专利名称：用于软组织疾病诊断和作为口腔护理干预的治疗性靶标的蛋白质生物标记的制作方法
用于软组织疾病诊断和作为口腔护理干预的治疗性靶标的
蛋白质生物标记盤牙周病的部分特征是牙周有机基质的异�：凸冉到�。该基质包括牙龈、牙周韧带、牙骨质和牙槽骨。这些事件导致牙周炎的临床表现，包括牙龈退缩、袋形成(pocket formation)、附着丧失和最终牙丢失。许多不同炎性介导物都由牙周病累及的牙周组织产生。这些介导物中的某些看来似乎在牙周病病例中所观察到的破坏过程中起到重要作用，这使得一些研究人员检查使用某些炎性介导物作为进行性损伤的生物标记的可能性 (Sorsa, T.等.Arch. Oral. Biol. 35 :193S-196S, 1990 ；Page, R. C. ， J. Periodont. Res. 26 230-242，1991)。MM本发明包括在哺乳动物中诊断牙周病的方法，所述方法包括获取所述哺乳动物的牙龈和/或唾液样品，检测所述牙龈样品中生物标记的存在情况，检测所述样品中所述生物标记的水平，并根据所检测的生物标记水平来诊断出该生物体患有牙周病。生物标记是选自以下的至少一个成员FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS, IL-17B、CARD 10, BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO 和 MMP-13。本发明也包括在哺乳动物中诊断牙周病的方法，所述方法包括获取所述哺乳动物的牙龈和/或唾液样品，检测所述样品中生物标记的存在情况，检测所述样品中所述生物标记的水平，将所述样品中的生物标记水平与将生物标记水平与牙周病相关联的预定参考值进行比较，并且当所述样品中的生物标记水平符合其中所述参考值将生物标记水平与牙周病相关联的生物标记水平时，诊断出所述哺乳动物患有牙周病。本发明也包括在哺乳动物中诊断牙周病的方法，所述方法包括获取所述哺乳动物的牙龈和/或唾液样品，检测所述样品中生物标记的存在情况，检测所述样品中所述生物标记的水平，将所述样品中的生物标记水平与对照样品中同一生物标记的水平进行比较，其中当相对于所述对照样品而言，在所述样品中检测到所述生物标记的水平改变时，就诊断出所述哺乳动物患有牙周病。一方面，样品中的生物标记水平高于对照样品中的水平。本发明包括用于在哺乳动物中检测牙周病的生物标记组，其包含选自FAS、IL_1B、 IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD 10, BGN、BE、IL-12A、IL-6, LCN8、LPO 和 MMP-13 的两种以上生物标记，其中所述生物标记得自经诊断患有牙周病的哺乳动物的牙龈和/或唾液样品。本发明还包括在哺乳动物中监测牙周病的方法，所述方法包括在第一时间点获取所述哺乳动物的第一牙龈和/或唾液样品，在第二时间点获取所述哺乳动物的第二牙龈和/或唾液样品，在第一和第二样品中检测至少一种生物标记的存在情况，在第一和第二样品中检测至少一种生物标记的水平，并比较第一和第二样品中的生物标记水平，其中与第一样品相比，第二样品中生物标记水平下降表明在所述哺乳动物中牙周病减少。本发明包括在哺乳动物中治疗牙周病的方法，所述方法包括使细胞与减量调节选自以下的至少一种生物标记的物质接触FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、 CARD 10, BGN、BE、IL-12A、IL_6、LCN8、LPO和MMP-13，其中所述生物标记的减量调节与牙周病相关的至少一种症状的减少相关。本发明也包括可用于在哺乳动物中治疗牙周病的化合物的鉴定方法，所述方法包括使细胞与试验化合物接触并检测所述试验化合物是否减量调节选自以下的至少一种生物标记FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD 10, BGN、BE、IL-12A、IL-6、 LCN8、LPO和MMP-13，其中生物标记的减量调节表明所述试验化合物可用于治疗牙周病。本发明还包括在哺乳动物中诊断龈炎的方法，所述方法包括获取所述哺乳动物的牙龈和/或唾液样品，检测所述样品中生物标记的存在情况，检测所述样品中所述生物标记的水平，根据所检测的生物标记水平而诊断出所述生物体患有龈炎。本发明也包括在哺乳动物中诊断龈炎的方法，所述方法包括获取所述哺乳动物的牙龈和/或唾液样品，检测所述样品中生物标记的存在情况，检测所述样品中所述生物标记的水平，将所述样品中的生物标记水平与将生物标记水平与龈炎相关联的预定参考值进行比较，并且当所述样品中的生物标记水平符合其中所述参考值将生物标记水平与龈炎相关联的生物标记水平时，诊断出所述哺乳动物患有龈炎。本发明也包括在哺乳动物中诊断龈炎的方法，所述方法包括获取所述哺乳动物的牙龈和/或唾液样品，检测所述样品中生物标记的存在情况，检测所述样品中所述生物标记的水平，并将所述样品中的生物标记水平与对照样品中同一生物标记的水平进行比较，其中当相对于所述对照样品而言，在所述牙龈和/或唾液样品中检测到所述生物标记水平上升时，诊断出所述哺乳动物患有龈炎。本发明包括在哺乳动物中监测龈炎的方法，所述方法包括在第一时间点获取所述哺乳动物的第一牙龈和/或唾液样品，在第二时间点获取所述哺乳动物的第二牙龈和/ 或唾液样品，在第一和第二样品中检测至少一种生物标记的存在情况，在第一和第二样品中检测所述至少一种生物标记的水平，并比较第一和第二样品中的生物标记水平，其中与第一样品相比，第二样品中生物标记水平下降表明在所述哺乳动物中的龈炎减少。本发明也包括在哺乳动物中治疗龈炎的方法，所述方法包括使细胞与减量调节选自以下的至少一种生物标记的物质接触FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、 CARD 10, BGN、BE、IL-12A、IL-6, LCN8、LPO和MMP-13，其中所述至少一种生物标记的减量调节与龈炎相关的至少一种症状的减少相关。一方面，所述生物标记水平恢复到视为正常的水平。另一方面，所述生物标记水平恢复到基线水平。本发明还包括可用于在哺乳动物中治疗龈炎的化合物的鉴定方法，所述方法包括使细胞与试验化合物接触并检测所述试验化合物是否减量调节选自以下的至少一种生物标记FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、 LPO和MMP-13，其中所述至少一种生物标记的减量调节表明所述试验化合物可用于治疗龈炎。附图简述
