专利名称：人类免疫缺陷病毒抗体确认试剂的制作方法
技术领域：
本实用新型是涉及生物应用技术领域，特别是涉及用于一种人类免疫缺陷病毒抗体确认试剂的体外诊断试剂。
背景技术：
自人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的艾滋病在20世纪80年代发现以来，已传遍全球。据联合国艾滋病总署(UNAIDS)报告，至2010年底，全球感染艾滋病人数达3700万。我国目前大约有HIV感染者70余万。迄今为止尚无有效的药物及疫苗来治疗和预防艾滋�。蚨鳫IV感染已成为当今全球威胁最为严重的传染病及公共卫生问题。正由于此，HIV感染的监测受到世界各国的高度重视，WHO、美国FDA及许多发达国家已于1985年相继制定了有关供血者、血液制品等筛选检查的法规，其中HIV抗体的检测被列为常规。我国在1987年就颁布了《艾滋病监测管理的若干规定》，在1990年和1994年又制定了有关献血员检查HIV抗体及加强供血员血样检验用体外免疫诊断试剂的质量控制，实行了批批检定的规定，确保HIV检测试剂盒有稳定的质量，从而有效的控制了 HIV感染的传播。由于HIV病毒的易变性，目前还没找到有效的疫苗，也没有有效药物进行有效治疗。当前控制HIV病毒传播的最有效手段就是尽早发现病毒携带者，尽早隔绝传染源。对HIV感染者的诊断主要以检测抗体为主。检测方法有凝聚法、间接免疫荧光法、ELISA、金标试剂、蛋白印迹法等。第一个获得美国FDA批准用于检测HIV抗体的试剂盒是美国Abbott (亚倍)公司的ELISA试剂盒，之后许多国家的ELISA试剂盒也相继投入市�。夜觳釮IV抗体的ELISA试剂盒是1989年问世的。间接免疫荧光法和凝聚法由于操作过程繁琐，受影响因素较多，已较少采用。胶体金法是近年来发展起来的常用的检测方法。目前应用最为普遍的是采用ELISA或胶体金人群进行初步筛�。缓蠖杂懈腥究梢傻难居玫鞍子〖�(Western Blot, WB)法进行确认，称为抗体确认试剂。目前WB法国内外只有少数几个公司生产，并且反应时间长，操作烦琐。
发明内容本发明目的是提供一种人类免疫缺陷病毒抗体确认试剂，具有操作简便、快速、适合现场检测和经济实用等优点。本发明提供一种人类免疫缺陷病毒抗体确认试剂，其特征在于，试剂包括HIV抗体试纸洗涤液、显色系统、阳性对照品、阴性对照品和免疫层析结果判读仪；所述HIV抗体试纸上包被了 10 条蛋白条带，分别是 HIVlgpl60、gpl20、P66、p51、gp41、p24、pl7、HIV2gp36和2条不同浓度的人IgG条带；胶体金标记的抗人IgG或SPA，或是生物素标记的抗人IgG或SPA、胶体金标记的亲和素显色系统。HIV抗体试纸结构为NC膜、NC膜下方紧密连接的吸样垫和装载NC膜及吸样垫的塑料外壳；NC膜从一端开始，依次包被的10条蛋白条带为高浓度人 IgG, HIVlgpl60、gpl20、P66、p51、gp41、p24、pl7、HIV2gp36 和低浓度人 IgG0 胶体金直径为20-100nm。[0007]其中，所述HIV抗体抗确认试剂的反应结果通过免疫层析结果判读仪是一种光学检测系统进行判定。所述人类免疫缺陷病毒抗体确认试剂，HIV抗体试纸制备方法如下:1、包被NC膜:将蛋白用0.0lM的磷酸盐缓冲液稀释成0.001_2mg/ml，优选为，高浓度人 IgG 为 0.05mg/ml,低浓度人 IgG 为 0.005mg/ml, gpl60 为 1.0mg/ml, gpl20 为 0.8mg/ml,p66 为 0.8mg/ml, p51 为 0.8mg/ml,gp41 为 0.8mg/ml, p24 为 0.5mg/ml,pl7 为 0.5mg/ml, gp36为0.6mg/ml ；NC膜选用0.45um孔径的膜，宽度为40mm,长度为300mm ;将稀释好的抗体装载在喷膜机上，按lul/cm划线，各线的间隔为2-4mm，优选为3mm ;划线完成后，将NC膜置于30%以下的湿度，干燥4小时以上。