一种病理尸检过敏性休克的免疫组化simple同部位标记诊断方法及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种病理尸检过敏性休克的免疫组化SIMPLE 同部位标记诊断方法及其试剂盒。其试剂盒包括：肥大细胞（MC）第一抗体，该第一抗体为鼠抗人MC单克隆抗体；IgE第一抗体，该第一抗体为鼠抗人IgE单克隆抗体；通用型第二抗体试剂；抗原修复试剂；DAB显色液、AEC显色液及缓冲液系统等。该试剂盒具有价格低、特异性好、敏感性强、准确性高、稳定性好、简单通用的特性。主要应用于病理学与法医病理学的鉴定中，能精准地提供过敏性休克直观的病理学依据。
【专利说明】—种病理尸检过敏性休克的免疫组化SIMPLE同部位标记诊断方法及其试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于医药检测【技术领域】，涉及一种病理尸检过敏性休克的免疫组化SMPLE同部位标记诊断方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002]过敏性休克(anaphylaxis, anaphylactic shock)为I型变态反应,是外界某些抗原性物质进入已致敏的机体后，通过免疫机制在短时间内发生的一种强烈的多脏器累及症群。
[0003]MC以及MC活化后脱颗粒是过敏性休克发生发展的核心。MC被激活后其内部的富含类胰蛋白酶的颗�：妥榘房帕＞头湃胙褐校琈C中类胰蛋白酶的外溢情况已被作为衡量有无过敏性休克的重要指标之一。除了血清检测该酶的方法外，还可以针对患者体内病变组织进行免疫组织化学方法检测MC胞内以及胞外的类胰蛋白酶含量。再运用相关软件进行分析MC活化情况，并进一步诊断过敏性休克类型。
[0004]过敏性休克是临床上高发的急症之一，占每年法医纠纷的10 %左右，但由于疾病发病突然，尸检时只见猝死时组织脏器淤血水肿等非特异性表现，很难发现明确的形态学改变，法医学司法鉴定时还需结合死者过敏史、用药史，并排除其他种种死因才能诊断，这给过敏性休克的法医学诊断带来极大的不便，因此寻找简便易行的诊断指标成了亟待解决的问题。过敏性休克机制中MC、脱颗粒MC、IgE, EOS发挥了极大作用，但MC脱颗粒率至今还很少有报道，IgE和EOS也多限于动物模型的研究，并且在人体尚未出现它们的联合测定及相关意义的探讨。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于，提供一种病理尸检过敏性休克的免疫组化SMPLE同部位标记诊断方法及其试剂盒。通过免疫组化同部位标记技术以观察IgE与MC脱颗粒共定位，可作为过敏休克的病理诊断指标。
[0006]本发明一种病理尸检过敏性休克的免疫组化SMPLE同部位标记诊断方法，包括如下步骤:
步骤一:制作组织片；
步骤二:抗原修复——IgE:先将抗原修复试剂I放入高压锅，煮沸后将组织片放入，冒气后3min关火，从高压锅取出组织片及抗原修复试剂，自然冷却至室温；
步骤三:采用PBS缓冲液洗3次，每次5min ;滴加用PBS稀释过的IgE第一抗体在组织片上，将组织片放入湿盒，4°C过夜处理；分别用PBS洗3次，每次5min ；
步骤四:将所有组织片均加入通用型二抗试剂，并在37°C中孵育30min左右；用？85溶液洗净所有组织片3min，共计3次；
步骤五:采用AEC显色液显色(该过程将在光学显微镜下进行染色程度控制)，流水终止显色后继续冲洗1min ；
步骤六:苏木素复染lmin，流水冲2min，放入1%盐酸酒精分化液中分化6_8秒，流水冲5min ；