图1表明2，4，4’ -三氯-2’ -羟基二苯醚对单核细胞的TNF α诱导性ΜΜΡ-9生成的影响。发明详述
本领域所需要的是生物标记水平的诊断性和/或预后测试，所述生物标记包括在牙周病状态中升高的生物标记。这样的生物标记包括FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、 IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO 和 MMP-13。本领域还需要的是牙周病的诊断性和/或预后测试，其评价牙龈样品例如龈沟液(gingival crevicular fluid, GCF) 或唾液样品中的炎性介导物水平。此外，也需要在有需要的患者中治疗牙周病，包括抑制 FAS、IL-IB、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO 和 MMP-13中的一种或多种水平上升。例如，基质金属蛋白酶13(MMP_13 ；也称为CLG3)在牙周炎和牙周病中是主要的破坏性胶原酶。MMP-13可在患病的牙周组织和龈沟液、以及唾液中发现。该酶水平与牙周炎临床指标呈正相关。也就是说，升高或“高于正常”水平的MMP-13指示牙周病。测定可由 MMP-13酶、RNA或生物活性构成。对MMP-13的活性和/或存在的抑制可用于治疗牙周病。使用相应的酶、蛋白质、RNA或生物活性，也可检测如本文给出的以下牙周病生物标记和/或测定其水平。升高或“高于正常”水平的以下生物标记单独或与一种或多种其它生物标记彼此联合，也指示牙周病。对于MMP-13，对MMP-13的活性和/或存在的抑制可用于治疗牙周病。FAS (也称为ALPSlA和AP0-1)参与细胞凋亡，并在结合配体时形成“DISC”，一种
诱导死亡的信号转导复合物。白介素l-β (IL-IB)是一种炎性细胞因子，参与对抗感染的哺乳动物免疫应答。白介素8(IL_8 ；也称为3-10C和AMCF-1)是C-X-C趋化因子家族的一个成员，并参与目标嗜中性粒细胞趋化性的诱导，作为先天免疫应答的组成部分。基质金属蛋白酶9(MMP_9 ；也称为GELB和CLG4B)是一种明胶酶，其也是牙周病中的一种主要的破坏性基质金属蛋白酶。防卫素β 4(DEFB4 ；也称为B2和DEFB-2)是一种防卫素。DEFB4是受炎症局部调节的一种抗菌肽。组织蛋白酶S(CTSS ；也称为MGC3886)，Cl肽酶家族的一个成员，是在将抗原蛋白 /肽呈递给MHC II类分子中起作用的一种半胱氨酸蛋白酶。白介素17B(IL-17B ；也称为IL-20)是一种IL-17相关的细胞因子。IL-17B刺激 IL-IB和TNF-α从单核细胞中释放出来。胱天蛋白酶(Casspase)募集域家族成员10 (CARD 10 ；也称为BIMPl和CARMA3)参与细胞凋亡信号转导。CARDlO也激活NF-K-B并且属于膜缔合的鸟苷酸激酶家族。双糖链蛋白聚糖(BGN ；也称为DSPGl和PG-S1)是含有两条连接的糖胺聚糖链的一种基质蛋白聚糖，并且涉及饰胶蛋白聚糖。据信它与胶原原纤维结合并转移生长因子β。B-因子，备解素(BF ；也称为CFAB和GBG)是补体激活旁路途径的一种组分。活性亚基是参与预活化B淋巴细胞增殖的一种丝氨酸蛋白酶。白介素12A(IL_12A ；也称为CLMF)是对T细胞和自然杀伤细胞起作用的一种细胞因子，并且参与Thl细胞和Th2细胞的分化，以及干扰素γ的T细胞非依赖性诱导。白介素6 (IL-6 ；也称为BSF2和HGF)是激活细胞表面信号传导复合物的一种免疫调节性细胞因子。它的作用是作为促炎细胞因子和抗炎细胞因子两者，并刺激针对创伤的免疫应答，包括响应外源病原体。
脂质运载蛋白8(LCN8)属于参与由哺乳动物免疫系统激活而导致的炎症和解毒过程的蛋白质家族。乳过氧化物酶(LP0 ；也称为SP0)是参与针对感染的宿主防御的一种抗氧化酶。如全文所用，范围用作描述该范围内的每个数值和所有数值的简写形式。范围内的任何数值都可选做该范围的终点。另外，本文所引用的所有参考资料都通过引用以其整体结合到本文中。当本公开内容中的定义和所引用参考资料有矛盾时，以本公开内容为准。本文所用的术语“牙周病”包括牙周炎、龈炎和牙龈疾病。本文所用“龈炎”意指牙龈组织的炎症，是其中炎症位于牙龈内且骨和牙周韧带内无损伤的一种病症。本文所用的术语“牙周炎”是指牙周有机基质的异�：凸冉到猓没拾ㄑ丽�、牙周韧带、牙骨质和牙槽骨。牙周炎的临床表现包括但不限于牙龈退缩、袋形成、基质附着丧失、牙和骨丢失。牙周炎可表征为早期牙周炎、中期牙周炎或晚期牙周炎。然而，正如技术人员所理解的，牙周炎不应仅限于本文所给出的那些症状和后遗症。除了其它症状，早期牙周炎的临床表现是以下的一种或多种探诊时出血；存在袋(3至4mm)；局限性退缩区域；附着丧失(3至4mm)；骨丢失(例如水平的)；和I级分叉侵袭面积。