2、制备试纸:将NC膜横向切成3_8mm的宽度，优选为5臟，在NC膜下部垫上吸样垫，吸样垫为吸水材料，吸水能力不低于2ml，然后装入大小合适的塑料卡内，形成试纸。所述人类免疫缺陷病毒抗体确认试剂，显色系统的制备方法为:1、直接显色系统:(I)用还原法制备浓度为0.02%的20-100nm的胶体金，优选为40nm的胶体金；⑵用K2CO3将胶体金pH调节成8.0，按IOug抗人IgG或SPA每ml胶体金将蛋白加入，混匀30min，离心弃上清，将溶液用1/10体积的磷酸盐缓冲液溶解，加入微量防腐剂，即成为显色系统。2、生物素-亲和素显色系统:(I)用还原法制备浓度为0.02%的20_100nm的胶体金，优选为40nm的胶体金；(2)用无水DMSO配制10mg/ml生物素N-轻基琥拍酰亚胺酯溶液，用硼酸盐缓冲液(0.lmol/L, pH8.8)配制浓度为2mg/ml的抗人IgG或SPA溶液，按25ug/mg的比率将生物素酯加入抗体中，混合均匀并在室温下孵育4hr，将抗体溶液用PBS透析，以除去未结合的生物素，再稀释成合适的比例后，制成显色底物I ;⑶用K2CO3将胶体金pH调节成8.0,按IOug亲和素每ml胶体金将蛋白加入,混勻30min,离心弃上清,将溶液用1/10体积的磷酸盐缓冲液溶解，加入微量防腐剂，为显色底物2 ； (4)显色底物I和2构成显色系统。所述HIV抗体抗确认试剂，阳性对照品为人HIV抗体阳性血清，经处理后制成，其抗 HIV-1 的8 160、8 120、？66、？51、8 41、？24、？17，抗!11￥-2 的 gp36 均为阳性；阴性对照品为人HIV抗体阴性血清，经处理后制成，抗HIV-1和HIV-2各类抗原均为阴性。洗涤液为含0.5% Tween20的0.0lM的磷酸盐缓冲液。所述HIV抗体抗确认试剂，保存条件为2_8°C，避光保存，有效期12个月。所述人类免疫缺陷病毒抗体确认试剂，检测方法如下:1、将试剂和待检血清(浆)平衡到室温；2-8°C保存的试剂需20_30min平衡至室温;2、将HIV抗体试纸取出，平放，向试纸的NC膜上滴加100_150ul的待检血清(浆)样本，样本将缓慢渗入NC膜，最后进入吸样垫，此过程约2-3min ；3、向NC膜上滴加100-150ul洗涤液，等洗涤液渗入进膜后，再滴加100_150ul洗涤液，重复洗涤2次，此过程约5-8min ；
4、若采用直接显色系统，向NC膜上滴加100_150ul抗人IgG或SPA标记胶体金，胶体金将将缓慢渗入NC膜，最后进入吸样垫，此过程约2-3min ;若采用生物素-亲和素显色系统，向NC膜上滴加100-150ul生物素标记抗人IgG或SPA,待生物素标记抗体缓慢渗入NC膜后，再滴加100-150ul洗涤液，参照步骤3，洗涤3次，此过程约5-8min，再加入100_150ul胶体金标记的亲和素，胶体金将缓慢渗入NC膜，最后进入吸样垫，此过程约2-3min ；5、向NC膜上滴加100-150ul洗涤液，等洗涤液渗入进膜后，再滴加100_150ul洗涤液，重复洗涤I次,此过程约4-6min ；6、此时NC膜上将出现胶体金显色的红色条带，用专用的检测仪器或肉眼判定检测结果。进行上述检测时需同时平行做阳性和阴性对照，即用阳性对照品和阴性对照品同时做一次检测。所述HIV抗体抗确认试剂，结果判定方法如下:1、条带阴、阳性的判定方法:免疫层析结果判读记录仪判定方法:将反应后的HIV抗体试纸放入仪器内，启动设定程序，仪器将自动显示出各条带的检测结果，给出定量的值，检测出有效值(检测值不低于低浓度IgG条带值)为阳性，反之为阴性。检测结果也可以用肉眼判读法:直接观察指定区域内是否有显色条带出现，有条带出现且强度不低于低浓度IgG强度为阳性，反之为阴性。