步骤七:将组织片浸入70%酒精、80%酒精、90%酒精、1000%酒精中均为5min ;再用二甲苯对组织片进行透明5min，共计3次；用中性树胶封片；
步骤八:用全自动的生物显微镜对所有组织片进行扫描拍照保存；
步骤九=SMPLE法组织片褪片-将所有组织片置入60°C以上的热水之中，用PBS液洗5min，共计3次，以洗去封片剂AEC ;随后将其放入含有浓度80%酒精的染缸中进行操作，并在摇床上进行I小时振摇，用PBS液洗5min，共计3次；之后将组织片置入Tris-HCl液中过夜，用PBS液洗5min，共计3次；
步骤十:再次抗原修复——MC:将抗原修复试剂2滴加到组织片上，将组织片放入湿盒，37 °C恒温孵育20min ；
步骤十一:采用PBS缓冲液洗3次，每次5min ;滴加稀释后的MC第一抗体组织片放入湿盒，4°C过夜处理；分别用PBS洗3次，每次5min ；
步骤十二:将所有组织片均加入通用型二抗试剂，并在37°C中孵育30min左右；用PBS溶液洗净所有组织片3min，共计3次；
用PBS液洗5min，共计3次；
步骤十三:配制DAB显色液，用DAB液进行显色(该过程将在光学显微镜下进行染色程度控制)，并在该过程中不断流水冲洗；
步骤十四:苏木素复染lmin，流水冲2min，放入1%盐酸酒精分化液中分化6_8秒，流水冲5min ;用饱和碳酸锂液进行10秒返蓝，随后用自来水进行3 min冲洗；
步骤十四:将组织片浸入70%酒精、80%酒精、90%酒精、1000%酒精中均为5min ;再用二甲苯对组织片进行透明5min，共计3次；用中性树胶封片；
步骤十五:之后用显微镜进行观察、拍照而且分析相关阳性产物。观察过敏组及对照组中MC及IgE表达的关系。
[0007]步骤十六:空白对照:滴入MC第一抗时用加PBS的组织片做对照，以确定首次滴入的一抗被洗脱完全。
[0008]其中，所述PBS缓冲液为0.01mol/L (ρΗ7.2-7.4)的PBS缓冲液；
所述第一抗体为:
1)MC第一抗体:鼠抗人MC单克隆抗体
2)IgE第一抗体:鼠抗人IgE单克隆抗体
所述MC第一抗体稀释液为PBS缓冲液中同时加入鼠抗人MC单克隆抗体，第一抗体和PBS缓冲液的比例为1:100 ；
所述IgE第一抗体稀释液为PBS缓冲液中同时加入鼠抗人IgE单克隆抗体，第一抗体和PBS缓冲液的比例为1:100 ；
所述抗原修复试剂I为朽1檬酸盐0.01Μ, Ph6.0 ；
所述抗原修复试剂2为0.125 %的胰蛋白酶消化液；
所述DAB显色液为比例为1:50-1:100配置新鲜DAB显色液；
所述AEC显色液为比例为1:50-1:100配置新鲜AEC显色液； 所述通用型二抗试剂为辣根过氧化物酶进行标记的二抗(即Ig-HRP)；
所述 Tris-HCl 液为 0.01mol/L(pHl.5)的 Tris-HCl 溶液。
[0009]上述所述一种病理尸检过敏性休克的免疫组化SMPLE同部位标记诊断方法，组织片的制作方法:
步骤一:先将石蜡标本连续组织片(每片基本为4-6Mm厚度)，用蒸馏水将所有组织片进行摊片，随后放在60°C烤箱内烤片2小时；浸入100% 二甲苯溶液30min，共3次；依次浸入梯度100%酒精溶液，95%酒精溶液，85%酒精溶液，75%酒精溶液，各5min ;蒸馏水洗3次，每次5min ；
步骤二:室温下浸入浓度3%的过氧化氢溶液1min (可略)；
步骤三:再将组织片放在PBS中洗净5min，共计3次，得到准备进行检测的组织片。
[0010]上述所述一种病理尸检过敏性休克的免疫组化SMPLE同部位标记诊断方法，包括以下步骤:
显微镜观察:
步骤一:MC阳性细胞判断，
MC阳性细胞核形态:呈圆形或椭圆形，形状规则，大小不等，
MC阳性细胞胞浆形态:胞浆表达明显的黄色或棕黄色阳性颗粒或弥漫状即为阳性细胞；
