytoplasmicfreecalcium，”于CELLULARCALCIUMAPRACTICALAPPROACH，McCormackJ.G.和CobboldP.H.，编，OxfordIRLPress，1991；Stable等，Anal.Biochem.，1997，252，115-26；和Haugland，HANDBOOKOFFLUORESCENTPROBESANDRESEARCHCHEMICALS，第六版，Eugene，或，MolecularProbes，1996)。在一个示范性试验中，将DmGPCR亚克隆入市售的表达载体pzeoSV2(Invitrogen)，用转染试剂FuGENE6(Boehringer-Mannheim)与编码发光蛋白水母发光蛋白的构建物(MolecularProbes，Eugene，OR)，用产品插页提供的转染方案瞬时共转染。在补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10U/ml青霉素和10μg/ml青霉素和10μg/链霉素的MEM(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)中37℃培养细胞24小时，此时将培养基更换成含有5μM腔肠素(MolecularProbes，Eugene，OR)的无血清MEM。然后继续在37℃培养2小时。随后，用VERSEN(Gibco/BRL)使细胞脱离，洗涤，并以200,000细胞/ml重新悬浮在无血清MEM中。在无血清MEM中制备候选DmGPCR调节剂化合物的稀释液，并以50μl/孔分散在不透明96孔试验板的诸孔中。然后将平板装到MLX微量滴定板发光测定仪(DynexTechnologies，Inc.，Chantilly，VA)上。该仪器程序设定能将50μl细胞悬液分散在各孔中，每孔测一次，立即阅读光度15秒。用每个光信号峰曲线下面积构建候选调节剂的剂量依赖曲线。用SlideWrite使用一位点配体的公式分析数据，获得EC50值。认为化合物导致的光度的改变指示了调节剂活性。作为与G蛋白Gq亚型偶联的受体的激动剂的调节剂使得光度提高了达100倍。作为反向激动剂的调节剂将逆转组成性活跃或被已知激动剂激活的受体的该效果。荧光素酶报道基因试验发光蛋白荧光素酶提供了另一种分析DmGPCR活性的调节剂的有用工具。用DmGPCR表达构建物(例如pzeoSV2中的DmGPCR)和包括在转录因子结合位点，例如cAMP反应元件(CRE)、AP-1或NF-κB下游的荧光素酶蛋白的基因的报道构建物瞬时共转染细胞(例如CHO细胞或COS7细胞)。能与G蛋白Gs亚型偶联受体结合的激动剂可导致cAMP增加，从而激活CRE转录因子，导致荧光素酶基因的表达。能与G蛋白Gq亚型偶联受体结合的激动剂可导致产生二酰基甘油，从而激活蛋白质激酶C，其能活化AP-1或NF-κB因子，从而导致荧光素酶基因的表达。荧光素酶表达水平反映了信号传递事件的激活状态。通常见George等，J.BiomolecularScreening，1997，2(4)，235-240；和Stratowa等，Curr.Opin.Biotechnol.，1995，6，574-581。可用例如Promega(Madison，WI)购得的荧光素酶试验试剂定量测定荧光素酶活性。在一个示范性试验中，在转染1天前，将CHO细胞以100,000细胞/孔的密度铺在24孔培养皿中，37℃在含有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10U/ml青霉素和10μg/ml链霉素的MEM(Gibco/BRL)中培养。用DmGPCR表达构建物和含有荧光素酶基因的报道构建体同时瞬时共转染细胞。报道质粒CRE-luciferase、AP-1-luciferase和NF-κB-luciferase可购自Stratagene(LaJolla，CA)。用FuGENE6转染试剂(Boehringer-Mannheim)根据厂商说明书进行转染。可用报道构建体转染的细胞作为对照。转染24小时后，用预温到37℃的PBS洗涤细胞一次，然后在细胞中加入无血清MEM(对照)或含有一种或多种候选调节剂的无血清MEM，在37℃培养细胞5小时。然后，用冰冷的PBS洗涤细胞一次，每孔加入来自Promega提供的荧光素酶分析试剂盒的100μl裂解缓冲液裂解。室温培育15分钟后，将15微升裂解物与50微升底物溶液(Promega)在不透明的白色96孔板中混合物，立即在Wallace1450型MicroBeta闪烁和发光计数器(WallaceInstruments，Gaithersburg，MD)上立即阅读光度。在存在和不存在候选调节剂化合物时的光度差异表明有调节剂活性。组成性活化或被激动剂活化的受体与单用报道基因转染的细胞比较，有3-20倍的刺激发光。作为反向激动剂的调节剂逆转该作用。使用FLIPR测定胞内钙水平胞内钙水平的变化是G-蛋白偶联受体活性的另一种已被认识的指标，该试验可用于筛选DmGPCR活性的调节剂。例如，将用DmGPCR表达载体稳定转染的CHO细胞以4×104细胞/孔的密度接种在Packard黑色壁的96孔板中，这种平板特别设计用来区别平板上各孔发出的荧光信号。细胞培养在含有36mg/L丙酮酸和1g/L葡萄糖和四种钙指示剂染料(Fluo-3TMAM、Fluo-4TMAM、CalciumGreenTM-1AM、或OregonGreenTM488BAPTA-1AM)之一，各为4μM浓度的改良Dulbecco′sPBS(D-PBS)中37℃60分钟。用改良D-PBS洗涤平板两次，37℃培育10分钟，从细胞膜上除去剩余的染料。另外，在激活钙反应之前立即用改良D-PBS进行一系列的洗涤。加入一种或多种候选受体激动剂化合物、钙离子载体A23187(10μM，阳性对照)、或ATP(4μM，阳性对照)引发钙反应。用具有氩激光(在488nm激发)的MolecularDevice的FLIPR测定荧光(见例如Kuntzweiler等，DrugDev.Res.，1998，44(1)，14-20)。检测仪照相机的F-光圈定为2.5，曝光长度为0.4毫秒。在加入候选激动剂、ATP或A23187之前测定细胞的基础荧光20秒，从反应信号中扣除基础荧光水平。测定钙信号约200秒，每两秒进行一次读数。钙离子载体A23187和ATP将钙信号提高到基线水平以上200％。通常，活化的GPCR将钙信号提高到基线信号以上约10-15％。有丝分裂试验在有丝分裂试验中，测定了候选调节剂诱导或抑制DmGPCR介导的细胞分裂的能力(见例如Lajiness等，J.Pharm.andExper.Ther.，1993，267(3)，1573-1581)。例如，稳定表达DmGPCR的CHO细胞以5000细胞/孔的密度被接种在96孔板中，37℃在补充有10％胎牛血清的MEM中培养48小时，此时用无血清MEM淋洗细胞两次。淋洗后，加入80微升新鲜MEM，或含有已知有丝分裂原的MEM，以及20微升含有在无血清培养基中稀释的不同浓度的一种或多种候选调节剂或测试化合物的MEM。作为对照，在各平板上一些孔仅接受无血清培养基，一些孔接受含有10％的胎牛血清的培养基。未转染的细胞或单独被载体转染的细胞也可用作对照。培养16-18小时后，在孔中加入1μCi的[3H]-胸腺嘧啶(2Ci/mmol)，37℃再培育细胞2小时。胰蛋白酶消化细胞，收集在细胞收集仪(Tomtec)的滤纸垫上；然后在Betaplate计数器中对滤纸进行计数。将无血清测试孔中掺入[3H]-胸腺嘧啶与血清刺激细胞(阳性对照)的结果比较。