除了其它症状，中期牙周炎的临床表现是以下的一种或多种存在袋0至6!11111)；存在附着丧失0至6!11111)； 探诊时出血；I级和/或II级分叉侵袭面积；I级牙齿松动；骨丢失(例如水平和/或垂直的)；和1/3支持性牙槽骨丢失(即冠根比为1 1)。晚期牙周炎的临床表现是以下的一种或多种探诊时出血；存在袋(超过6mm)；附着丧失(超过6mm) ；II级和/或III级分叉侵袭面积；II级和/或III级牙齿松动；骨丢失(例如水平和/或垂直的)；和超过1/3 支持性牙槽骨丢失(即冠根比为2 1以上)。牙周炎细分为包括但不限于成人牙周炎 (例如斑块相关的)；早发性牙周炎(例如青春期前牙周炎、青少年牙周炎、快速进展性牙周炎等)；全身性疾病相关性牙周炎；坏死性溃疡性牙周炎；难治性牙周炎；种植体牙周炎 (peri-imp Iant it is)等。本文所用的术语“治疗，，是指在哺乳动物接触本发明口腔组合物和/或依据本发明方法时，不良病况的可检测性改善和/或病况症状的减轻。术语“对牙周炎的治疗”应理解为包括对哺乳动物牙周炎的预防，以及抑制哺乳动物中牙周炎相关的一种或多种已有病况的进展。本文所用的术语“抑制”是指与无治疗病况相比，部分抑制或完全抑制牙周炎，从而达到治疗性治疗和/或预防结果。因此，依照本发明对牙周炎的治疗包括降低、抑制、改善、减轻、缩减、停止或消除本文所给出的一种或多种症状和/或后遗症。本文所用的“病理性过度”是指活性超过所接受的正常水平。例如，基质金属蛋白酶活性的“病理性过度”是超过非疾病状态中正常存在的水平的基质金属蛋白酶活性水平。 本文所用的“基质金属蛋白酶活性的病理性过度”是牙周炎相关的基质金属蛋白酶活性水平。本文所用的术语“基线”是指在不良事件之前存在于受试者内的某物质(例如生物标记)的水平或在治疗性治疗之后存在的水平。生物标记的“基线”水平可以是例如据认为反映了 “正常”或“健康”受试者的生物标记水平。或者，生物标记的“基线”水平可反映出牙周病发作之前存在的生物标记水平，其中在牙周病发作之前，生物标记水平已经升高到超过“正常”或“健康”水平，由于可能与牙周病无关的病况。在第二个实例中，治疗受试者使生物标记水平恢复到“基线”水平，可反映出“对牙周病的治疗”，尽管有这样的事实 该实例中的基线水平升高到超过所接受的“健康”水平。本文所用的术语“减量调节”是指酶活性降低、酶活性水平降低、蛋白质水平和/ 或编码所述蛋白质的核酸的水平的降低、或蛋白质(例如MMP-8、MMP-9和MMP-13中的一种或多种)的存在的生化效应降低。本文所用的术语“牙龈样品”是指从牙龈上或附近所获取的组织、细胞、液体。本文所用的“龈沟液”和“GCF”是指由游离龈的毛细血管渗漏产生的在龈沟中汇集的血浆渗出液。本文所用的术语“诊断”是指确定或检测特定疾病、病症、医学病况或危险的存在情况。本文所用的术语“前龈炎状态”是指并非完全陷于龈炎的状态，但是除“正常”之外的趋向于龈炎的任何状态，而且是如放任不管则将会发展成龈炎的状态。本文所用的术语“检测试剂”是指生物实体或化学实体。“检测剂”可以是添加到组合物中的额外试剂，或者它可以是用作检测剂的组合物的起始组分(例如可视FRET抗体技术)。本发明的某些实施方案提供可用于治疗口腔疾病或病况的化合物的鉴定方法， 所述方法包括获取患有口腔疾病或病况的哺乳动物的第一牙龈样品；获取所述哺乳动物口腔的第二牙龈样品；使所述第一样品与试验化合物接触；使所述第二样品与阳性对照接触，其中所述阳性对照是已知减量调节一种或多种生物标记表达的化合物；检测所述试验化合物减量调节一种或多种所述生物标记表达的程度；检测所述阳性对照减量调节一种或多种所述生物标记表达的程度；和将所述试验化合物减量调节一种或多种所述生物标记表达的程度，与所述阳性对照减量调节一种或多种所述生物标记表达的程度进行比较；其中减量调节一种或多种所述生物标记表达的程度等于或大于所述阳性对照的试验化合物，是可用于治疗口腔疾病或病况的化合物。在某些实施方案中，所述一种或多种生物标记选自FAS、IL-1B、IL_8、MMP_9、 DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD 10、BGN、BE、IL-12A、IL_6、LCN8、LPO 和 MMP-13。在又一些实施方案中，所述阳性对照减量调节以下生物标记的表达FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、 IL-17B、CARD 10, BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO 和 MMP-13。在某些实施方案中，所述口腔疾病或病况是龈炎或牙周炎。在某些实施方案中，所述阳性对照是卤化二苯醚。在其它实施方案中，所述阳性对照是三氯生。再一些实施方案提供这样的方法其中所述试验化合物减量调节一种或多种所述生物标记表达的程度大于所述阳性对照。在某些实施方案中，所述试验化合物减量调节 FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD 10, BGN、BE、IL-12A、IL-6, LCN8、LPO 和MMP-13表达的程度大于所述阳性对照。在又一些实施方案中，所述阳性对照减量调节 MMP-9的表达。在再一些实施方案中，所述阳性对照减量调节MMP-13的表达。一方面，本发明的特征在于在哺乳动物中诊断牙周病的方法，所述方法包括获取所述哺乳动物的牙龈样品，检测所述牙龈样品中生物标记的存在情况，检测所述牙龈样品中所述生物标记的水平，根据所检测生物标记水平来诊断该生物体患有牙周病。所述生物标记是选自以下的至少一个成员FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD 10, BGN、BE、IL-12A、IL_6、LCN8、LPO和MMP-13。在一个实施方案中，哺乳动物是人。可通过本领域目前已知的或尚待发现的任何方法来获取牙龈样品。