2、检测系统有效的判定，需满足以下所有条件:阳性对照的有所条带需显示为阳性；阴性对照两条IgG线需显示为阳性，余下10条带均需显示为阴性；待检样本两条IgG线需显示为阳性，且所有检测试纸中高浓度IgG条带的强度需高于低浓度IgG条带；否则检测无效，需重新检测。3、检测结果阴阳性的判定，需在检测系统有效的情况下判定:HIV抗体试纸包被的10条抗原分为以下4类:env抗原:gpl60、gpl20、gp41和gp36 (HIV-2 型)；gag 抗原:p24 和 pl7 ；Pol 抗原:p66 和 p51。阴性:所有HIV特异性条带均判定为阴性；HIV-1阳性:至少有2条env条带(gp41和gpl60/gpl20)为阳性，或至少I条env条带和p24条带同时为阳性。HIV-2疑似阳性:gp36条带为阳性。不确定:出现HIV抗体特异带，但不满足阳性的判定标准。本专利和现有的产品或专利比较，有以下不同:(I)选用的抗原部分不同，明确选用10条的HIV抗原，用重组或合成的方法制成，而不是用HIV培养的病毒经裂解制成，降低制造和判定复杂程度，提高了产品的精密性，但不影响判定结果；(2)采用了胶体金显色方法，与酶显色法相比，更为简单、直接、稳定；(3)明显缩短了检测时间，并且操作简单，本试剂在60min内可完成单个检测，30个检测所需时间不超过90min，而其它检测需时约4小时；(4)结果可用免疫层析结果判读记录仪判定，与肉眼判定相比，可以检测出更微弱的条带，并可避免肉眼主观判定时潜在的错误。综合以上特点，本试剂是一种新型的HIV抗体确认试剂，具有操作简便、快速、适合现场检测和经济实用等优点。
附图1为HIV抗体试纸抗原包被示意图具体实施例实施例1:人类免疫缺陷病毒抗体确认试剂的制造1、主要材料1.1HIV 特异性抗原为 HIV-1 的 gpl60、gpl20、p66、p51、gp41、p24、pl7 和 HIV-2的gp36:由北京军事医学科学院提供，基因工程表达的HIV抗原；人IgG和鼠抗人IgG:由深圳菲鹏生物技术有限公司提供；NC膜:美国Millipore公司产品；牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG) 20000、水解蛋白:美国Sigma公司产品；其它试剂为为常规分析纯化学试剂。1.2检测仪器:免疫层析结判读记录仪，型号:NS3001，天津中新科炬生物制药有限公司产品。1.3临床血清:由公司在相关医院获得，HIV-1阳性样本19份，HIV-2阳性样本I份，已由新加坡MP试剂检测确证。阴性样本20份，采自健康人，临床综合检测判定为阴性。2、主要方法2.1HIV抗体试纸的制备:将蛋白用0.0lM的磷酸盐缓冲液稀释成不同浓度，每个蛋白均设3个浓度:高浓度人IgG为0.02,0.05和0.lmg/ml，低浓度人IgG为0.002,0.005和 0.0 lmg/ml, gpl60 为 0.5、1.0、1.5mg/ml, gpl20 为 0.4、0.8、1.2mg/ml, p66 为 0.4、0.8、
1.2mg/ml, p51 为 0.4、0.8、1.2mg/ml, gp41 为 0.5、1.0、1.5mg/ml, p24 为 0.5、1.0、1.5mg/ml，pl7 为 0.25,0.5、1.0mg/ml，gp36 为 0.6、1.2、1.8mg/ml ;NC 膜选用 0.45um 孔径的膜，宽度30mm,长度300mm ;将稀释好的抗体装载在喷膜机上,按lul/cm划线,各线的间隔为3mm,划线完成后，将NC膜置于30%以下的湿度，干燥4小时。干燥完成后用切条机将NC膜横向切成5mm的宽度，在NC膜下部垫上吸水滤纸，吸水滤纸大小为15X30mm,6层吸水滤纸重叠摆放,吸水能力2_2.5ml,然后装入大小合适的塑料卡内，压紧，形成试纸。