专利名称：一种基于量子点的免疫荧光检测恩诺沙星的方法及专用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于量子点的免疫荧光检测恩诺沙星的方法及专用试剂盒。
背景技术：
恩诺沙星(Enrof loxacin，ENR)，是喹诺酮类抗菌药，因其能抑制细菌DNA螺旋酶， 抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强，已成为兽医临诊和水产养殖中最重要的抗感染药物之一，被大量用于治疗、预防和促进生长。由于其耐药性和潜在的致癌性，欧盟、日本及我国均制定了在组织中的最高残留限量。目前，用于恩诺沙星残留物定量检测的金标准是色谱/质谱法，但其样品前处理过程繁琐费时，检测费用高。基于竞争性酶联免疫反应原理的 ELISA方法不需进行复杂的样品前处理过程，检测时间相对短，但其精度不够，只能用于定性筛查，无法用于定量确证。当前出口水产品等农产品中检测恩诺沙星残留及其污染状况调查的样品数量大，任务重，花费高，检测周期过长。因此，急需检测结果稳定、快速、经济的标准方法。量子点(Quantum Dots, QDs)标记材料是近年来发展起来的一类新型材料，包括 II-VI族和III-V族半导体纳米晶。由于量子点突出的发光和吸收特性，使其具有荧光寿命长、宽激发光谱、窄发射光谱、可精确调谐的发射波长、很高的光化学稳定性、可进行多色标记等优越特性，采用其作为标记材料，可实现对靶标分子的超微量检测。由于适用于免疫诊断试剂的量子点标记材料必须满足量子产率高、荧光强、生物相容性好、高度稳定及成本低等要求，而现行国外商业化的量子点其量子产率多在40%以下，其尺寸偏�。枰眉す夤庋б瞧骼凑丈浼しⅲ壳敖瞿苡τ迷谙赴庖哂饧觳夂土魇较赴觳夂头盅〉确矫妫虼斯适谐∩匣姑挥辛孔拥忝庖呒觳馐约廖适�。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测恩诺沙星的免疫荧光检测试剂盒。本发明所提供的用于检测恩诺沙星的免疫荧光检测试剂盒，包括恩诺沙星包被原和量子点标记的恩诺沙星抗体。上述试剂盒中，所述恩诺沙星抗体为抗体效价为IO6以上(具体为IO6)、抗体亲和常数为IO6 IO8M-1或IO7 IO8M-1或IO8M-1的恩诺沙星单克隆抗体；具体为抗体效价为106、 抗体亲和常数为IO8M-1的恩诺沙星单克隆抗体，所述恩诺沙星单克隆抗体购自北京圣迪隆生物科技有限公司，产品目录号为ENX-088。所述量子点为表面羧基含量为IX 10_3 9X 10-3mmol/mg或1 X 10_3 6X 10_3mmol/mg或5X 10_3mmol/mg的水溶性CcKe/ZnS核壳结构的量子点；所述量子点的量子产率为40 70%或50 70%或60% ；所述量子点的激发光波长为345nm，发射波长是 620nmo上述任一所述试剂盒中，所述量子点的粒径为10 20nm，所述粒径具体为13 20nm，所述粒径尤其优选为20nm ；其粒径的偏差(CV)在10 30%之间，具体为10 20% 之间，再具体为15% ；上述任一所述试剂盒中，所述量子点标记的恩诺沙星抗体中，所述量子点上的羧基与所述恩诺沙星抗体上的氨基形成肽键，进而使所述量子点与所述恩诺沙星抗体连接。上述任一所述试剂盒中，所述恩诺沙星包被原为恩诺沙星与载体蛋白的偶联物， 其中所述恩诺沙星与所述载体蛋白通过恩诺沙星中的羧基与载体蛋白中的氨基形成的肽键而连接；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、兔血清白蛋白、卵清蛋白、纤维蛋白原和兔和鸡的丙种球蛋白中的任一种。