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专利名称：一种毛细管电泳-化学发光法检测非衍生氨基酸的方法及其检测装置的制作方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，特别涉及一种毛细管电泳-化学发光法检测非衍生氨基酸的方法及其检测装置。
背景技术：
生物体内氨基酸的水平反映了生物体中的许多生命现象，并和许多疾病密切相关。因此，氨基酸的检测在临床诊断和临床基础研究中具有重要的意义。然而，由于这类化合物缺乏紫外吸收、荧光活性以及电化学活性，大多分析方法需要对这类化合物进行衍生，虽可以获得较好的灵敏度，但是操作繁琐，定量測定受衍生情况影响较大。化学发光(CL)法检测具有灵敏度高，结构简单，不需要任何外加光源等特点，近年来毛细管电泳检测受到 人们的关注。目前，有以下几种发光体系应用到氨基酸的检测中(I)过氧化草酸盐发光反应测定氨基酸荧光衍生物。这种方法虽可获得较高的灵敏度，但是仍需要衍生，且操作复杂，条件苛刻。(2)鲁米诺-次溴酸盐发光体系，在碱性条件下，氨基酸会抑制鲁米诺-次溴酸盐发光反应，以发光信号的衰减测定氨基酸的含量这种方法操作简便，但灵敏度受限。这种方法操作简便，但灵敏度受限。(3)鲁米诺-过氧化氢发光体系，氨基酸可与铜离子形成络合物，并催化化学发光活性。由于铜离子本身能有效催化发光反应，因此具有较高的发光背景，致使灵敏度不高。因此，发展ー种操作简便、灵敏度高的发光体系用于测定非衍生氨基酸将是十分必要的。

发明内容
本发明要解决的技术问题就是针对现有的毛细管电泳-化学发光法检测氨基酸的方法存在操作繁琐、灵敏度低的缺陷，提供ー种操作简单、灵敏度高的毛细管电泳-化学发光法检测非衍生氨基酸的方法，及其检测装置。本发明的技术方案如下ー种毛细管电泳-化学发光法检测非衍生氨基酸的方法，包括以下步骤(I)采用下述(i) (iii)中的任何ー种进行发光体系的混合(i)将纳米氧化铜和鲁米诺添加于毛细管电泳的流动相中，再将过氧化氢溶液在电泳毛细管柱的柱后通过化学发光检测池的T型通道进行添加；(ii)先将鲁米诺溶液添加于流动相中，然后将纳米氧化铜和过氧化氢溶液在电泳毛细管柱的柱后分别通过化学发光检测池的两个T型通道进行添加；(iii)分别将纳米氧化铜和鲁米诺-过氧化氢混合液在电泳毛细管柱的柱后的化学发光检测池的两个T型通道进行添加；(2)走基线，在化学发光检测池中测光信号，至系统稳定；然后(3)进氨基酸样品，进行毛细管电泳分离和光信号输出。其中为实现对非衍生氨基酸检测，该流动体系中的发光体系各物质浓度如下纳米氧化铜IXlO-4 lXl(T2mol/L，鲁米诺1Χ1(Γ5 lXl(T3mol/L，过氧化氢1Χ1(Γ3 lXlO^mol/L。最佳为纳米氧化铜I X lCT3mol/L,鲁米诺5X lCT4mol/L,以及过氧化氢I X lO—imol/L。其中，纳米氧化铜较佳的是采用低热固相配位化学反应热分解制备的纳米氧化铜，粒径< 10nm。本发明中，上述步骤(I)是本发明特别改良的，步骤(2)和(3)则是常规的毛细管电泳-化学发光法所用的方法。在纳米氧化铜粒子粒径均一，不影响实际样本的分离的情况下，以第(i)种发光体系混合方式为优。不然以第(ii)种发光体系混合方式为好。上述检测方法较佳的采用本发明提供的毛细管电泳-化学发光检测装置进行。该装置的结构如图I。其中，所用的部件都是常规部件，除了毛细管柱后化学发光检测池是本发明特别设计的。