也就是说，本发明并不限于获取牙龈样品的方法。作为非限制性实例，可通过从口腔获取口腔组织样品而获取牙龈样品。通过常规牙科步骤就可获取牙龈样品，包括牙龈活检物。口腔组织包括但不限于从口腔中获取的成纤维细胞和上皮细胞，以及得自牙周组织(periodontum)和牙龈的组织样品和/或细胞样品。技术人员将会理解在牙龈样品中如何鉴定生物标记，包括与牙龈样品相关的和/ 或由牙龈样品所分泌的生物标记。检测生物标记存在情况的一种例示性方法包括获取试验受试者口腔的牙龈样品，并将所述样品与以下化合物或物质接触使得在生物样品中检测出生物标记核酸或由该核酸所编码的生物标记肽的存在情况，所述化合物或物质能够检测本文所述的一种或多种生物标记(例如MMP-9或MMP-13)，例如生物标记核酸(例如mRNA、基因组DNA等)或由生物标记核酸所编码的生物标记肽(例如肽片段或蛋白质等)。在一个实施方案中，用于检测生物标记mRNA或生物标记基因组DNA的物质是能够与生物标记mRNA 或基因组DNA杂交的标记的核酸探针。核酸探针可以是例如全长生物标记核酸或其部分。 本文描述了用于本发明诊断测定的其它合适的探针。在另一个实施方案中，用于检测生物标记肽的物质是能够与生物标记肽结合的抗体，例如带有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆或单克隆的。可使用完整抗体或其片段(例如Fab或F(ab' )2)。对于探针或抗体，术语“标记的”意在包括通过将可检测物与探针或抗体偶联(即物理连接)而直接标记该探针或抗体，以及通过与直接标记的另一试剂的反应而间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的第二抗体和用生物素末端标记的DNA探针来检测第一抗体，使其可用荧光标记的链霉抗生物素来检测。本文所用的术语“牙龈样品”(以及术语“生物样品”)旨在包括分离自受试者口腔的组织、细胞和生物液体，以及受试者口腔内存在的组织、细胞和液体。唾液样品可含有或不含与牙龈相同的某些或全部成分。也就是说，本发明的检测方法可用于在体外生物样品中以及体内检测生物标记mRNA、肽(例如蛋白质)或基因组DNA。作为非限制性实例，用于检测生物标记mRNA的体外技术包括RNA杂交和原位杂交。用于检测生物标记肽的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。用于检测生物标记基因组DNA的体外技术包括DNA杂交。用于检测生物标记肽的体内技术包括将标记的抗生物标记抗体引入受试者口腔。例如，抗体可用放射性生物标记来标记，所述生物标记的存在情况和在受试者体内的位置可通过标准成像技术来检测。使用本领域现已知的或尚待发现的任何方法可定量测定生物标记水平。也就是说，本发明并不限于定量测定生物标记的方法。定量测定生物标记的方法可包括本文在别处给出的用于检测生物标记的那些方法，或所述方法的合适的改良方法，正如技术人员将会理解的那样。在一个实施方案中，基于ELISA的测定用于定量测定生物标记(例如使用 PG&来定量测定IL-1B)。在另一个实施方案中，基于流式细胞术的方法用于定量测定生物标记(例如LUMINEX技术，包括基于流式细胞术和激光的检测)。一方面，当选自 FAS、IL-1B、IL-8, MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD 10, BGN、BE、
8IL-12A、IL-6、LCN8、LP0和MMP-13的生物标记升高到超过本领域认为“正常”的水平时，就诊断哺乳动物患有牙周病。理解的是，任何给定生物标记的“正常”水平可以是奇异值，或实际上可以是生物标记的浓度范围。生物标记的“正常”水平就是健康状态相关水平，或者是没有或基本没有牙周病的健康状态相关水平。这样的数值和范围可以是本领域已知的， 或者可由技术人员使用本领域已知方法而确定，包括但不限于对得自已知无牙周病或牙周病症状的哺乳动物受试者群体的牙龈样品进行生物标记检测测定。在另一个实施方案中， 对特定哺乳动物受试者而言，在所述哺乳动物受试者已知无牙周病或牙周病症状的时候， 可测定该特定哺乳动物受试者生物标记的“正常”水平/范围。生物标记的“正常”水平、数值或范围可用作哺乳动物没有或基本没有牙周病的预定参考值。另一方面，超过生物标记正常值或范围的数值可用作哺乳动物患有牙周病的预定参考值。在一个实施方案中，在哺乳动物中诊断牙周病的方法包括获取所述哺乳动物的牙龈和/或唾液样品，检测所述样品中生物标记的存在情况，检测所述样品中所述生物标记的水平，并将所述样品中的生物标记水平与将生物标记水平与牙周病相关联的预定参考值进行比较；并且当所述样品中的所述生物标记水平符合其中所述参考值将生物标记水平与牙周病相关联的生物标记水平时，诊断出所述哺乳动物患有牙周�。渲兴錾锉昙鞘茄∽砸韵碌闹辽僖桓龀稍盕AS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、 IL-12A、IL-6、LCN8、LPO和MMP-13。在一个实施方案中，所述牙周病是牙周炎。在另一个实施方案中，所述牙周病是龈炎。在另一个实施方案中，在哺乳动物中诊断牙周病的方法包括获取所述哺乳动物的牙龈和/或唾液样品，检测所述样品中生物标记的存在情况，检测所述样品中所述生物标记的水平，将所述牙龈和/或唾液样品中的生物标记水平与对照样品中同一生物标记的水平进行比较，其中当相对于所述对照样品而言，在所述牙龈和/或唾液样品中检测到所述生物标记的水平改变时，诊断出所述哺乳动物患有牙周�。渲兴錾锉昙鞘茄∽砸韵碌闹辽僖桓龀稍盕AS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、 IL-6、LCN8、LPO和MMP-13。