上述任一所述试剂盒中，所述试剂盒中还包括恩诺沙星标准品、稀释液、洗涤液、 含有孔的聚苯乙烯板、包被缓冲液和封闭液；所述恩诺沙星标准品为1-环丙基-7-(4-乙基-1-哌嗪基)-6-氟-1，4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸；所述稀释液为PBS缓冲液；具体为0. 02M、pH7. 4的PBS缓冲液。所述洗涤液为PBST缓冲液；具体按照如下方法制备取0. 2ml TWeen20及0. Ig的 Na 溶于所述稀释液中，溶解后用稀释液定容至1L。所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液；具体为0. 05M、pH9. 6的碳酸盐缓冲液。所述封闭液为含有用于包被的蛋白的PBS缓冲液；所述用于包被的蛋白为BSAjP 清蛋白和血蓝蛋白中的任一种。具体按照如下方法制备将IOg BSA和0. 2mlTween20溶于上述稀释液中，溶解后用稀释液定容至1L。上述任一所述试剂盒中，所述标准品为如下溶液形式的标准品用所述稀释液将所述1-环丙基-7- (4-乙基-1-哌嗪基)-6"氟-1，4- 二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸稀释成如下各个浓度的溶液0. 001,0. 005,0. 01,0. 05,0. 1,0. 5、1、5、10ug/L。上述任一所述试剂盒中，所述恩诺沙星包被原包被在所述含有孔的聚苯乙烯板上，包被方法为用所述包被缓冲液稀释所述恩诺沙星包被原得到10μ g/ml的包被液，每孔中加100 μ 1。上述任一所述试剂盒中，所述量子点标记的恩诺沙星抗体以如下溶液形式存在于试剂盒中将每25ug所述量子点标记的恩诺沙星抗体用5ml所述稀释液稀释得到的溶液。本发明的另一个目的是提供一种检测样品中恩诺沙星的方法。本发明所提供的检测样品中恩诺沙星的方法，包括如下步骤用上述任一所述的试剂盒对待测样品进行检测，所述待测样品为动物肌肉组织样本、动物尿样、饲料、蜂蜜或牛奶样本。所述待测样品具体为猪尿。本发明检测方法的原理采用量子点作为荧光信号标记分子，将恩诺沙星抗原直接包被在聚苯乙烯板的微孔中，加入恩诺沙星标准品或检测样品，以及量子点标记的恩诺沙星抗体，使其形成抗原-抗体二元发光免疫复合物，用荧光检测仪激发并检测该免疫荧光复合物的荧光强度，通过与测定形成的标准曲线对比获得待测恩诺沙星的浓度。抗原-抗体二元发光免疫复合物的形成是加入量子点标记的恩诺沙星抗体后，包被的恩诺沙星抗原与检测样品中的恩诺沙星竞争性地结合恩诺沙星抗体，通过抗原-抗体的特异性结合形成抗原-抗体二元免疫复合物。抗原-抗体二元发光免疫复合物的形成是同时加入量子点标记的恩诺沙星抗体及检测样品后，包被在聚苯乙烯微孔中的恩诺沙星抗原与检测样品中的恩诺沙星竞争性地与恩诺沙星抗体结合，其中与检测样品结合剩余的恩诺沙星抗体与包被在微孔板中的恩诺沙星抗原发生特异结合后形成固定在微孔板中的抗原-抗体二元免疫复合物。本发明的恩诺沙星免疫荧光检测试剂与量子点标记的免疫荧光检测技术相关，是采用量子点作为荧光信号标记材料，进行免疫荧光定量测定的一类方法，该技术整合了荧光量子点纳米材料化学合成、表面修饰及标记技术、间接竞争式免疫检测技术等相关领域的研究。本发明之所以能检测恩诺沙星，在于采用了一种基于量子点标记的免疫荧光定量测定的方法，即将恩诺沙星抗原直接包被在聚苯乙烯板的微孔中，基于量子点标记的间接竞争免疫荧光检测法的测定原理，在加入恩诺沙星标准品或检测样品，以及量子点标记的恩诺沙星抗体后，通过检测结合到聚苯乙烯板微孔中的抗原-抗体二元免疫复合物的荧光强度来实现对恩诺沙星的检测结合到聚苯乙烯板微孔的量子点标记抗体的数量不同，所产生的荧光强度也不同。在一定浓度范围内荧光强度值的高低与样品中的恩诺沙星的含量成反比。