因此本发明的技术方案还包括ー种毛细管电泳-化学发光法检测非衍生氨基酸的毛细管柱后化学发光检测池，包括两个T型发光试剂加样通道，两者距离为2 5cm，以2. 5cm为宜 ，第一 T型发光试剂加样通道,距分离毛细管柱后Icm ;第二 T型发光试剂加样通道与PMT检测窗ロ的距离大于O. 5cm，2cm左右为宜。PMT检测窗ロ O. 5 1cm，以Icm为宜。该两个T型发光试剂加样通道内径为50 320 μ m，以100 μ m为宜。该毛细管柱后化学发光检测池能够用于上述第(i)至(iii)种发光体系混合方式，尤其适合用于第(ii)种发光体系混合方式。本发明的技术方案还包括一种毛细管电泳-化学发光法检测非衍生氨基酸的装置，包括高压电源、电泳毛细管、毛细管柱后化学发光检测池、光电倍增管(PMT)，其中所述的毛细管柱后化学发光检测池即上文所述的本发明特别设计的毛细管柱后化学发光检测池。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。本发明中，当非衍生氨基酸与纳米氧化铜充分混合吋，由于纳米氧化铜比表面积大，氨基酸能有效吸附于纳米粒子表面，形成铜-氨基酸配合物，其能有效增强催化鲁米诺-过氧化氢发光的能力。而且由于纳米氧化铜比ニ价铜离子具有更低的发光背景，因而检测灵敏度更高。为此，本发明以纳米氧化铜催化鲁米诺-过氧化氢发光，构建检测非衍生氨基酸的毛细管电泳的发光检测系统。本发明首次将纳米氧化铜-鲁米诺-过氧化氢作为发光体系用于毛细管电泳-化学发光检测非衍生氨基酸。本发明的改良还在于化学发光体系的混合方式、组成配比及适合该检测体系的毛细管柱后化学发光检测池的设计。采用本发明所提供的检测方法，可以用于生物样品中氨基酸的检测。


以下结合

本发明的特征和有益效果。图I显示毛细管电泳-化学发光法检测非衍生氨基酸的毛细管柱后化学发光检测池的结构及其在毛细管电泳-化学发光检测装置中的位置和连接。图2是实施例2中5种非衍生氨基酸混合物溶液的毛细管电泳图(纳米氧化铜-鲁米诺-过氧化氢发光体系)。峰I 5分别为甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)和天冬酰胺(Asn)。
具体实施例方式以下通过具体实施例来进ー步说明本发明，但本发明并不受其限制。其中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I制备纳米氧化铜以I : I的摩尔比分别准确称量草酸和一水合醋酸铜，充分研磨I小吋，50°C水浴加热I小吋，固相产物在烘箱中70°C真空干燥4小时，得前驱物CuC204。前驱物置于马弗炉中加热升温至300°C，热分解2小吋，获得黑色的纳米氧化铜粉末。 实施例2毛细管电泳-化学发光分离检测甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)和天冬酰胺(Asn)五种氨基酸I、毛细管电泳-化学发光法检测装置參见图I.本实施例采用MPI-B型多參数化学发光分析测试系统(西安瑞迈电子科技有限公司)，但其中的检测池是采用本发明所设计的检测池，检测池内部结构及整个设备连接方式如图I所示。2、溶液配制(I)氨基酸待检样品将五种氨基酸(甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和天冬酰胺)混合溶于电泳运行缓冲液，形成样品溶液，其中各氨基酸的浓度都是2. OX 105mol/L。(2) ImM纳米氧化铜(pH 12):称取一定量的纳米氧化铜，加入电泳运行缓冲液超声混匀后，调整溶液的PH值至12。使用前用O. I μ m的滤膜过滤即可。(3)0. IM过氧化氢(pH 12):用电泳运行缓冲液稀释30%的过氧化氢至所需浓度，调节溶液的PH值至12。(4)电泳运行缓冲液30mmol/L硼砂-10mmol/L磷酸缓冲溶液,3%甲醇,0. 5mmol/L十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，O. 5mmol/L鲁米诺，pH9. 5。3、操作步骤分离的熔融石英毛细管(75μηι i. d. X40cm)使用前依次用O. Imol/LNaOH、超纯水和电泳运行缓冲液(电泳运行缓冲液见表I)各冲洗3分钟。2次运行之间依次用超纯水和缓冲液各冲洗3分钟。进样之前，ImM纳米氧化铜(pH 12)以I μ 1/min流速从化学发光检测池的第一 T型发光试剂加样通道进行添加，而氧化剂O. IM过氧化氢(pH 12)以I μ I/min的流速从第二 T型发光试剂加样通道进行添加。分离电压设置为_20kV进行电泳30分钟，待基线稳定后，进氨基酸样品，采用电迁移进样5kVX5s，即进样电压为5kV，进样时间为5秒钟。