一方面，牙龈和/或唾液样品中的生物标记水平高于对照样品中的水平。在一个实施方案中，所述牙周病是牙周炎。在另一个实施方案中，所述牙周病是告艮炎。本发明也提供用于在哺乳动物中检测牙周病的生物标记组，其包含选自FAS、 IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD 10, BGN、BE、IL-12A、IL-6, LCN8、LPO 和 MMP-13的两种以上生物标记，其中所述生物标记得自经诊断患有牙周病的哺乳动物的牙龈和/或唾液样品。在一个实施方案中，所述牙周病是牙周炎。在另一个实施方案中，所述牙周病是龈炎。本发明也包括在哺乳动物中监测牙周病的方法，所述方法包括在第一时间点获取所述哺乳动物的第一牙龈和/或唾液样品，在第二时间点获取所述哺乳动物的第二牙龈和/或唾液样品，在第一和第二样品中检测至少一种生物标记的存在情况，在第一和第二样品中检测所述至少一种生物标记的水平，并比较第一和第二样品中的生物标记水平， 其中与第一样品相比，第二样品中的生物标记水平下降表明在所述哺乳动物中牙周病减少，并且其中所述至少一种生物标记选自FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD 10, BGN, BE、IL-12A、IL_6、LCN8、LPO和MMP-13。在一个实施方案中，所述牙周病是牙周炎。在另一个实施方案中，所述牙周病是龈炎。—方面，本发明的特征在于在哺乳动物中治疗牙周病的方法，其中所述哺乳动物具有升高水平的选自以下的至少一种生物标记FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS, IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LP0 和 MMP-13。正如本文在别处所述，可使用本文所公开的或本领域已知的任何方法来检测一种或多种所述生物标记超出正常的水平， 并在恰当时使其与牙周病相关联。因此，本发明的特征在于在患有牙周病的哺乳动物中治疗牙周病的方法，所述方法包括使细胞与减量调节选自以下的至少一种生物标记的物质接触FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL_6、LCN8、 LPO和MMP-13，其中所述生物标记的减量调节与牙周病相关的至少一种症状的减轻相关。在一个实施方案中，生物标记减量调节物质包含在口腔组合物中，并将所述口腔组合物给予哺乳动物以治疗牙周病。在通过将口腔组合物给予至哺乳动物口腔而治疗牙周炎的方法中，可如本文别处所述地降低一种或多种生物标记的活性。可如本文别处所述地降低一种或多种生物标记， 例如，如针对降低哺乳动物口腔中MMP-9的量对降低哺乳动物口腔中MMP-9的量所提出的。 也就是说，可在核酸和蛋白质水平之一或两方面上降低MMP，从而降低口腔中MMP-9的活性。类似地，正如本文别处详细描述的，可通过对核酸和蛋白质水平任一种或两者的作用来实现MMP-9的减量调节或MMP-9水平下降。另一方面，本发明提供可用于在有需要的哺乳动物中治疗牙周病的化合物的鉴定方法，所述方法包括使细胞与试验化合物接触并测定所述试验化合物是否减量调节一种或多种以下生物标记FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD 10, BGN、BE、 IL-12A、IL-6、LCN8、LPO和MMP-13。至少一种生物标记的减量调节表明该试验化合物可用于在患有牙周病的哺乳动物中治疗牙周�。渲兴錾锉昙撬皆黾佑胙乐懿∠喙睾�/ 或是牙周病的症态。在一个实施方案中，所述牙周病是牙周炎。在另一个实施方案中，所述牙周病是龈炎。在一个实施方案中，治疗牙周病的方法包括给予经本文所述的筛选测定鉴定的物质，或者抑制牙周病的一种或多种生物标记的物质的组合，其中至少一种所述物质是经本文所述的筛选测定鉴定的物质。在一个实施方案中，本发明提供治疗牙周病的方法，所述方法包括将治疗有效量的抑制牙周病的物质给予需要所述治疗的受试者的步骤。如本文所定义，物质的治疗有效量(即有效剂量)范围为0. 001至30mg/kg体重，优选0. 01至25mg/kg体重，更优选0. 1 至20mg/kg体重，和甚至更优选1至10mg/kg、2至9mg/kg、3至8mg/kg、4至7mg/kg、或5至 6mg/kg体重。技术人员理解的是，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量，所述因素包括但不限于疾病或病症的严重程度、前期的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄以及所患有的其它疾病。此外，用治疗有效量的抑制剂对受试者进行治疗可包括单次治疗，或者优选可包括一系列治疗。也理解的是，用于治疗的有效剂量可随具体治疗过程而增加或降低。可因本文所述的诊断性测定结果而导致剂量的改变。作为实例，可将物质单独给予， 作为药物组合物的组成部分而给予，或作为口腔组合物等其它组合物的组成部分来给予。作为非限制性实例，可通过使细胞与TNF α接触而在体外确定ΜΜΡ_9水平。在一个实施方案中，细胞是单核细胞。在细胞与TNFa接触之后，在蛋白质水平或者核酸水平上测定MMP-9水平。一方面，也在抗菌剂存在的情况下，通过使细胞与TNF α接触而在体外确定ΜΜΡ-9水平。在一个实施方案中，所述抗菌剂是2，4，4’ -三氯-2’ -羟基二苯醚。在本发明的一方面，2，4，4’ -三氯_2’ -羟基二苯醚是可用于减量调节本文所提出的生物标记的物质。可用于测定生物标记水平的测定包括可用于结合和/或功能活性测定等的任何测定。这类测定的实例包括但不限于基于LUMINEX的测定、抗体-抗原测定、肽裂解测定、比色测定。