通过添加不同浓度的恩诺沙星标准品可制成标准曲线，根据此标准曲线查询各检测样品的荧光强度值可得到对应的恩诺沙星药物的浓度值。其具体的技术步骤包括(一 )荧光量子点标记探针的制备采用适合的水溶性荧光量子点，活化其表面的羧基后，采用化学偶联的方式将恩诺沙星抗体定向连接到量子点表面。(二)包被抗原采用与牛血清白蛋白偶联的恩诺沙星抗原作为包被抗原，通过物理吸附的方法将此抗原直接包被于聚苯乙烯板微孔中。(三)抗原-抗体荧光免疫复合物的形成于上述包被好的聚苯乙烯板微孔中加入恩诺沙星标准品或检测样品，以及量子点标记的恩诺沙星抗体，吸附在孔内的恩诺沙星抗原与标准或样品中的恩诺沙星竞争性的与恩诺沙星抗体相结合，通过抗原-抗体的特异性结合形成抗原-抗体二元发光免疫复合物。(四)定量荧光检测采用荧光酶标仪激发并检测上述所形成的抗原-抗体荧光免疫复合物的荧光强度；激发波长345nm ；发射波长620nm ；通过测定系列对应标准品的荧光强度形成标准曲线，通过与测定形成的标准曲线对比获得待测恩诺沙星的浓度。所述抗原-抗体二元发光免疫复合物的形成是加入量子点标记的恩诺沙星抗体后，包被的恩诺沙星抗原与标准或样品中的恩诺沙星竞争性地结合恩诺沙星抗体，通过抗原-抗体的特异性结合形成抗原-抗体二元免疫复合物，其上标记的量子点经激发后可发荧光，本发明使用的激发光波长是345nm，发射波长是620nm，得到发红光的抗原-抗体免疫复合物。所述荧光强度的检测是用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗原-抗体二元发光免疫复合物的荧光强度，由于所采用的抗体是固定浓度的，通常待测样品中的恩诺沙星药物的浓度越高，被抗体捕获的药物量越多，与包被的恩诺沙星抗原结合的抗体越少，测得的荧光强度值越低。由于量子点在与抗体进行偶联中要用超速离心进行分离纯化，粒径太小的量子点如Snm和IOnm的无法离心，偶联后无法纯化，使用效果较差；粒径太大的量子点如60nm以上的比较容易聚集，用在试剂盒上均一性较差。
所述量子点的粒径为10 20nm，所述粒径具体为13 20nm，所述粒径尤其优选为20nm ；其粒径的偏差(CV)在10 30%之间，较好为10 20%之间，优选15%。量子点的荧光量子产率及其荧光强度直接决定了检测灵敏度及其准确性的高低， 传统方法制备的量子点的荧光量子产率通常都低于40%，荧光强度较弱。为提高其灵敏度及准确性，所述量子点的量子产率为40 70%，所述量子点的荧光量子产率具体为50 70%，所述量子点的荧光量子产品尤其优选为60%。为用于恩诺沙星残留物检测，量子点表面需带有易于与恩诺沙星抗体偶联的基团，这些基团可以是羧基、氨基等基团，优化的基团是带羧基的表面官能团，通常采用化学方法连接抗体，即用EDC和NHS活化量子点后，再与抗体发生羧合反应而完成偶联反应。在将恩诺沙星抗体和量子点以肽键共价结合形成的聚合体前，还包括活化所述量子点表面官能团的步骤。量子点表面的羧基含量不同会影响到检测的灵敏度，为提高灵敏度，所述官能团具体为羧基，所述羧基的含量为ι χ IO-3 9 X 10-3mmol/mg,所述羧基的含量具体为1 X 10_3 6 X Krtimol/mg，所述羧基的含量尤其优选为5 X lO^mmol/mg.在免疫检测中，抗体的性能指标对于检测的准确性至关重要，通常而言，特异性强、亲和力高的抗体，可以显著地提高检测的准确性。研究发现，为提高灵敏度，所述恩诺沙星抗体亲和常数为IO6 IO8M4 ；所述恩诺沙星抗体亲和常数具体为IO7 IO8M4 ；所述恩诺沙星抗体亲和常数尤其优选为IO8MA由于恩诺沙星是小分子物质，其分子表面特性不利于与聚苯乙烯微孔板的直接结合，需要将其与载体蛋白进行偶联后才能借助于载体蛋白的表面特性而达成与聚苯乙烯微孔板的良好结合。