用多种浓度的测试化合物，用非线性最小二乘拟合公式A＝B×[C/(D+C)]+G建立和分析剂量反应曲线，其中A是血清刺激百分数；B是最大效果减基线；C是EC50；D是化合物的浓度；G是最大效果。参数B、C和G通过Simplex优化测定。预计与受体结合的激动剂能提高细胞内的[3H]-胸腺嘧啶掺入，显示对血清反应提高80％。能与该受体结合的拮抗剂将抑制已知激动剂所见的刺激，达100％。GTPγS结合试验由于G蛋白偶联受体通过胞内G蛋白传递信号，而胞内G蛋白的活性包括GTP结合和水解产生结合的GDP，测定存在和不存在候选调节剂情况下不可水解的GTP类似物[35S]GTPγS，提供了另一种调节剂活性的试验(见例如Kowal等，Neuropharmacology，1998，37，179-187)。在一个示范性试验中，被DmGPCR表达载体稳定转染的细胞在10cm组织培养皿中生长到亚汇合，用5ml冰冷的无Ca2+/Mg2+磷酸缓冲盐漂洗一次，刮到5ml相同的缓冲液中。离心(500xg，5分钟)沉淀细胞，重悬浮在TEE缓冲液(25mMTris，pH7.5，5mMEDTA，5mMEGTA)中，液氮冰冻。融化后，用Dounce匀浆器匀浆细胞(每板细胞1mlTEE)，在1,000xg离心5分钟，除去核和未破碎的细胞。20,000xg下离心匀浆上清液20分钟，分离膜组分，并用TEE洗涤膜沉淀一次，重悬浮在结合缓冲液(20mMHEPES，pH7.5，150mMNaCl，10mMMgCl2，1mMEDTA)中。可在液氮中冰冻重悬浮的膜，并储藏在-70℃下，直到使用。融化如上所述制备和储藏在-70℃的细胞膜的等份，匀浆，并以10-50μg/ml浓度稀释入含有20mMHEPES，10mMMgCl2，1mMEDTA，120mMNaCl，10μMGDP，和0.2mM抗坏血酸的缓冲液中。匀浆液以90微升的最终体积与不同浓度的候选调节剂化合物或100μMGTP30℃培育30分钟，然后置于冰上。对于每一个样本，加入10微升鸟嘌呤5′-O-(3[35S]硫)三磷酸(NEN，1200Ci.mmol；[35S]-GTPγS)实现最终浓度为100-200pM。样品在30℃再培育30分钟，4℃加入1ml10mMHEPES，pH7.4，10mMMgCl2，反应通过过滤终止。在WhatmanGF/B滤膜上过滤样品，用20ml冰冷的10mMHEPES，pH7.4，10mMMgCl2洗涤。用液体闪烁光度分析对滤膜进行计数。在100μMGTP存在下，测定[35S]-GTPγS的非特异性结合，从总数中扣除。选择与未转染对照细胞比较，调节[35S]-GTPγS在细胞中结合量的化合物。激动剂对受体的激活导致[35S]-GTPγS结合增加5倍。拮抗剂封阻该反应。MAP激酶活性试验评估表达GPCR的细胞中MAP激酶的活性提供了另一种鉴定DmGPCR活性的调节剂的试验方法。见例如Lajiness等，J.Pharm.andExper.Ther.，1993，267(3)，1573-1581和Boulton等，Cell，1991，65，663-675。在一个实施例中，试验48小时前，将用DmGPCR稳定转染的CHO细胞以70,000细胞/孔接种入6孔板中。在该48小时期间，在补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10U/ml青霉素和10μg/链霉素的MEM培养基中37℃培养细胞。在加入刺激剂之前，先血清饥饿细胞1-2小时。对于测试，用培养基单独或用含有候选激动剂或200nM佛波醇酯-乙酸肉豆蔻酯(即PMA，阳性对照)的培养基处理细胞，细胞在37℃下培育不同时间。为了停止该反应，平板铺在冰上，吸去培养基，用含有1mMEDTA的1ml冰冷PBS淋洗细胞。然后，在细胞中加入200微升细胞裂解缓冲液(12.5mMMOPS，pH7.3，12.5mM甘油磷酸，7.5mMMgCl2，0.5mMEGTA，0.5mM钒酸钠，1mM苯甲脒，1mM二硫苏糖醇，10μg/ml亮抑酶肽，10μg/ml抑蛋白酶肽，2μg/ml抑胃酶肽A，和1μM花生四烯酸)。将细胞从平板上刮下，通过233/4G针头10次进行匀浆，并20,000xg离心15分钟制备细胞液组分。将胞质溶胶等份(含有1-5微克蛋白质的5-10微升)与1mMMAPK底物肽(APRTPGGRR(SEQIDNO168)，UpstateBiotechnology，Inc.，N.Y.)和50μM[γ-32P]ATP(NEN，3000Ci/mmol)混合，稀释到最终比活力为约2000cpm/pmol，总体积为25微升。样品在30℃培育5分钟，在2cm2的WhatmanP81磷酸纤维素纸上点样20微升，终止反应。用1％H3PO4洗涤滤纸方块4次，对方块进行液体闪烁分光光度分析，定量结合的标记物。将等量的胞质溶胶提取物不与MAPK底物肽一起培育，将这些样品的结合标记物从用底物肽处理的匹配样品中扣除。各孔的胞质溶胶提取物可用作分离点。用蛋白质染料结合试验(BioRad，Laboratories)测定蛋白浓度。预计激动剂对该受体的激活导致MAPK酶活性增加达5倍。拮抗剂可封阻该增加。花生四烯酸释放观察到GPCR的活化增强了细胞中的花生四烯酸释放，提供了另一种GPCR活性调节剂的有用试验。见例如Kanterman等，MolecularPharmacology，1991，39，364-369。例如，将被DmGPCR表达载体稳定转染的CHO细胞以15,000细胞/孔铺在24孔板上，并在补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10U/ml青霉素和10μg/链霉素的MEM培养基中37℃培养细胞48小时，然后使用。用0.5μCl/ml的[3H]花生四烯酸(AmershamCorp.，210Ci/mmol)在1ml补充有10mMHEPES，pH7.5和0.5％无脂肪酸的牛血清清蛋白的MEM培养基中37℃标记各孔细胞2小时。然后用1ml相同的缓冲液洗涤细胞两次。将候选调节剂化合物单独或与10μMATP一起加到1ml相同缓冲液中，37℃培育细胞30分钟。仅用缓冲液和模拟转染的细胞作为对照。用对每孔的0.5ml样品进行液体闪烁分光光度计数。激活受体的激动剂导致ATP刺激的[3H]-花生四烯酸释放增强。该增强被拮抗剂封闭。胞外酸化速率在另一个试验中，通过监测测试化合物中诱导的胞外pH改变分析了DmGPCR活性的候选调节剂的作用。见例如Dunlop等，J.PharmacologicalandToxicologicalMethods，1998，40(1)，47-55。在一个实施例中，将被DmGPCR表达载体转染的CHO细胞以4×105细胞/胶束接种到含有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10U/ml青霉素和10μg/链霉素的MEM培养基中的12mm胶囊壳(MolecularDevicesCorp.)中。在该培养基中，在5％CO2下37℃培育24小时。用Cytosensor显微生理功能检测仪(MolecularDevicesCorp.)测定胞外酸化速率。将胶囊壳装在微生理检测仪的探测室内，该室以流速100μl/min灌注流动缓冲液(无碳酸氢盐的MEM，补充有4mML-谷氨酰胺、10U/ml青霉素、10μg/链霉素和26mMNaCl)。候选激动剂或其它试剂被流动缓冲液稀释，并灌注通过第二液体通道。在每60秒的泵送循环期间，泵运行38秒钟，其余22秒钟停止运行。在43-58秒的循环中记录探测室中运行缓冲液的pH。