步骤二:脱颗粒肥大细胞的判定:细胞呈不规则形，可见周围黄色或棕黄色阳性颗粒脱出；
步骤三:IgE阳性判断，以胞浆或胞膜出现棕红色染色为阳性。
[0011]上述所述一种病理尸检过敏性休克的免疫组化SMPLE同部位标记诊断方法，包括以下步骤:
其图像分析与结果判定:
观察过敏组及对照组中MC及IgE表达的关系；对免疫组织化学染色后进行树胶封片处理的组织片进行观察，利用全能显微镜(Leica DMRXA2)和图像采集系统(Leica頂50)，随机选取不重复的10个高倍视野来进行实验结果图像采集；使用图像分析软件(Image-Pix)Plus 6.0)进行实验结果的图像分析:计录每张图片中脱颗粒MC数及MC总数，以10个视野MC计数的均值作为此图片的最后平均数作为统计量，并计算出每张图片10个视野的平均MC脱颗粒率(MC脱颗粒率=10个视野脱颗粒MC数/ 10个视野MC总数X 100 %)作为最后MC脱颗粒率的统计量；IgE计数每张图片10个视野的阳性细胞，以10个视野计数的均值作为此图片的最后的平均数作为统计量。
[0012]上述所述的方法，其特征在于，包括以下步骤:
判断免疫组化SMPLE同部位标记诊断方法所检测的MC脱颗粒与IgE表达情况，观察其MC脱颗粒率是否大于50%以及MC脱颗粒率与IgE表达是否呈正相关，尤其是有无共表达,如有,则表明是过敏性休克。
[0013]一种用于病理尸检过敏性休克的免疫组化SMPLE同部位标记诊断的试剂盒，其内容物包括:
抗原修复试剂(柠檬酸盐0.01M, PH6.0)；
MC第一抗体:鼠抗人MC单克隆抗体； IgE第一抗体:鼠抗人IgE单克隆抗体。
本发明的优点在于:
本发明的一种病理尸检过敏性休克的免疫组化SMPLE同部位标记诊断试剂盒具有价格低、特异性好、敏感性强、准确性高、稳定性好、简单通用的特性。
[0014]【专利附图】
【附图说明】:
图1为过敏性休克死者大体标本(a喉头明显水肿，声门关闭；b双肺水肿)；
图2为标本组织形态学观察；(a过敏组喉粘膜输送水肿HEX 200 ;b过敏组肺组织急性肺淤血水肿HE HEX 200 ；c过敏组肠组织平滑肌痉挛HEX 200)；
图3-1为过敏性休克死者肠组织连续组织片，同一区域MC及IgE的分布，其中，A:MC的分布(AEC显色法)；B =IgE阳性细胞的分布(DAB显色法)(X400)；
图3-2过敏性休克死者喉组织Simple同部位标记法染色，同一区域MC及IgE的分布，其中，A:MC的分布(AEC显色法)；B =IgE阳性细胞的分布(DAB显色法)。
【具体实施方式】
[0015]下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。
[0016]本实施例的具体实施过程:
1.怀疑过敏性休克死亡病例病理尸检以及取材规范与评定准则
(I)按规范尸检方法完整取出舌、喉头、气管与肺，尸检现场观察并拍照记录喉头有无明显水肿以及声门开放情况，肺有无膨隆并称重。固定后之肺大体标本置于切肺板上，将肺背侧紧贴板面，左手将肺固定于板上，用力均匀，尽可能使肺大面积贴在板面。沿肺长轴自外侧缘向肺门作一水平切面，观察有无水肿液溢出。
[0017](2)组织学取材:分别对喉头、气管、肺与肠进行取材，肺必须包括各个肺叶，每叶至少I块，每块厚3mm?4mm,面积2cmX 2cm左右,将肠标本置于站板上,沿肠管纵轴、横轴分别取材。取材的组织块要包括病变和可疑病变。取材组织块编号要与大体保持一致。组织学组织片采用常规石蜡组织片及苏木素伊红染色。
[0018](3)大体标本眼观病变摄像记录方法摄像器材:
翻拍架:四角对称，斜射45°对称灯台架；
相机及镜头:单反数码照相机配置AF35-70mmf/2.8自动变焦镜头；像素要求不低于M3216X2136。