分离的温度为25°C，分离电压为-20kV。得到的电泳分离图见图2。实验中，以S/N = 3计算检测限，甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)和天冬酉先月安(Asn)五种氨基酸的检测限分别为3. OX 10_7mol/L, 5. I X l(T7mol/L, 5. 3 X l(T7mol/L,2. OX 10_7mol/L和2. 7X 10_7mol/L。这说明其检测灵敏度均高于ニ价铜离子催化时的检出限(10 6mol/L)。表I.实施例2所用的条件和參数
权利要求
1.ー种毛细管电泳-化学发光法检测非衍生氨基酸的方法，其特征在于，包括以下步骤 (I)采用下述(i) (iii)中的任何ー种进行发光体系的混合 (1)将纳米氧化铜和鲁米诺添加于毛细管电泳的流动相中，再将过氧化氢溶液在电泳毛细管柱的柱后通过化学发光检测池的T型通道进行添加； (ii)先将鲁米诺溶液添加于流动相中，然后将纳米氧化铜和过氧化氢溶液在电泳毛细管柱的柱后分别通过化学发光检测池的两个T型通道进行添加； (iii)分别将纳米氧化铜和鲁米诺-过氧化氢混合液在电泳毛细管柱的柱后的化学发光检测池的两个T型通道进行添加； (2)走基线，在化学发光检测池中测光信号，至系统稳定；然后 (3)进氨基酸样品，进行毛细管电泳分离和光信号输出。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，该流动体系中的发光体系各物质浓度如下纳米氧化铜I X 10_41 X 10_2mol/L，鲁米诺I X 10_5 I X 10^3mol/L,过氧化氢I X 10_3 I X 10 ijnol/L。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该流动体系中的发光体系各物质浓度如下纳米氧化铜I X l(T3mol/L,鲁米诺5 X l(T4mol/L,以及过氧化氢I X 10_1mol/Lo
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的纳米氧化铜是采用低热固相配位化学反应热分解制备的纳米氧化铜，粒径< 10nm。
5.一种毛细管电泳-化学发光法检测非衍生氨基酸的毛细管柱后化学发光检测池，其特征在干，包括两个T型发光试剂加样通道，两者距离为2 5cm，以2. 5cm为宜；第一 T型发光试剂加样通道，距分离毛细管柱后Icm ;第二 T型发光试剂加样通道与PMT检测窗ロ的距离大于0. 5cm, 2cm左右为宜。
6.如权利要求I所述的检测池，其特征在于，PMT检测窗ロ0. 5 1cm，以Icm为宜。
7.如权利要求I所述的检测池，其特征在干，该两个T型发光试剂加样通道内径为50 320 iim，以 IOOiim 为宜。
8.ー种毛细管电泳-化学发光法检测非衍生氨基酸的装置，包括高压电源、电泳毛细管、毛细管柱后化学发光检测池、光电倍增管，其特征在于，所述的毛细管柱后化学发光检测池为权利要求5 7任一项所述的毛细管柱后化学发光检测池。
全文摘要
本发明公开了一种毛细管电泳-化学发光法检测非衍生氨基酸的方法及其检测装置。该方法包括(1)采用下述(i)～(iii)中的任何一种进行发光体系的混合(i)将纳米氧化铜和鲁米诺添加于毛细管电泳的流动相中，再将过氧化氢溶液通过化学发光检测池的T型通道进行添加；(ii)先将鲁米诺溶液添加于流动相中，然后将纳米氧化铜和过氧化氢溶液分别通过化学发光检测池的两个T型通道进行添加；(iii)分别将纳米氧化铜和鲁米诺-过氧化氢混合液通过两个T型通道进行添加；(2)走基线，至系统稳定；然后(3)进氨基酸样品，进行毛细管电泳分离和光信号输出。本检测装置的特征在于检测池。本方法操作简单、灵敏度高，可以检测非衍生氨基酸。
文档编号G01N1/38GK102854182SQ20111017768
公开日2013年1月2日 申请日期2011年6月28日 优先权日2011年6月28日
发明者曹旭妮, 徐晓婧, 夏琨 申请人:华东理工大学