然后在60秒泵重新启动，开始下一轮循环。用Cytosoft程序计算在记录时间内流动缓冲液的酸化速率。从加入某调节剂候选物后获得的最高速率测量值减去基线值(为加入调节剂候选物之前的4个速度测定值的均值)计算酸化速率的改变。所选的仪器测到61mV/pH单位。作为该受体激动剂的调节剂导致胞外酸化速率比不存在激动剂时的速率提高。该反应被作为受体拮抗剂的调节剂封阻。实施例9使DmGPCR与肽配体相匹配细胞培养物和转染在含有5％CO2的空气的湿润气氛中，补充有10％热灭活FBS、10μg/ml庞大霉素、0.1M非必需氨基酸的完全DMEM培养基中37℃培养野生型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)(来自美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)或CHO-10001A细胞。用LipofectAMINEPLUSTM根据厂商说明书，用含有孤儿GPCRDNA的pCR3.1载体转染细胞。简单说，将CHO细胞铺在10cm灭菌的组织培养皿(CorningGlassWorks，Corning，NY)中，在转染当天，细胞达到50-60％汇合。在塑料试管中，在先稀释在0.75mlOptiMEM中的cDNA质粒(5微克/板)中加入PLUS(20微升/板)，混合并在室温下培养15分钟。另外，将LipofectAMINE(30微升/板)与0.75mlOptiMEM混合，加到预先混合的DNA/PLUS混合物中，在室温下培育15分钟。用无血清转染培养基(普通DMEM，5ml/板)替换细胞上的培养基，加入DNA-PLUS-LipofectAMINE复合物(1.5ml/板)，温和混合到培养基中，然后在37℃/5％CO2下培育3小时。然后在培养基中加入含有20％FBA(6.5ml/板)的完全DMEM培养基，继续在37℃/5％CO2下培育24-48小时。用绿色荧光蛋白的质粒(GFP，4微克/板)在CHO细胞中进行瞬间GFP表达，来评估在与GPCR所用的相同条件下转染的产率。膜制备用冰冷Dulbecoo磷酸缓冲盐(PBS)5ml/10cm板洗涤转染细胞一次，刮到5ml相同缓冲液中，合并多个平板的细胞悬液，4℃下500xg离心10分钟。在冰冷的TEE(25mMTRIS，5mMEGTA，5mMEDTA)中重建细胞沉淀。在液氮中快速冷冻合适的等份，储藏在-70℃。融化后，细胞匀浆，并在4℃，500xg下离心5分钟，沉淀核和未破碎的细胞。上清液在4℃以47,000xg离心30分钟。用TEE洗涤膜沉淀1次，重新悬浮在20mMHEPES，pH7.4，100mMNaCl，1mMEDTA(试验缓冲液)中，等份并在液氮中冷冻。膜等份储藏在-70℃。用来自Pierce(Rockford，Illinois)的BCA蛋白试验试剂和BSA作为标准品测定膜蛋白浓度。GTPγS结合试验融化细胞膜的等份，匀浆，并稀释入含有20mMHEPES，pH7.4，100mMNaCl，10mMMgCl2，1mMEDTA(试验缓冲液)的缓冲液中。最初，在96孔聚丙烯板(Nunc)中准备好反应混合物。在各孔中将肽的水溶液(20μl，10X)或水对照(20μl)、溶于试验缓冲液(0.11ml，10μM最终)的18.2μMGDP，与悬浮在试验缓冲液中的膜(50微升，10微克膜蛋白)混合，置于冰上。在摇动平台上，室温培育配体-GDP-膜混合物20分钟，然后置于冰上。对于每一个样品，加入20微升鸟嘌呤5′-O-(3[35S]硫)三磷酸([35S]GTPγS)(600-1200Ci/mmol；来自NewEnglandNuclear，Boston，MA)至约40,000cpm/0.2ml，或最终浓度为0.1nM。加有培育混合物(总共0.2ml/孔)的平板在室温下培育45分钟。然后将各O.175ml的反应混合物等份转移到用洗涤缓冲液预先处理(100微升/孔)的96孔FBMultiScreen过滤平板(Millipore)中，用MultiScreen真空管(Millipore)真空过滤。然后用0.25ml冰冷的洗涤缓冲液/孔(10mMHEPES，10mMMgCl2，pH7.4)洗涤膜三次，真空过滤。在最后一次洗涤后，加入SupermixOpti-phase闪烁液(25微升/孔，Wallac)，密封平板，在Trilux1450Microbeta计数器(Wallac)中计数1分钟/孔。作为阳性对照，用溶于0.025％抗坏血酸的1mM多巴胺(最终100μM多巴胺)或载体最终浓度(0.0025％抗坏血酸)处理稳定表达多巴胺2型(rD2)受体的CHO细胞膜。在100μM冷GTPγS存在下测定非特异性结合，从总数中扣除。一式三份进行各处理。数据分析[35S]GTPγS结合配体诱导的刺激表示为不加入配体的基础活性的倍数。各处理进行三次，或偶尔两次，结合(cpm)计算成平均值±标准偏差。用非线性最小二乘SAS模型，y＝BmaxX/(Kd+X)分析受体/配体系统的剂量依赖曲线。用Prism(GraphPadSoftware，Inc.SanDiego，CA)和下列等式y＝底部+(顶部-底部)/(1+10LogEC50-X)分析其它的剂量依赖性曲线。结果最初，我们选择了GTPγS试验作为功能性试验，因为激动剂驱动的GTPγS的激活反映了DmGPCR活化级联中的早期反应，而不论是否进一步激活各种下游信号传递反应的活化途径。这看来对于评估具有未知功能和未知信号传递途径的孤儿DmGPCR的激活特别有用。用96孔MultiScreenG/FB过滤板和MultiScreen真空管(Millipore)过滤，用编码果蝇GPCR的DNA瞬时转染的CHO细胞制备的膜进行GTPγS试验。由于已知GTPγS试验不能很好的识别与G蛋白的Gq家族偶联的GPCR，用基于FLIPR读数的Ca2+迁移试验评估被编码果蝇GPCR的DNA瞬时转染的CHO细胞中Gq-偶联的孤儿GPCR。使用GTPγS试验，发现了DmGPCR1(PnuFlyPep34651)被两种果蝇NPF-样肽AQRSPSLRLRF-NH2(SEQIDNO186)和PIRSPSLRLRF-NH2(SEQIDNO187)激活，如测出的约2.5nM的EC50值所反映的那样。用DPKQDFMRF-NH2(SEQIDNO26)和PDNFMRF-NH2(SEQIDNO27)激活导致GTPγS反应的EC50范围在370nM-500nM。如Nambu等(Neuron，1988，1，55-61)所报道的，这两条肽和9个其它FaRP是由同一前体基因编码的。虽然效果较差(EC50范围是5-10μM)，其它的FaRP和其它也刺激GTPγS结合的神经肽包括下列肽TDVDHVFLRF-NH2(SEQIDNO25)，TPAEDFMRF-NH2(SEQIDNO28)，SLKQDFMHF-NH2(SEQIDNO29)，SVKQDFMHF-NH2(SEQIDNO30)，AAMDRY-NH2(SEQIDNO31)，和SVQDNFMHF-NH2(SEQIDNO32)。另外，FLIPR试验鉴定出Colorado马铃薯瓢虫肽ARGPQLRLRF-NH2(SEQIDNO33)，与DmGPCR1受体相匹配，EC50为100-200nM。我们的数据表明，Dmgpcr1应该分类为短神经肽F受体，因为它能够被两条短NPF肽，SEQIDNO186和SEQIDNO187强烈激活。