[0019]光源:6400K日光色
操作方法:尸检现场拍摄固定后喉头、肺、肠大体标本情况。固定相机于摄像台升降杆上，调整相机高度，镜头到标本的一般距离为800mm，可根据标本大小构图要求适当加以调整。将肺标本表面粘液、水分充分吸干，放在阅片灯乳白玻璃上，对取材前切面拍照一次，取材标记后再拍照一次。
[0020]2.石蜡标本和组织片的制作
所有标本均用10%中性福尔马林溶液在常温下进行固定，一般时间为24?48小时，再按石蜡标本的制作标准进行取材。常规实验过程为:先进行标本脱水，再行透明，最后将标本浸蜡以及石蜡包埋。最后将制作符合标准的石蜡标本进行连续组织片，片子常规厚度为4?6 μ m，40°C蒸馏水对组织片进行摊片，随后用APES处理之后的载玻片来捞取符合标准的无刀痕以及褶皱的完整组织片。
[0021]3.HE 染色
组织片常规HE染色，确定过敏性休克及对照组喉、肺、肠组织的组织学类型及其过敏反应的病理学表现；
(1)先挑取符合标准的组织片，将它们放在60°C烤箱中进行I小时左右烤片；
(2)采用二甲苯溶液对标本进行脱蜡，时长为5min，共计3次；
(3)随后依次将组织片浸入100%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精中均为5min左右，取出用自来水冲洗(计时:3min)；
(4)浸入苏木素染液2min；
(5)将染色后的组织片放在自来水中冲洗(时长为5min)；
(6)用浓度为I%的盐酸酒精溶液(一般按70%浓度酒精液配制而成)分化时间为6-8秒左右，随后用自来水冲洗组织片标本3min ；
(7)用0.5%伊红染液对组织片标本进行5秒左右染色；
(8)随后采用70%酒精、80%酒精、90%酒精、100%酒精溶液对标本进行脱水，各时长为 2min ；
(9)再用二甲苯对组织片进行透明5min，共计3次；
(10)最后用中性树胶封片:先擦去标本组织片周围过剩的二甲苯液，不要让其干涸，随后迅速滴加中性树胶，再用盖玻片进行封固。
[0022]4.SIMPLE同部位标记法
采用SMPLE同部位标记检测过敏组及对照组喉、肠、肺组织中MC、脱颗粒MC、IgE的分布；
(O先将实验标本连续组织片(每片基本为4Mm厚度)，用蒸馏水将所有组织片进行摊片，随后放在60°C烤箱内烤片3小时；
(2)采用二甲苯溶液对标本进行脱蜡，时长为lOmin，共计3次；
(3)随后依次其组织片放入浸入100%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精中均为5min左右,取出用自来水冲洗(计时:3min);
(4)再将标本组织片放在蒸馏水中洗净5min，共计3次；
(5)室温下用浓度3%的过氧化氢溶液对标本进行孵育12min;
(6)再用蒸馏水洗净所有标本组织片3min，共计3次；
(7)抗原修复——IgE:先将抗原修复试剂I放入高压锅，煮沸后将组织片放入，冒气后3min关火，从高压锅取出组织片及抗原修复试剂，自然冷却至室温；
(8)采用PBS缓冲液洗3次，每次5min;滴加用PBS稀释过的IgE第一抗体在组织片上，将组织片放入湿盒，4°C过夜处理；分别用PBS洗3次，每次5min ；
(9)将所有组织片均加入通用型二抗试剂，并在37°C中孵育30min左右；用PBS溶液洗净所有组织片3min,共计3次；
(10)采用AEC显色液显色(该过程将在光学显微镜下进行染色程度控制)，流水终止显色后继续冲洗1min ；
(11)苏木素复染lmin，流水冲2min，放入1%盐酸酒精分化液中分化6_8秒，流水冲5min ；
(12)将组织片浸入70%酒精、80%酒精、90%酒精、1000%酒精中均为5min;再用二甲苯对组织片进行透明5min，共计3次；用中性树胶封片；