可用作载体蛋白的有各种动物的血清白蛋白，如牛血清白蛋白 (Bovine Serum Albumin，BSA)、人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)，还有钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)、甲状腺球蛋白、兔血清白蛋白(RSA)、卵清蛋白 (Ovalbumin,0VA)、纤维蛋白原或兔和鸡的丙种球蛋白。研究发现，BSA理化性质稳定，赖氨酸含量高，自由氨基多，在不同的PH和离子强度下均有较大的溶解度，在含有有机溶剂(如吡啶、DMF等)的情况下均可和半抗原进行偶联，且在偶联后仍保持可溶状态，是作为载体蛋白的极佳选择，故本发明选用BSA作为偶联蛋白。本发明通过对荧光量子点、恩诺沙星抗原和恩诺沙星抗体分子特性的研究，通过对各种水溶性荧光量子点制备、包覆及表面修饰条件的优化，选择适合的水溶性荧光量子点与特异性的抗体进行定向共价化学偶联，获得功能性的荧光量子点标记探针，并通过优化竞争性免疫反应的各种条件，达到对恩诺沙星残留药物的快速和高灵敏定量测定。实验证明，本发明试剂盒的灵敏度高、特异性好、准确度高。本发明方法能实现对恩诺沙星残留药物的定量检测，并且检测限低、检测灵敏度高、特异性好，还适用于多种样品的检测。因此，本发明在恩诺沙星的检测领域具有广阔的应用前景。
图1水溶性Cdk/ZnS荧光量子点电镜(TEM)照片。图2用量子点标记的间接竞争免疫荧光法检测恩诺沙星的标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、检测试剂盒的组成及制备恩诺沙星购自北京恒元启天化工技术研究院，产品目录号为 30235CDCT-C13170000。其化学名称为1_环丙基_7_ 乙基-1-哌嗪基)-6-氟-1，4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸。恩诺沙星为喹诺酮类药物，分子本身带羧基，可直接与蛋白偶联。1、恩诺沙星包被原恩诺沙星与载体蛋白BSA的偶联物，恩诺沙星与BSA通过恩诺沙星中的羧基与BSA 中的氨基形成的肽键而连接。恩诺沙星包被原的制备方法如下1)取35. 9mg恩诺沙星、3ml N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)和3ml 二氧六环(二氧六环本身为溶液)混合得到混合液a，混合的温度为25°C，混合的时间为30min，混合的方式为
震荡；2) 6ml的步骤1)得到的混合液2 μ 1 (终浓度为0. Immol)三丁基正胺在4°C 下搅拌15min，得到混合液b，向混合液b中加入1. 5μ 1氯甲酸异丁酯(约0. lmmol)在25°C 下搅拌活化Ih ；得到活化好的恩诺沙星溶液；3) IOOmg BSA溶解于IOml 0. lmol/L, pH为8. 5的硼酸钠溶液中得到BSA硼酸溶
液，4°C下保存待用；4)将6ml活化好的恩诺沙星溶液在冰浴)下通过分液漏斗缓慢逐滴加入 IOmlBSA硼酸溶液中，搅拌反应12h，得到混合液c ；5)将所得混合液c于浓度为0. 02mol/L、pH为7. 4的PBS溶液中4°C透析48h，每 6h更换一次透析液，除去未反应的小分子。所得产品用冻干机冻干，于_20°C保存，得到恩诺沙星包被原(ENR-BSA)。2、恩诺沙星包被原的包被采用包被缓冲液将恩诺沙星包被原稀释为浓度10 μ g/ml的包被液，在96孔聚苯乙烯微孔板条中每孔各加100 μ 1，于4°C冰箱放置过夜。第二天弃去包被液、用洗涤液冲洗各板孔3次后，各孔加入200 μ 1封闭液，于37°C封闭处理池。