如GTPγS反应所示，DmGPCR4(PnuFlyPep67393)被果蝇咽侧体抑制素，果蝇抑制素-3(SRPYSFGL-NH2(SEQIDNO165))以低纳摩尔范围的EC50，以及各种蟑螂(Diploterapunctata)咽侧体抑制素，即GDGRLYAFGL-NH2(SEQIDNO34)，DRLYSFGL-NH2(SEQIDNO35)，APSGAQRLYGFGL-NH2(SEQIDNO36)，和GGSLYSFGL-NH2(SEQIDNO37)(EC50范围约20-280nM)激活。当以10μM用FLIPR测试时，同样的肽引起非常强的钙信号。近来，Lenz等(见上)克隆了DmGPCR4，并分类成第二类推定的咽侧体抑制素受体(DARII)。然而，迄今没有对受体激活有任何药物学数据的报道。就我们所知，这是各种咽侧体抑制素确实激活该受体最早的试验证据。如GTPγS反应所示，当在CHO-10001A细胞中瞬时表达时，DmGPCR5(GenBank登录号AX128628)能够被果蝇速激肽(DTK)，即DTK-1(APTSSFIGMR-NH2)(SEQIDNO169)，Met8-DTK-2(APLAFYGMR-NH2)(SEQIDNO170)，DTK-2(APLAFYGLR-NH2)(SEQIDNO171)，DTK-3(APTGFTGMR-NH2)(SEQIDNO172)，DTK-4(APVNSFVGMR-NH2)(SEQIDNO173)，和DTK-5(APNGFLGMR-NH2)(SEQIDNO174)激活。在剂量依赖试验中，DTK-1、Met8-DTK-2、DTK-3和DTK-4以250-500nM范围的EC50刺激GTPγS结合，最大的刺激约为基线水平以上的1.5倍。DTK-2和DTK-4由其低微摩尔范围内的EC50判断，较弱。在钙迁移试验(FLIPR)中，DmGPCR5显示对相同的DTK具有1-20nM范围内的EC50的Ca+2反应。另外，在cAMP(基于报道基因)的试验中测试DTK-5，DTK-2和Met8-DTK-2，以EC50分别为197nM、1.06μM和583nM的剂量依赖形式刺激cAMP释放。这些数据表明，DmGPCR5与Gs(cAMP)和Gq(Ca+2)-介导的信号传递途径偶联，它与脊椎动物速激肽受体报道的信号传递途径类似。DmGPCR6a(M811490)由Li等(J.Biol.Chem.，1992，267，9-12)报道为PYY受体。用GTPγS试验，在5μM浓度下测试了表7列出的肽，它们刺激GTPγS与编码DmGPCR6a的DNA转染的CHO细胞膜结合(基线以上1.7-4倍)。值得注意的是，除了激活该受体的一批昆虫和线虫肽外，还发现人NPFF(FLFQPQRF-NH2(SEQIDNO59))也是DmGPCR6的配体(5μMNPFF使GTPγS结合提高了4倍)。Dmgcr6aL和Dmgpcr6bL是DmGPCR6a(M811490)的两种剪接变体。后者Li等(J.Biol.Chem.，1992，267，9-12)报道为PYY受体。我们称DmGPCR6aL和DmGPCR6bL是RF-酰胺受体，因为它们仅识别在C末端具有Arg-Phe-NH2(Rfa)序列的肽。这些DmGPCR不“识别”的肽在C-末端与Rfa序列不同(例如SFa，QFa，YFa，RLa，DWa，RPa，HFa，LQa，SNa等)。在钙迁移试验(FLIPR)中，Dmgpcr6aL和Dmgpcr6bL显示对以10μM测试的FaRP库非常强的Ca+2反应。下文表7显示的序列代表了所有鉴定出的活性FaRP属于不同物种，包括果蝇、线虫、蛔虫(A.suum)、软体动物、P.redivivus(一种线虫)、吸虫、龙虾、人和水蛭。C-末端“RF酰胺规律”的唯一例外是肽pGluDRDYRPLQF-NH2(SEQIDNO120)，其C末端含Gln-Phe-NH2(QFa)序列。有趣的是，Dmgpcr6aL和Dmgpcr6bL都识别NPFF(FLFQPQRF-NH2(SEQIDNO152))，一种在C-末端具有RF酰胺序列的哺乳动物肽(注意上述结果中p-Glu或pQ代表焦谷氨酸)。如RLIPR分析所示，在CHO-10001A细胞中瞬时表达的DmGPCR7(GenBank登录号AX128636)被白细胞激肽(LK)和相关肽激活，即LK-I(DPAFNSWGa)(SEQIDNO175)，LK-V(GSGFSSWGa)(SEQIDNO176)，LK-VI(pGlu-SSFHSWGa)(SEQIDNO177)，LK-VIII(GSAFYSWGa)(SEQIDNO178)，库蚊激肽(NPFHSWGa)(SEQIDNO179)，软体动物淋巴细胞激肽样肽，即蜗牛激肽(PSFHSWSa)(SEQIDNO180)，和果蝇白细胞激肽样肽DLK-1(NSVVLGKKQRFHSWGa)(SEQIDNO181)，DLK-2(pGlu-RFHSWGa)(SEQIDNO182)和DLK-2A(QRFHSWGa)(SEQIDNO183)。DmGPCR7能被具有共同C-末端四肽序列HSWGa的LK肽激活。用该组肽处理(包括DLK-1，DLK-2，DLK-2a，LK-VI和库蚊激肽)，导致非常强的胞内钙释放(EC50为皮摩尔到纳摩尔以下)。相反，其它具有C-末端S/NSWGa(LK-1、LK-V)的蝗虫LK以及软体动物LK(SEQIDNO180)显示较低的能力(EC50为15-30nM)，具有YSWGaC-末端序列的LK-VIII在该系列中能力最弱(EC50为100-200nM范围)。在表明为Gq/11-偶联受体用DmGPCR7/CHO细胞制备的膜中不能检测出对这些肽的GTPγS反应。因此，DmGPCR7被鉴定为钙信号传递的白细胞激肽受体(更可能是Gq/11-偶联的)，与果蝇白细胞激肽作为同源配体匹配。如GTPγS反应所示，在CHO-10001A细胞中瞬时表达的DmGPCR(GenBank登录号AX128639)被天蛾(Manducasexta)咽侧体抑制素-C(AST-C或Manse-C)(SEQIDNO184)或果蝇抑制素-C(DST-C)，也被称为平台线肽(FLT)(SEQIDNO185)。在剂量反应GTPγS-结合试验中，检测到高效的AST-C和DST-C反应(EC50为低纳摩尔范围)。用百日咳毒素预处理细胞，完全消除了这些活性，指示受体激活与Gi/Go有关。在直接钙迁移试验(FLIPR)中，当用AST-C或DST-C攻击时，DmGPCR8不显示任何活性。然而，在用DmGPCR8和嵌合G-蛋白Gqi5或Gqo5共转染的CHO-10001A细胞中检测到对DST-C的强钙释放活性(EC50约30nM)。另一方面，与Gqz5偶联效果较差(EC50244nm)，在用DmGPCR8和Gqs5共转染的细胞中没有观察到钙迁移。这些结果表明，DmGPCR8是CHO细胞中的抑制受体，它优选与Gi/Go型G蛋白偶联。代表性的结果明白的将DmGPCR8鉴定为DST-C/FLT受体。基于其在钙迁移试验中信号非常强，DmGPCR9已与FDDY(SO3H)GHLRF-NH2(SEQIDNO157)匹配(EC50为低纳摩尔范围)。用编码DmGPCR9的DNA转染CHO细胞制备的膜检测不到对该肽的GTPγS反应，表明DmGPCR9最可能与Gq信号传递途径偶联。FDDY(SO3H)GHLRF-NH2(SEQIDNO157)代表天然果蝇磺胺激肽-1(DSK-1)，FDDY(SO3H)GHMRF-NH2(SEQIDNO159)的Met7→Leu7类似物。因此，我们认为DmGPCR9受体是磺胺激肽受体。由于FDDYGHLRF-NH2(SEQIDNO158)作为FDDY(SO3H)GHLRF-NH2(SEQIDNO157)的非磺胺对应物，在10μM下检测时显示非常弱的钙信号，而且其它117种测试的FARP和相关的肽在DmGPCR受体的FLIPR或GTPγS试验中均不显示任何活性，认为该匹配是非常特异性的。