(13)用全自动的生物显微镜对所有组织片进行扫描拍照保存；
(14)SIMPLE法组织片褪片-将所有组织片置入60°C以上的热水之中，用PBS液洗5min，共计3次，以洗去封片剂AEC ;随后将其放入含有浓度80%酒精的染缸中进行操作，并在摇床上进行I小时振�。肞BS液洗5min，共计3次；之后将组织片置入Tris-HCl液中过夜，用PBS液洗5min，共计3次；
(15)再次抗原修复一MC:将抗原修复试剂2滴加到组织片上，将组织片放入湿盒，37 °C恒温孵育20min ；
(16)PBS洗5minX3次；滴加稀释后的MC第一抗体组织片放入湿盒，4°C过夜处理；分别用PBS洗3次，每次5min ；
(17)将所有组织片均加入通用型二抗试剂，并在37°C中孵育30min左右；用PBS溶液洗净所有组织片3min，共计3次；
用PBS液洗5min，共计3次；
(18)配制DAB显色液，用DAB液进行显色(该过程将在光学显微镜下进行染色程度控制)，并在该过程中不断流水冲洗；
(19)苏木素复染lmin，流水冲2min，放入1%盐酸酒精分化液中分化6_8秒，流水冲5min ;用饱和碳酸锂液进行10秒返蓝，随后用自来水进行3 min冲洗；
(20)将组织片浸入70%酒精、80%酒精、90%酒精、1000%酒精中均为5min;再用二甲苯对组织片进行透明5min，共计3次；用中性树胶封片；
(21)之后用显微镜进行观察、拍照而且分析相关阳性产物。观察过敏组及对照组中MC及IgE表达的关系。
[0023](22)空白对照:滴入MC第一抗时用加PBS的组织片做对照，以确定首次滴入的一抗被洗脱完全。
[0024]5.SIMPLE同部位标记法，观察过敏组及对照组中MC及IgE表达的关系；
(1)细胞阳性染色结果判定:将进行观察MC、IgE在过敏性猝死死者喉、肺、肠组织中的表达情况；
A.MC阳性细胞:呈圆形或椭圆形，形状规则，大小不等，胞浆表达明显的黄色或棕黄色阳性颗粒或弥漫状即为阳性细胞；脱颗粒肥大细胞的判定:细胞呈不规则形，可见周围黄色或棕黄色阳性颗粒脱出；
B.1gE阳性细胞:以胞浆或胞膜出现棕红色染色为阳性；
(2)细胞阳性标记指数的测定
对免疫组织化学染色后进行树胶封片处理的组织片进行观察，利用全能显微镜(LeicaDMRXA2)和图像采集系统(Leica頂50)，随机选取不重复的10个高倍视野来进行实验结果图像采集；使用图像分析软件(Image-Pro Plus 6.0)进行实验结果的图像分析:计录每张图片中脱颗粒MC数及MC总数，以10个视野MC计数的均值作为此图片的最后平均数作为统计量，并计算出每张图片10个视野的平均MC脱颗粒率(MC脱颗粒率=10个视野脱颗粒MC数/ 10个视野MC总数X 100 %)作为最后MC脱颗粒率的统计量；IgE计数每张图片10个视野的阳性细胞，以10个视野计数的均值作为此图片的最后的平均数作为统计量。
[0025]6.图像分析及免疫组化结果判定
应用Leica IM50图像采集系统和Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对染色结果进行分析；
7.统计学分析
应用SPSS13.0对统计结果进行分析,采用T检验、Spearman相关分析和regress1n线性回归。MC、MC脱颗粒率、IgE分布在不同组别之间的差异采用T检验；MC、MC脱颗粒率、IgE的相互关系及与死亡时间的探讨用Spearman相关分析；肠IgE及肺MC脱颗粒率被死亡时间影响用regress1n线性回归。显著性标准定位为:将结果为P< 0.05的视为差异有统计学意义，将结果P< 0.01视为差异具有高度统计学意义。