之后弃去封闭液、用洗涤液冲洗各板孔3次后，进行真空抽干、用铝箔袋密封后放置于-20°C保存。3、量子点标记的恩诺沙星抗体恩诺沙星抗体为效价为106、亲和常数为IO8M4的恩诺沙星单克隆抗体，其购自北京圣迪隆生物科技有限公司，产品目录号为ENX-088。量子点购自深圳市泰勒斯科技有限公司，产品目录号为TLS LumiQD 20。该量子点的表征如下粒径为20nm、粒径的CV为15%，量子产率为60%，表面羧基含量为 5X 10-3mmol/mg，水溶性，CdSe/SiS核壳结构，激发光波长为345nm，发射波长是620nm ；红色荧光量子点。量子点的扫描图如图2所示。所述量子点标记的恩诺沙星抗体中，所述量子点上的羧基与所述恩诺沙星抗体上的氨基形成肽键，进而使所述量子点与所述恩诺沙星抗体连接。量子点标记方法是1)取2. 5mg的上述量子点用0. IM的MES缓冲液(称取1. 066g MES,0. 45g NaCl
7溶于50ml纯水，调pH至4. 7)洗涤并用20000rpm离心富集去上清后，用Iml浓度为0. 1M、 PH值为4. 7的MES缓冲液重悬，加入0. 96mg (终浓度为5mM)的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1. 15mg (终浓度为IOmM) N-羟基丁二酰亚胺(NHS)于其中。反应温度为37°C，反应半小时后，得到活化后的量子点；2)用50mM pH = 8. 5的硼砂缓冲液洗涤，取0. 15mg恩诺沙星单克隆抗体和2. 5mg 活化后量子点混合到0. 8ml 50mM pH = 8. 5的硼砂缓冲液(称取1. 9g Na2B4O7. IOH2O溶于 IOOml纯水，调pH至8. 5)中充分混勻。室温(25°C )下反应3. 5小时，让抗体和量子点形成稳定的肽键共价结合，得到含有偶联后量子点的反应液；3)反应结束后，向步骤2)得到的反应液中加入终浓度为5% (质量百分含量)的 BSA(Sigma-Aldrich,85041C)对剩余活性氨基位点进行封闭，反应在37°C下进行0. 5小时， 得到含有封闭后量子点的反应液；完成后，用pH = 7. 4的0. 02M PBS缓冲液(称取2. 3g Na2HP04、0. 524g NaH2PO4. H20,8. 77g NaCL 溶于 IL 纯水，调 pH 至 7. 4)洗涤，20000rpm 离心富集去上清，重悬后4°C保存待用，得到量子点标记恩诺沙星抗体。4、恩诺沙星标准品用稀释液将恩诺沙星稀释成如下各个浓度的溶液0. 001、 0. 005、0. 0U0. 05、0· 1、0. 5、l、5、10ug/L ；5、稀释液0. 02M、ρΗ7· 4 的 PBS 缓冲液；配制称取2. 3g Na2HPO4^O. 524g NaH2PO4. H2O 和 8. 77g NaCL 溶于 IL 纯水，调 pH 至 7. 4。6、洗涤液=PBST缓冲液；取0. 2ml Tween20及0. Ig的NaN3溶于上述PBS缓冲液中，溶解后用上述PBS缓冲液定容至1L。7、包被缓冲液0. 05M、pH9. 6的碳酸盐缓冲液。8、封闭液将IOg BSA和0. 2ml Tween20溶于上述PBS缓冲液中，溶解后用PBS缓冲液定容至1L。实施例2、标准曲线的制备方法在制备好的恩诺沙星微孔板条中加入浓度为0、0. 001,0. 005,0. 01,0. 05,0. 1、 0. 5、l、5、10ug/L的恩诺沙星标准溶液，50ul/孔，将量子点标记ENR抗体用PBS-T稀释液 1 50稀释[即25ug标记抗体5ml稀释液]，每个微孔中加入50ul，室温振荡1小时，洗涤液洗3次后用荧光酶标仪检测其荧光强度数值。荧光酶标仪设置为激发波长345nm，发射波长620nm。将竞争检测的检测限定为Β0/Β = 1. 2时(B0为0标准样检测值，B为待测样检测值)的竞争药物的质量浓度，根据曲线回归方程(图2)确定检测体系的灵敏度。检测结果如下表1所示，将检出限定为0. 001ug/L。表1恩诺沙星不同浓度样品的量子点试剂盒检测值