在本发明的一个实施方案中，如下在体外确定经由检测ΜΜΡ-9水平对ΜΜΡ-9的减量调节的测定通过在抗菌剂存在的情况下，使细胞与TNFa接触，并与通过在抗菌剂(例如2，4，4’ -三氯-2’ -羟基二苯醚)不存在的情况下，细胞与TNF α接触而在体外确定的 ΜΜΡ-9水平进行比较，其中实验条件在其它方面都是相同的。与抗菌剂不存在时相比，在抗菌剂存在时，ΜΜΡ-9蛋白质、核酸或酶活性水平较低，表明该抗细菌化合物减量调节ΜΜΡ-9。 理解的是，可以类似方式测定本发明的其它生物标记。另外，可使用可用于该目的的任何物质来测定ΜΜΡ-9或任何其它生物标记的减量调节，所述物质包括但不限于本文在别处提出的经鉴定可用于治疗牙周炎的物质。理解的是，可将生物标记减量调节的体外测定与体内效应、观察或结果关联起来。 作为非限制性实例，理解的是，可将ΜΜΡ-9减量调节的体外测定与体内效应、观察或结果关联起来。一方面，体外所测的ΜΜΡ-9减量调节证实了体内观察，包括但不限于对牙周病的治疗，在体内降低生物标记和/或生物标记活性的病理性过度的方法，以及可用于治疗牙周病和/或在体内降低生物标记和/或生物标记活性的病理性过度的化合物的鉴定方法。参见例如Modeer等(1996) J. Clin. Periodont. ,23 :927_933。另一方面，体外所测的生物标记减量调节预测了体内结果，包括但不限于对牙周病的治疗，在体内降低生物标记和/或生物标记活性的病理性过度的方法，以及可用于治疗牙周病和/或在体内降低生物标记和 /或生物标记活性的病理性过度的化合物的鉴定方法。—方面，本发明提供在有需要的哺乳动物口腔中降低至少一种生物标记的病理性过度的方法，所述方法包括以这样的量将包含减量调节选自以下的至少一种生物标记的物质的口腔组合物给予所述哺乳动物口腔FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、 CARD 10, BGN、BE、IL-12A、IL_6、LCN8、LPO和MMP-13，所述量有效降低所述哺乳动物口腔中的所述生物标记水平，其中对所述生物标记水平的抑制导致对牙周病的治疗。在一个实施方案中，本发明提供在有需要的哺乳动物口腔中减少至少一种生物标记例如MMP-9或 MMP-13的病理性过度的方法，所述方法包括以以下量将包含2，4，4’ -三氯-2’ -羟基二苯醚的口腔组合物给予所述哺乳动物口腔，所述量有效降低所述哺乳动物口腔中的MMP-9或 MMP-13水平，其中对MMP-9或MMP-13水平的抑制导致对结缔组织基质蛋白组分过度降解的抑制。可按照本文所提出的多种方式之一来降低口腔中的生物标记。在一个实施方案中，正如本文在别处提出的，可通过在核酸水平减量调节生物标记而降低口腔中的所述生物标记。这样的降低可导致一种或多种编码生物标记的核酸Gf^nmRNA)及表达到口腔中的生物标记蛋白/酶的减少。正如技术人员所理解的，当备有本文所给出的公开内容时，可通过众多技术中的一种或多种实现例如减少编码生物标记的mRNA。实例包括降低编码生物标记的mRNA的转录和降解/消除编码生物标记的mRNA。在另一个实施方案中，可通过直接降低生物标记蛋白的量而降低口腔中的生物标记。正如技术人员所理解的，当备有本文所给出的公开内容时，可通过众多技术中的一种或多种可实现减少生物标记蛋白。实例包括通过小分子抑制剂的生物标记的结合/配合，通过天然或生物来源分子的抑制，生物标记的蛋白水解降解以及基于亲和力的生物标记从口腔中的清除等。减少生物标记的物质可以是本文所述的物质，例如2，4，4’ -三氯-2’ -羟基二苯醚(三氯生)，或它可以是另一种抗菌剂。因此，本发明提供治疗患有牙周病个体的方法。另一方面，本发明提供在有需要的哺乳动物中治疗牙周病的方法，所述方法包括使哺乳动物口腔中的细胞与减量调节本文所给出的生物标记的物质接触。依照本发明，生物标记的减量调节与牙周病相关的至少一种症状的减少相关。一方面，通过将2，4，4’ -三氯-2’ -羟基二苯醚对生物标记减量调节的效果与本文所给出的口腔组合物对生物标记减量调节的效果进行比较，确定该口腔组合物治疗牙周病的能力。另一方面，通过在体外或体内将任何口腔组合物的效果与本文所给出的口腔组合物的效果进行比较，确定该口腔组合物治疗牙周炎的能力。一方面，体外所测的生物标记(例如金属蛋白酶)减量调节证实了体内观察，包括但不限于对牙周炎的治疗，在体内降低生物标记(例如金属蛋白酶和/或金属蛋白酶活性) 的病理性过度的方法，以及可用于治疗牙周炎和/或在体内降低生物标记或生物标记活性的病理性过度的化合物的鉴定方法。参见例如Golub等，Inflamm. Res. (1997)46:310-9， Preshaw 等，J. Clin. Periodontol. (2004)31 :697-707 ；Mantyla 等，J. Periodontal. Res. (2003) 38 :436-439 ；Lorencini 等，Histol. Histopathol. (2009) 24 157-166 ；和 Pozo 等， J. Periodontal Res. (2005)40:199-207。本发明还包括用于本发明方法的口腔组合物，例如洁齿剂。一方面，口腔组合物包含可用于治疗牙周病的物质。在一个示例性的实施方案中，所述物质为非阳离子型抗菌剂。 参见例如美国专利号5，288, 480，其通过引用以其整体结合到本文中。非阳离子型抗菌剂在口腔组合物中存在的有效防牙斑量为0. 25-0. 35%重量，优选0. 3%。抗菌剂基本上是水不溶性的，意味着其在25°C时在水中的溶解度小于重量并且甚至可能小于0. 1%。在一个实施方案中，所述抗菌剂是2，4，4’ -三氯-2’ -羟基二苯醚。在一个实施方案中，所述抗菌剂是强力霉素。在另一个实施方案中，所述口腔组合物包含两种或更多种抗菌剂。