下文表7显示了配体与其相关受体的匹配。实施例10竞争性试验单-碘化肽的制备通过典型氯胺T方法碘化肽。在2ml玻璃小瓶中加入10微升的1mM肽水溶液、10微升0.1M(pH7.99)的磷酸钠缓冲液、1.0mCi[125I]碘化钠和5微升的2mg/ml氯胺T溶液(于磷酸缓冲液中)。混合物旋涡振动60秒，加入25微升5mg/ml的偏亚硫酸氢钠的磷酸盐缓冲液溶液。然后混合物进行HPLC，将其注射到VydacC18(0.45×15cm)柱上，进行梯度分离。所用的梯度是在时间为0时70％A和30％B，到25分钟时为20％A和80％B(A＝0.1M乙酸铵的水溶液，B＝0.1M乙酸铵的水溶液40％∶CH3CN60％，v/v)。流速为1.0ml/分钟。从t＝8到t＝20分钟，每隔30秒将样品收集入0.25ml捕获缓冲液(0.1M磷酸钠缓冲液，含有0.5％牛血清清蛋白、0.1％TritonX100和0.05％Tween20)。单碘化肽通常在t＝11分钟时被洗脱，产率约为0.75ml/100μCi。结合试验所用的96孔板是MilliporeMultiscreen过滤板(FB不透明1.0μM玻璃纤维B型，目录号MAFBNOB50)。联合使用MilliporeMultiscreen溶剂而授性管(目录号MAVMO960R)和96孔板，结束时过滤分析物。每孔一份，在100微升体积中含有5微克蛋白质(上述制备物)，各测试组包含两个等份。对于各测试化合物，一组仅用[125I]肽进行(用于总结合)，一组用1μM(或如指定)浓度的测试化合物和[125I]肽(用于非特异性结合)运行。每份加入试剂的顺序为试验缓冲液(20mMHEPES，10mMMgCl2，1％牛血清清蛋白，pH7.4)、测试化合物(制备在试验缓冲液中)，[125I]肽(在试验缓冲液中)和膜悬液(在试验缓冲液中)。加入膜悬液引发了结合反应，在室温(22℃)进行30分钟。30分钟培育后，将各板置于过滤管上，加真空，使液体通过滤膜(丢弃)，将蛋白质捕获在各孔中的滤膜上。对于洗涤，释放真空，在各孔中加入200μl试验缓冲液，然后再次加真空。洗涤再重复两次(总共对每个等份洗涤3次)。洗涤后，除去每个孔底下的塑料盖，将平板置于底部密封的Microbeta闪烁计数盒(目录号1450-105)中。在各孔中加入25微升闪烁液，将板放在旋转振摇器上80rpm1小时，然后静置过夜。次日，平板在Microbeta闪烁计数器上计数。从平均总结合中减去平均非特异性结合，得到标准(肽酰胺)和未知的特异性结合。本领域技术人员将会理解，可对上述本发明的具体实施方式进行许多改变和修改，而不违背本发明的精神。应理解所有变化都在本发明的范围内。所有本文引用的出版物的整个公开内容都在此引入以供参考。序列表<110>法赫马西亚及普强有限公司(PHARMACIA&UPJOHNCOMPANYLLC)<120>果蝇G蛋白偶联受体，核酸和相关方法<130>PHRM0002-103<150>US10/283,423<151>2002-10-30<150>US09/693,746<151>2000-10-20<150>US09/425,676<151>1999-10-22<160>187<170>PatentInversion3.2<210>1<211>1803<212>DNA<213>果蝇(D.melanogaster)<400>1atggccaacttaagctggctgagcaccatcaccaccacctcctcctccatcagcaccagc60cagctgccattggtcagcacaaccaactggagcctaacgtcgccgggaactactagcgct120atcttggcggatgtggctgcatcggatgaggataggagcggcgggatcattcacaaccag180ttcgtgcaaatcttcttctacgtcctgtacgccacggtctttgtcctgggtgtcttcgga240aatgtcctggtttgctacgtagttctgaggaatcgggccatgcagactgtgaccaatata300ttcatcacgaatctggccctgtcggacatattgctctgcgtcctggcggtgccatttact360ccgcttt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he1510<210>141<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>141AlaAlaMetAspArgTyr15<210>142<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>142SerProLysGlnAspPheMetArgPhe15<210>143<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>143ProAspAsnPheMetArgPhe15<210>144<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>144AspProLysGlnAspPheMetArgPhe15<210>145<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>145ThrProAlaGluAspPheMetArgPhe15<210>146<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>146SerAspAsnPheMetArgPhe15<210>147<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>147TyrLeuArgPhe1<210>148<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>148SerAspArgAsnPheLeuArgPhe15<210>149<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>149ThrAsnArgAsnPheLeuArgPhe15<210>150<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>150ProAspValAspHisValPheLeuArgPhe1510<210>151<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>151GlnAspValAspHisValPheLeuArgPhe1510<210>152<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>152PheLeuPheGlnProGlnArgPhe15<210>153<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>153AlaArgGlyProGlnLeuArgLeuArgPhe1510<210>154<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>154PheAspAspTyrGlyHisLeuArgPhe15<210>155<