2.2显色系统的制备:用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0.2M K2CO3将溶液调到pH7.0、pH8.0和pH9.0o然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每IOOml溶液加入0.5mg、lmg、l.5mg鼠抗人IgG，将抗体滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再滴加入到终浓度为0.1 %的PEG2000和I %的BSA进行封闭20min，标记结束后以12000r/m离心，弃上清，沉淀按原体积复溶至原体积1/10的胶体金工作液(硼酸盐缓冲液，PH8.0，含BSA、羊血清、蔗糖、表面活性剂和防腐剂)中。2.3洗涤液的制备:为0.0lM pH7.4的磷酸缓冲液，含0.9% NaCl和0.05 %Tween20,以20倍浓缩形式保存，使用前用纯化水稀释至工作浓度。2.4对照品:用临床血清制成。阳性对照品:选用HIV抗体阳性血清，数份血清合并，经适当稀释，并灭活制成，用MP试剂盒检测,HIV-1的gpl60、gpl20、p66、p51、gp41、p24、pl7以及HIV-2的gp36均为阳性，阴性对照品:用数份健康人血清混合制成，用MP试剂盒验证为HIV抗体阴性。2.5检测方法:对不同浓度包被的HIV抗体试纸和不同pH标记的显色系统进行逐一配对，分别用阳性对照品和阴性对照品进行检测，检测方法如说明书所述，检测结果放入免疫层析结果判读记录仪中，设定参数，读取各反应线的GOD值，确定产品的最佳参数。2.6结果判定方法:如说明书所述方法进行判定。[0051]3、结果检测3.1包被抗原浓度的确定采用不同浓度的蛋白抗原包被后，用pH8.0标记的显色系统测试，阴性对照品测试结果均为阴性，阳性对照品测试结果如下:表1:不同包被蛋白浓度的检测值(GOD)
权利要求1.一种人类免疫缺陷病毒抗体确认试剂，其特征在于:试剂包括HIV抗体试纸、洗涤液、显色系统、阳性对照品、阴性对照品和免疫层析结果判读仪；所述HIV抗体试纸上包被7 10 条蛋白条带，分别是 HIVlgpl60、gpl20、P66、p51、gp41、p24、pl7、HIV2 gp36 和 2 条不同浓度的人IgG条带；胶体金标记的抗人IgG或SPA，或是生物素标记的抗人IgG或SPA、胶体金标记的亲和素显色系统。
2.根据权利要求1所述人类免疫缺陷病毒抗体确认试剂，其特征在于:HIV抗体试纸结构为NC膜、NC膜下方紧密连接的吸样垫和装载NC膜及吸样垫的塑料外壳；NC膜从一端开始，依次包被的10条蛋白条带为高浓度人IgG, HIV gpl60、gpl20、P66、p51、gp41、p24、pl7、HIV2 gp36 和低浓度人 IgG。
3.根据权利要求1所述人类免疫缺陷病毒抗体确认试剂，其特征在于:胶体金直径为20_100nm。
专利摘要一种人类免疫缺陷病毒抗体确认试剂，试剂包括人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)抗体试纸、洗涤液、显色系统、阳性对照品、阴性对照品和免疫层析结果判读仪；HIV抗体反应试纸上包被了10条蛋白条带，分别是HIV1 gp160、gp120、P66、p51、gp41、p24、p17、HIV2 gp36和2条不同浓度的人IgG条带；胶体金标记的抗人IgG或SPA，或是生物素标记的抗人IgG或SPA、胶体金标记的亲和素组成显色系统。检测时将样本加在HIV抗体试纸上，洗涤去除无关蛋白，用显色系统进行显色，用免疫层析结果判读仪或肉眼根据条带显色情况进行结果判定，具有操作简便、快速、适合现场检测和经济实用等优点。
文档编号G01N33/569GK202975018SQ20122017090
公开日2013年6月5日 申请日期2012年4月23日 优先权日2012年4月23日
发明者齐明山, 吴澜 申请人:齐明山, 吴澜
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