[0026]本试验共收集72例的喉、肺、小肠组织标本，所有标本均来自汕头大学司法鉴定中心，其中20例经临床及病理诊断死因为过敏性休克，另52例为对照组，经临床及病理资料证明无过敏性疾病。52例标本死因统计为6例中毒、3例脑溢血、4例新生儿难产窒息、5例呼吸道感染至器官衰竭、12例外伤、12例心脏疾病、2例中暑、3例血管栓塞、I例自杀窒息、I例电击死亡、I例败血症、2例产后大出血。
[0027]通过对72例的喉、肺、小肠组织标本进行MC、MC脱颗粒率、IgE相关分析，结果显示在喉组织中MC与IgE、MC脱颗粒率与IgE表达是呈正相关关系，肺组织中MC与IgE呈正相关，肠组织中MC脱颗粒率与IgE表达是呈正相关关系。同时观察到IgE定位于MC膜上或者MC胞浆、浆细胞胞浆中，由IgE定位的MC绝大多数处于脱颗粒状态。
[0028]本试验对过敏性休克死亡及电击死亡、心梗死亡的死者组织进行MC及IgE的Simple同部位标记对比观察，以直观清楚的确定组织中MC与IgE的关系。结果发现，在过敏性休克死亡组织中MC及其脱颗粒现象较多，IgE常定位于脱颗粒MC的胞膜及胞质中，在非过敏组中，IgE的表达几乎为阴性，同时MC个数较少且脱颗粒现象极少。
【权利要求】
1.一种病理尸检过敏性休克的免疫组化SMPLE同部位标记诊断方法，其特征在于: 步骤一:制作组织片； 步骤二:抗原修复——IgE:先将抗原修复试剂I放入高压锅，煮沸后将组织片放入，冒气后3min关火，从高压锅取出组织片及抗原修复试剂1，自然冷却至室温； 步骤三:采用PBS缓冲液洗3次，每次5min ;滴加IgE第一抗体稀释液在组织片上，放入湿盒中，过夜孵育； 步骤四:将所有组织片均加入通用型二抗试剂，37°C中孵育； 步骤五:采用AEC显色液显色(该过程将在光学显微镜下进行染色程度控制)； 步骤六:苏木素复染后脱水透明，用中性树胶封片； 步骤七:用全自动的生物显微镜对所有组织片进行扫描拍照保存； 步骤八=SMPLE法组织片褪片——将所有组织片置入60°C以上的热水之中，用PBS液洗5min，共计3次，以洗去封片剂AEC ;随后将其放入含有浓度80%酒精的染缸中进行操作，并在摇床上进行I小时振�。肞BS液洗5min，共计3次；之后将组织片置入Tris-HCl液中过夜，用PBS液洗5min，共计3次； 步骤九:再次抗原修复一MC:将抗原修复试剂2滴加到组织片上，将组织片放入湿盒，37 °C恒温孵育20min ； 步骤十:采用PBS缓冲液洗3次，每次5min ;滴加MC第一抗体稀释液在组织片上，放入湿盒，过夜孵育； 步骤十一:将所有组织片均加入通用型二抗试剂，并在37°C中孵育； 步骤十二:配制DAB显色液，用DAB液进行显色(该过程将在光学显微镜下进行染色程度控制)，并在该过程中不断流水冲洗； 步骤十三:苏木素复染后脱水透明，用中性树胶封片； 步骤十四:用显微镜进行观察、拍照而且分析相关阳性产物，观察过敏组及对照组中MC及IgE表达的关系； 步骤十五:空白对照:滴入MC第一抗时用加PBS的组织片做对照，以确定首次滴入的一抗被洗脱完全。
2.如权利要求1所述一种病理尸检过敏性休克的免疫组化SMPLE同部位标记诊断方法，其特征在于: 所述PBS缓冲液为0.01mol/L (ρΗ7.2-7.4)的PBS缓冲液； 所述第一抗体为: 1)MC第一抗体:鼠抗人MC单克隆抗体 2)IgE第一抗体:鼠抗人IgE单克隆抗体 所述MC第一抗体稀释液为PBS缓冲液中同时加入鼠抗人MC单克隆抗体，第一抗体和PBS缓冲液的比例为1:100 ； 所述IgE第一抗体稀释液为PBS缓冲液中同时加入鼠抗人IgE单克隆抗体，第一抗体和PBS缓冲液的比例为1:100 ； 所述抗原修复试剂I为朽1檬酸盐0.01Μ, Ph6.0 ； 所述抗原修复试剂2为0.125 %的胰蛋白酶消化液； 所述AEC显色液为比例为1:50-1:100配置新鲜AEC显色液； 所述DAB显色液为比例为1:50-1:100配置新鲜DAB显色液； 所述通用型二抗试剂为辣根过氧化物酶进行标记的二抗(即Ig-HRP)； 所述 Tris-HCl 液为 0.01mol/L(pHl.5)的 Tris-HCl 溶液。