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>155PheAspAspTyrGlyHisLeuArgPhe15<210>156<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>156MetAspSerAsnPheIleArgPhe15<210>157<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>157PheAspAspTyrGlyHisLeuArgPhe15<210>158<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>158PheAspAspTyrGlyHisLeuArgPhe15<210>159<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>159PheAspAspTyrGlyHisMetArgPhe15<210>160<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>160GlyGlyAspAspGlnPheAspAspTyrGlyHisMetArgPhe1510<210>161<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>161SerArgProTyrSerPheGlyLeu15<210>162<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>162AspTyrGlyHisMetArgPhe15<210>163<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>163AlaProArgThrProGlyGlyArgArg15<210>164<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>164ValGluArgTyrAlaPheGlyLeu15<210>165<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>165LeuProValTyrAsnPheGlyLeu15<210>166<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>166ThrThrArgProGlnProPheAsnPheGlyLeu1510<210>167<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>167GluAspValAspHisValPheLeuArgPhe1510<210>168<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>168GlyAsnSerPheLeuArgPhe15<210>169<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>169AlaProThrSerSerPheIleGlyMetArg1510<210>170<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>170AlaProLeuAlaPheTyrGlyMetArg15<210>171<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>171AlaProLeuAlaPheTyrGlyLeuArg15<210>172<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>172AlaProThrGlyPheThrGlyMetArg15<210>173<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>173AlaProValAsnSerPheValGlyMetArg1510<210>174<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>174AlaProAsnGlyPheLeuGlyMetArg15<210>175<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>175AspProAlaPheAsnSerTrpGly15<210>176<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>176GlySerGlyPheSerSerTrpGly15<210>177<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<220><221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>1位的残基是pGlu.<400>177XaaSerSerPheHisSerTrpGly15<210>178<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>178GlyAlaSerPheTyrSerTrpGly15<210>179<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>179AsnProPheHisSerTrpGly15<210>180<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>180ProSerPheHisSerTrpSer15<210>181<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>181AsnSerValValLeuGlyLysLysGlnArgPheHisSerTrpGly151015<210>182<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<220><221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>Xaa是pGlu.<400>182XaaValArgPheArgGlnCysTyrPheAsnProIleSerCysPhe151015<210>183<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>183GlnArgPheHisSerTrpGly15<210>184<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<220><221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>Xaa是pGlu<221>DISULFID<222>(7)..(14)<400>184XaaValArgPheGlnCysTyrPheAsnProIleSerCysPhe1510<210>185<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<220><221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>Xaa是pGlu.