权利要求
1.一种用于检测恩诺沙星的免疫荧光检测试剂盒，包括恩诺沙星包被原和量子点标记的恩诺沙星抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述恩诺沙星抗体为抗体效价为IO6以上、抗体亲和常数为IO6 IO8M-1的恩诺沙星单克隆抗体；所述量子点为表面羧基含量为1 X 10_3 9X 10_3mmol/mg的水溶性Cdk/ZnS核壳结构的量子点；所述量子点的量子产率为40 70%。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述量子点的粒径为10 20nm，其粒径的偏差在10 30%之间；所述恩诺沙星包被原为恩诺沙星与载体蛋白的偶联物。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括恩诺沙星标准品、稀释液、洗涤液、含有孔的聚苯乙烯板、包被缓冲液和封闭液；所述恩诺沙星标准品为1-环丙基-7-(4-乙基-1-哌嗪基)-6-氟-1，4- 二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸；所述稀释液为PBS缓冲液；所述洗涤液为PBST缓冲液；所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液；所述封闭液为含有用于包被的蛋白的PBS缓冲液。
5.根据权利要求1-4中任一所述的试剂盒，其特征在于所述标准品为如下溶液形式的标准品用所述稀释液将所述1-环丙基-7-(4-乙基-1-哌嗪基)-6-氟-1，4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸稀释成如下各个浓度的溶液0. 001,0. 005,0. 01,0. 05,0. 1,0. 5、 l、5、10ug/L。
6.根据权利要求1-5中任一所述的试剂盒，其特征在于所述恩诺沙星包被原包被在所述含有孔的聚苯乙烯板上，包被方法为用所述包被缓冲液稀释所述恩诺沙星包被原得到 10 μ g/ml的包被液，每孔中加100 μ 1。
7.根据权利要求1-6中任一所述的试剂盒，其特征在于所述量子点标记的恩诺沙星抗体以如下溶液形式存在于试剂盒中将每25ug所述量子点标记的恩诺沙星抗体用5ml所述稀释液稀释得到的溶液。
8.一种检测样品中恩诺沙星的方法，包括如下步骤用权利要求1-7中任一所述的试剂盒对待测样品进行检测，所述待测样品为动物肌肉组织样本、动物尿样、饲料、蜂蜜或牛奶样本。
全文摘要
本发明公开了一种基于量子点的免疫荧光检测恩诺沙星的方法及专用试剂盒。本发明提供的用于检测恩诺沙星的免疫荧光检测试剂盒，包括恩诺沙星包被原和量子点标记的恩诺沙星抗体。本发明方法能实现对恩诺沙星残留药物的定量检测，并且检测限低、检测灵敏度高、特异性好，还适用于多种样品的检测。因此，本发明在恩诺沙星的检测领域具有广阔的应用前景。
文档编号G01N33/577GK102353785SQ201110187899
公开日2012年2月15日 申请日期2011年7月6日 优先权日2011年7月6日
发明者吴峰, 袁航, 马岚 申请人:清华大学深圳研究生院
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