在另一个实施方案中，所述口腔组合物包含并非抗菌剂的物质，并且可包含或不含作为抗菌剂的一种或多种额外物质。在一个实施方案中，抗细菌增强剂(AEA)增强了抗菌剂向口腔表面的递送和滞留。一方面，AEA包含粘合材料。参见美国专利号5，观8，480关于对可用于本发明AEA材料材料和组合物的描述以及关于可用于本发明的口腔组合物例如洁齿剂组合物的一般性描述。作为非限制性实例，组合物中的粘合材料是数均分子量介于100，000与2，500，000之间(包括端值)的聚合物。一方面，粘合材料选自以下聚合物聚乙烯膦酸、聚(ι-膦酰丙烯)磺酸、聚(β苯乙烯膦酸)、α苯乙烯膦酸、合成阴离子型聚合聚羧酸盐、马来酸酐、马来酸和甲基乙烯醚。另一方面，粘合分子是甲基乙烯醚和马来酸酐的聚合物。本文所用的“递送增强基团”是指这样的基团其将AEA (携带抗菌剂)附着于或者实质上粘附地、胶着地或以其它方式结合到口腔(例如牙齿和牙龈)表面，由此将抗菌剂 “递送”到这样的表面。在另一个实施方案中，“递送增强基团”是指这样的基团其任选将并非抗菌剂的物质附着或者实质上、粘附地、胶着地或以其它方式结合到口腔表面，由此将抗菌剂“递送”到这样的表面。在又一个实施方案中，“递送增强基团”将至少一种抗菌剂和至少一种非抗菌剂递送到牙齿。有机滞留增强基团(通常是疏水性的)将物质和/或抗菌剂附着或以其它方式结合到AEA上，从而促进抗菌剂滞留在AEA和间接滞留在口腔表面。在某些情况下，抗菌剂的附着通过其被AEA物理捕获而发生，尤其是当AEA是交联聚合物时， 其结构固有地提供了用于这类捕获的更多位点。在交联聚合物中的更高分子量、更高疏水性交联部分的存在也进一步促进将抗菌剂物理捕获到交联AEA聚合物上或促进交联AEA聚合物对抗菌剂的物理捕获。在示例性的洁齿剂中，含有口腔可接受的溶媒，包括具有保湿剂的水相。水的含量一般为至少3%重量，通常为3-35%，而保湿剂(优选甘油和/或山梨醇)一般总量占洁齿剂重量的6. 5-75 %或80 %，更一般为10-75 %。尽管并非本发明所必需，其中0-25-0. 35 % 水不溶性非阳离子型抗菌剂任选存在，可将有助于抗菌剂在唾液中溶解的额外成分掺入水湿润性溶媒中。这样的任选增溶剂包括湿润性多元醇，例如丙二醇、二丙二醇和己二醇；溶纤剂，例如甲基溶纤剂和乙基溶纤剂；在直链中含有至少12个碳的植物油和蜡，例如橄榄油、蓖麻油和凡士林；以及酯类，例如乙酸戊酯、乙酸乙酯和苯甲酸苄酯。本文所用的“丙二醇”包括1，2_丙二醇和1，3_丙二醇。应避免大量聚乙二醇，尤其是分子量在600以上的聚乙二醇，因为聚乙二醇有效抑制非阳离子型抗菌剂的抗菌活性。例如，当聚乙二醇(PEG)600 与三氯生的重量比为25份三氯生1份PEG 600时，聚乙二醇(PEG) 600降低三氯生的抗菌活性至主要不含聚乙二醇的三氯生抗菌活性的1/10-20。口腔组合物的pH范围通常为4. 5-10，而另一方面，6. 5-7. 5。值得注意的是，本发明组合物可在PH小于5时口腔施用，而基本不会使牙釉质脱钙或以其它方式遭到破坏。pH 可用酸(例如柠檬酸或苯甲酸)或碱(例如氢氧化钠)来控制或者缓冲(例如用柠檬酸钠、 苯甲酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等)。任何摩擦微粒都可使用并可选自碳酸氢钠、磷酸钙(例如磷酸钙二水合物)、硫酸钙、沉淀的碳酸钙、二氧化硅(例如水合二氧化硅)、氧化铁、氧化铝、珍珠岩、塑料颗粒例如聚乙烯、及其组合。具体地讲，摩擦剂可选自磷酸钙(例如磷酸氢钙二水合物)、硫酸钙、沉淀的碳酸钙、二氧化硅(例如水合二氧化硅)、焦磷酸钙和组合。任何类型的二氧化硅都可使用，例如沉淀的二氧化硅或硅胶。优选的是市售二氧化硅，例如INEOS AC43，可得自Ineos Silicas, Warrington, United Kingdom。其它摩擦剂也可依据本发明使用。正如美国专利号4，358，437所述，呈摩擦剂形式的碳酸钙的粉末形式构成这些摩擦剂中的重要一类。这些摩擦剂是实例的磨碎的石灰石或大理石、白垩例如文石、方解石或其混合物、以及合成的沉淀的白垩例如供水系统白垩(waterworks chalk)。通常，碳酸钙的重量中位粒径应小于 40微米，优选小于15微米。第二类摩擦剂是粉状二氧化硅，尤其是美国专利号3，538，230 中定义的二氧化硅干凝胶(silica xerogel)。硅基成分可包括平均粒度为1_100 μ m的二氧化硅颗粒，包括该范围内的任何具体粒度。在一个实施方案中，口腔组合物任选包含硅质抛光剂。抛光剂可以是硅质材料 (例如水合硅胶、二氧化硅干凝胶)或复杂无定形碱金属硅铝酸盐或硅锆酸盐或沉淀的二氧化硅。胶态二氧化硅材料包括以商标SYLOID出售的材料，例如以商标SYLOID 72和 SYLOID 74出售的材料。沉淀的二氧化硅包括以商标RODENT例如RODENT 113和RODENT 115和RODENT 119出售的那些。口腔组合物可以0-36%的量包含硅质抛光剂。在另一个实施方案中，口腔组合物可以0. 01-36%的量包含硅质抛光剂。在不受藉此达到本发明优势的理论所束缚的情况下，据信甚至在抗菌剂(例如2， 4，4’_三氯-2’-羟基二苯醚)的特定增溶材料不存在时，当物质的量为0. 25% -0. 35%重量且存在聚羧酸盐时，存在足够的物质以通过减量调节MMP-8、MMP_9或MMP-13中的至少一种实现对牙周炎的治疗。这同样适用于本文所述的其它水不溶性非阳离子型抗菌剂。口腔组合物(例如洁齿剂)也可含有以下量的氟化物离子源或提供氟的成分作为防龋剂，所述量足以提供25ppm至5，OOOppm氟化物离子。这些化合物可微溶于水或者可以完全溶于水。它们的特征在于其在水中释放氟化物离子的能力和基本上不与口腔制剂中的其它化合物发生不需要的反应。