3.如权利要求1所述一种病理尸检过敏性休克的免疫组化SMPLE同部位标记诊断方法，其特征在于，组织片的制作方法: 步骤一:先将石蜡标本连续组织片(每片基本为4-6Mm厚度)，用蒸馏水将所有组织片进行摊片，随后放在60°C烤箱内烤片2小时；浸入100% 二甲苯溶液30min，共3次；依次浸入梯度100%酒精溶液，95%酒精溶液，85%酒精溶液，75%酒精溶液，各5min ;蒸馏水洗3次，每次5min ； 步骤二:室温下浸入浓度3%的过氧化氢溶液1min (可略)； 步骤三:再将组织片放在PBS中洗净5min，共计3次，得到准备进行检测的组织片。
4.如权利要求1所述一种病理尸检过敏性休克的免疫组化SMPLE同部位标记诊断方法，其特征在于，包括以下步骤: 显微镜观察: 步骤一:MC阳性细胞判断， MC阳性细胞核形态:呈圆形或椭圆形，形状规则，大小不等， MC阳性细胞胞浆形态:胞浆表达明显的黄色或棕黄色阳性颗粒或弥漫状即为阳性细胞； 步骤二:脱颗粒肥大细胞的判定:细胞呈不规则形，可见周围黄色或棕黄色阳性颗粒脱出； 步骤三:IgE阳性判断，以胞浆或胞膜出现棕红色染色为阳性。
5.如权利要求1所述一种病理尸检过敏性休克的免疫组化SMPLE同部位标记诊断方法，其特征在于，包括以下步骤: 其图像分析与结果判定: 观察过敏组及对照组中MC及IgE表达的关系；对免疫组织化学染色后进行树胶封片处理的组织片进行观察，利用全能显微镜(Leica DMRXA2)和图像采集系统(Leica頂50)，随机选取不重复的10个高倍视野来进行实验结果图像采集；使用图像分析软件(Image-Pix)Plus 6.0)进行实验结果的图像分析:计录每张图片中脱颗粒MC数及MC总数，以10个视野MC计数的均值作为此图片的最后平均数作为统计量，并计算出每张图片10个视野的平均MC脱颗粒率(MC脱颗粒率=10个视野脱颗粒MC数/ 10个视野MC总数X 100 %)作为最后MC脱颗粒率的统计量；IgE计数每张图片10个视野的阳性细胞，以10个视野计数的均值作为此图片的最后的平均数作为统计量。
6.如权利要求5所述一种病理尸检过敏性休克的免疫组化SMPLE同部位标记诊断方法，其特征在于，包括以下步骤: 判断免疫组化SMPLE同部位标记诊断方法所检测的MC脱颗粒与IgE表达情况，观察其MC脱颗粒率是否大于50%以及MC脱颗粒率与IgE表达是否呈正相关，尤其是有无共表达,如有,则表明是过敏性休克。
7.一种病理尸检过敏性休克的免疫组化SMPLE同部位标记诊断试剂盒，其特征在于:内容物包括:抗原修复试剂I (柠檬酸盐0.0lM, PH6.0)；抗原修复试剂2 (0.125 %的胰蛋白酶消化液)MC第一抗体:鼠抗人MC单克隆抗体；IgE第一抗体:鼠抗人IgE单克隆抗体；通用型第二抗体试剂；DAB显色液；AEC显色液。
【文档编号】G01N1/28GK104502609SQ201410819203
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月25日 优先权日:2014年12月25日
【发明者】苏敏, 王晓艳, 田东萍, 苏雪, 刘茜 申请人:汕头大学医学院
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