<220><221>DISULFID<222>(7)..(14)<400>185XaaValArgTyrArgGlnCysTyrPheAsnProIleSerCysPhe151015<210>186<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>186AlaGlnArgSerProSerLeuArgLeuArgPhe1510<210>187<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>新序列<400>187ProIleArgSerProSerLeuArgLeuArgPhe1510权利要求1.一种鉴定DmGPCR1和DmGPCR1结合伴侣之间的结合和/或功能的调节剂的方法，其特征在于，包括步骤(a)使DmGPCR1结合伴侣与含有DmGPCR1的组合物在推测的调节剂化合物存在或不存在的情况下接触；(b)检测DmGPCR1结合伴侣和DmGPCR1之间的结合；和(c)确定在所述推测调节剂化合物的存在下，与所述推测的调节剂化合物不存在的情况下相比，结合或功能是增加还是减少，其中所述DmGPCR1结合伴侣的序列与选自SEQIDNO186和SEQIDNO187的序列具有至少70％序列相同性。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DmGPCR1结合伴侣的序列与选自SEQIDNO186和SEQIDNO187的序列具有至少80％序列相同性。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DmGPCR1结合伴侣的序列与选自SEQIDNO186和SEQIDNO187的序列具有至少95％序列相同性。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DmGPCR1结合伴侣具有选自SEQIDNO186和SEQIDNO187的序列。5.一种控制昆虫群体的方法，其特征在于，包括对昆虫施用DmGPCR1多核苷酸或多肽的结合伴侣或调节剂，以改变DmGPCR1的表达或活性，其中所述结合伴侣的序列与选自SEQIDNO186和SEQIDNO187的序列具有至少70％序列相同性。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述结合伴侣的序列与选自SEQIDNO186和SEQIDNO187的序列具有至少80％序列相同性。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述结合伴侣的序列与选自SEQIDNO186和SEQIDNO187的序列具有至少95％序列相同性。8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述结合伴侣具有选自SEQIDNO186和SEQIDNO187的序列。9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述昆虫选自苍蝇、果蝇、壁虱、跳蚤、虱子、扁虱和蟑螂。10.一种治疗或预防在个体中由于外寄生虫导致的疾病或病况的方法，其特征在于，包括对所述个体施用治疗有效量的DmGPCR1结合伴侣，其中所述DmGPCR1结合伴侣具有与选自SEQIDNO186和SEQIDNO187的序列具有至少70％的序列相同性。11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述DmGPCR1结合伴侣的序列与选自SEQIDNO186和SEQIDNO187的序列具有至少80％序列相同性。12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述DmGPCR1结合伴侣的序列与选自SEQIDNO186和SEQIDNO187的序列具有至少95％序列相同性。13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述DmGPCR1结合伴侣具有选自SEQIDNO186和SEQIDNO187的序列。14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述个体是人。15.16.一种使DmGPCR与DmGPCR结合伴侣结合的方法，其特征在于，包括步骤使含有DmGPCR的组合物与DmGPCR结合伴侣接触；和使所述DmGPCR结合伴侣与所述DmGPCR结合。16.17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述DmGPCR是DmGPCR5(SEQIDNO9)。17.18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述DmGPCR结合伴侣是果蝇速激肽(DTK)。18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述果蝇速激肽的序列与选自DTK-1(SEQIDNO169)，Met8-DTK-2(SEQIDNO170)，DTK-2(SEQIDNO171)，DTK-3(SEQIDNO172)，DTK-4(SEQIDNO173)，和DTK-5(SEQIDNO174)的序列具有至少80％序列相同性。19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述DmGPCR是DmGPCR7(SEQIDNO17)。20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述DmGPCR结合伴侣是白细胞激肽(LK)。21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述果蝇速激肽的序列与选自LK-I(SEQIDNO175)，LK-V(SEQIDNO176)，LK-VI(SEQIDNO177)，和LK-VIII(SEQIDNO178)，库蚊激肽(SEQIDNO179)，蜗牛激肽(SEQIDNO180)，DLK-1(SEQIDNO181)，DLK-2(SEQIDNO182)，DLK-2a(SEQIDNO183)具有至少80％序列相同性。22.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述DmGPCR是DmGPCR8(SEQIDNO19)。23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述DmGPCR结合伴侣是咽侧体抑制素。24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述咽侧体抑制素的序列与选自AST-C(SEQIDNO184或DST-CSEQIDNO185)具有至少80％的序列相同性。25.一种鉴定DmGPCR和DmGPCR结合伴侣之间的结合和/或功能的调节剂的方法，其特征在于，包括步骤使DmGPCR结合伴侣与含有DmGPCR的组合物在推测的调节剂化合物存在或不存在的情况下接触；检测DmGPCR结合伴侣和DmGPCR之间的结合；确定在所述推测调节剂化合物的存在下，与所述推测的调节剂化合物不存在的情况下相比，结合是增加还是减少，确定在所述推测调节剂化合物的存在下，与所述推测的调节剂化合物不存在的情况下相比，功能是增强还是减弱，其中所述DmGPCR是DmGPCR5(SEQIDNO9)。