在这些材料中的是无机氟化物盐类，例如可溶性碱金属盐、碱土金属盐或者例如氟化钠、氟化钾、氟化铵、氟化钙、氟化铜例如氟化亚铜、氟化锌、氟化钡、氟硅酸钠、氟硅酸铵、氟锆酸钠、氟锆酸铵、单氟磷酸钠、单氟磷酸铝、二氟磷酸铝和氟化焦磷酸钠钙。碱金属和锡的氟化物，例如氟化钠、氟化亚锡、单氟磷酸钠(MFP)及其混合物是优选的。通常，就碱金属氟化物而言，该成分以至多2%重量(基于制剂重量)，优选 0. 的量存在。就单氟磷酸钠而言，该化合物可以0. 1-3%的量存在，而在一个实施方案中，以0. 7-0. 8%的量存在。一方面，组合物还包含选自以下的物质亚锡离子作用剂；含氟化合物；氟化钠； 氯己定；阿来西定；海克替啶；血根碱；苯扎氯铵；水杨苯胺；度米芬；氯化十六烷基吡啶锅t (CPC)；氯化十四烷基吡啶餘〗(TPC)；氯化N-十四烷基-4-乙基吡啶锅t (TDEPC)；奥替尼啶； 地莫匹醇；辛哌醇；乳链菌肽；锌离子作用剂；铜离子作用剂；精油；呋喃酮类；细菌素、月桂酰精氨酸乙酯、木兰提取物、金属离子源、精氨酸碳酸氢盐、和厚朴酚(honokiol)、厚朴酚 (magonol)、熊果酸、松萝酸、桑色素、沙棘提取物、过氧化物、酶、山茶提取物、黄酮类、黄烷、 卤化二苯醚、肌酸和蜂胶。
实施例以下实施例进一步描述了本发明。所述实施例仅仅是说明性的并且不得以任何方式限制所述的和要求保护的本发明范围。实施例1 :MMP-9的制备和表征U937 细胞和 RPMI 1640 培养基得自 ATCC。人 MMP-9ELISA Kit (QUANTIKINE)得自 R&D Systems。胎牛血清(FBS)得自VWR，青霉素-链霉素溶液和肿瘤坏死因子α (TNFa) 得自Sigma。将人白血病U937单核细胞淋巴瘤细胞培养在补充有10% FBS和青霉素-链霉素溶液的RPMI 1640培养基中。将细胞在37°C在加湿并含有5% C02和95%空气的气氛中孵育。处理之前，将细胞移至含FBS的RPMI中过夜。将细胞接种到48孔板中。细胞培养基包含TNFa O50ng/mL)、三氯生(Ippm)、或者同时包含这两种物质或两种物质都不含(对照)。处理之后，将细胞孵育M小时。收集条件培养基并贮存于-80°C直到进行分析。按照市售ELISA方案(图1)，对条件培养基样品进行针对MMP-9的酶联免疫吸附测定(ELISA)。用TNF α刺激的U937细胞产生增加水平的ΜΜΡ-9。Ippm的三氯生在TNF α刺激的U937细胞中显著降低ΜΜΡ-9水平。表1 图1的数据，表明三氯生对ΜΜΡ-9生成的影响。
权利要求
1.一种可用于治疗口腔疾病或病况的化合物的鉴定方法，所述方法包括获取患有口腔疾病或病况的哺乳动物的第一牙龈样品；获取所述哺乳动物口腔的第二牙龈样品；使所述第一样品与试验化合物接触；使所述第二样品与阳性对照接触，其中所述阳性对照是已知减量调节一种或多种生物标记表达的化合物；检测所述试验化合物减量调节一种或多种所述生物标记表达的程度；检测所述阳性对照减量调节一种或多种所述生物标记表达的程度；和将所述试验化合物减量调节一种或多种所述生物标记表达的程度，与所述阳性对照减量调节一种或多种所述生物标记表达的程度进行比较；其中减量调节一种或多种所述生物标记表达的程度等于或大于所述阳性对照的试验化合物，是可用于治疗口腔疾病或病况的化合物。
2.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标记选自FAS、IL-1B、IL_8、MMP-9、 DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD 10, BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO 和 MMP-13。
3.权利要求1或2的方法，其中所述阳性对照减量调节以下生物标记的表达FAS、 IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD 10, BGN、BE、IL-12A、IL-6, LCN8、LPO 和 MMP-13ο
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述口腔疾病或病况是龈炎或牙周炎。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述阳性对照是卤化二苯醚。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述阳性对照是三氯生。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述试验化合物减量调节一种或多种所述生物标记表达的程度大于所述阳性对照。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述试验化合物减量调节以下生物标记表达的程度大于所述阳性对照FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD 10, BGN、BE、 IL-12A、IL-6、LCN8、LPO 和 MMP-13
9.权利要求2的方法，其中所述阳性对照减量调节MMP-9的表达。
10.权利要求2的方法，其中所述阳性对照减量调节MMP-13的表达。
全文摘要
本文描述了可用于治疗口腔疾病或病况的化合物的鉴定方法。
文档编号G01N33/569GK102549432SQ201080015874
公开日2012年7月4日 申请日期2010年4月1日 优先权日2009年4月1日
发明者H·M·特里维迪, 徐韬, 杨英 申请人:高露洁-棕榄公司
专业数控铣床产品供应商
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