26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述DmGPCR结合伴侣是果蝇速激肽。27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述果蝇速激肽的序列与选自DTK-1(SEQIDNO169)，Met8-DTK-2(SEQIDNO170)，DTK-2(SEQIDNO171)，DTK-3(SEQIDNO172)，DTK-4(SEQIDNO173)，和DTK-5(SEQIDNO174)的序列具有至少80％序列相同性。28.一种鉴定DmGPCR和DmGPCR结合伴侣之间的结合和/或功能的调节剂的方法，其特征在于，包括步骤使DmGPCR结合伴侣与含有DmGPCR的组合物在推测的调节剂化合物存在或不存在的情况下接触；检测DmGPCR结合伴侣和DmGPCR之间的结合；和确定在所述推测调节剂化合物的存在下，与所述推测的调节剂化合物不存在的情况下相比，结合是增加还是减少，确定在所述推测调节剂化合物的存在下，与所述推测的调节剂化合物不存在的情况下相比，功能是增强还是减弱，其中所述DmGPCR是DmGPCR7(SEQIDNO17)。29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述DmGPCR结合伴侣是白细胞激肽。30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述白细胞速激肽的序列与选自LK-I(SEQIDNO175)，LK-V(SEQIDNO176)，LK-VI(SEQIDNO177)，和LK-VIII(SEQIDNO178)，库蚊激肽(SEQIDNO179)，蜗牛激肽(SEQIDNO180)，DLK-1(SEQIDNO181)，DLK-2(SEQIDNO182)，DLK-2a(SEQIDNO183)具有至少80％序列相同性。31.一种鉴定DmGPCR和DmGPCR结合伴侣之间的结合和/或功能的调节剂的方法，其特征在于，包括步骤使DmGPCR结合伴侣与含有DmGPCR的组合物在推测的调节剂化合物存在或不存在的情况下接触；检测DmGPCR结合伴侣和DmGPCR之间的结合；和确定在所述推测调节剂化合物的存在下，与所述推测的调节剂化合物不存在的情况下相比，结合是增加还是减少，确定在所述推测调节剂化合物的存在下，与所述推测的调节剂化合物不存在的情况下相比，功能是增强还是减弱，其中所述DmGPCR是DmGPCR8(SEQIDNO19)。32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述DmGPCR结合伴侣是咽侧体抑制素。33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述咽侧体抑制素的序列与选自AST-C(SEQIDNO184或DST-CSEQIDNO185)的序列具有至少80％序列相同性。34.一种控制昆虫群体的方法，其特征在于，包括对昆虫施用DmGPCR多核苷酸或多肽的结合伴侣或调节剂，以改变DmGPCR的表达或活性35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述昆虫选自苍蝇、果蝇、壁虱、跳蚤、虱子、扁虱和蟑螂。36.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述DmGPCR结合伴侣是果蝇速激肽。37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述果蝇速激肽的序列与选自DTK-1(SEQIDNO169)，Met8-DTK-2(SEQIDNO170)，DTK-2(SEQIDNO171)，DTK-3(SEQIDNO172)，DTK-4(SEQIDNO173)，和DTK-5(SEQIDNO174)的序列具有至少80％序列相同性。38.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述DmGPCR结合伴侣是白细胞激肽。39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述白细胞速激肽的序列与选自LK-I(SEQIDNO175)，LK-V(SEQIDNO176)，LK-VI(SEQIDNO177)，和LK-VIII(SEQIDNO178)，库蚊激肽(SEQIDNO179)，蜗牛激肽(SEQIDNO180)，DLK-1(SEQIDNO181)，DLK-2(SEQIDNO182)，DLK-2a(SEQIDNO183)具有至少80％序列相同性。40.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述DmGPCR结合伴侣是咽侧体抑制素。41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述咽侧体抑制素的序列与选自AST-C(SEQIDNO184或DST-CSEQIDNO185)具有80％序列相同性。42.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述DmGPCR调节剂是抗-DmGPCR抗体、DmGPCR反义多核苷酸、或小分子量非肽模拟物。43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述小分子量非肽模拟物是激动剂或拮抗剂。44.一种治疗或预防在个体中由于外寄生虫导致的疾病或病况的方法，其特征在于，包括对所述个体施用治疗有效量的DmGPCR结合伴侣。45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述个体是陪伴动物、牲畜、马或人。46.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述结合伴侣是果蝇速激肽、白细胞激肽、咽侧体抑制素或抗体。47.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述结合伴侣是抗体。48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述抗体是嵌合抗体、CDR-移植抗体、人抗体或人源化抗体。全文摘要本发明涉及果蝇GPCR(DmGPCR)多肽和鉴定并编码该DmGPCR的多核苷酸。另外，本发明还提供了制备它的表达载体、宿主细胞和方法。本发明还提供了鉴定其它物种中的同源物以及用作可能的杀虫剂的DmGPCR激动剂/拮抗剂的方法。本发明还提供了结合DmGPCR的方法，鉴定DmGPCR表达和活性的调节剂的方法，用DmGPCR抗体控制昆虫群体的方法，DmGPCR的反义多核苷酸，DmGPCR结合伴侣或调节剂，和预防或治疗与外寄生虫有关的疾病或情况的方法。特别是，本发明还公开了孤儿果蝇短神经肽F受体与其同源肽配体的匹配。文档编号G01N33/566GK1703625SQ03823725公开日2005年11月30日申请日期2003年8月6日优先权日2002年8月6日发明者D·E·劳沃里,V·G·史密斯,T·M·库比亚克,M·J·拉森申请人:法赫马西亚及普强有限公司

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